Yapımcı Epitel Hasar Analizi Entamoeba histolytica Enfeksiyon

Bu prosedürün genel amacı, erken konak patojen etkileşimlerini ve TBA'nın invazyon potansiyelini değerlendirmektir. Histolytica. İlk önce sağlam trofozoitlerin, trofozoitlerin, toplam lizatların veya salgılanan trofozoitlerin hazırlıklarını yapın. Daha sonra, konakçı epitel hücrelerini farklı trofozoitlerin uygun konsantrasyonları ile inkübe edin.

Şimdi immünofloresan kullanarak, epitel hücrelerinin sıkı bağlantılarıyla etkileşime giren seçilmiş ABA histolytica proteinleri için tedavi edilen epitel kültürlerini analiz edin, ayrıca trans epitelyal elektrik direnci ile paraselüler bariyerdeki değişiklikleri de ölçün. Birlikte ele alındığında sonuçlar, TBA Histolytica tarafından sıkı bağlantı sökme işlemini gösterebilir ve ayrıca seçilen komplekslerin bu sürece katılımını tam olarak belirleyebilir. Bu tekniğin en önemli avantajları, Eva histo faktörlerinin konakçı epiteline translokasyonunu değerlendirmek ve bu eva'nın katılımını göstermek için parazitin farklı ürünlerinin kullanılmasıdır.

Enfeksiyonun çok erken zamanlarında tüm hücrelerin birleşme açılması üzerindeki faktörleri. Bu yöntem, epitel ve diva isli parazit arasındaki moleküler etkileşimleri anlamak gibi ameba ve ameba alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, birlikte inkübasyon için iki hücre zamanının uygun inkübasyon süreleri oranını ve ayrıca farklı ELI ürünlerinin nasıl elde edileceğini ve TER'in nasıl ölçüleceğini bilmedikleri için mücadele edeceklerdir.

Bu tekniğin etkileri amis tedavimize kadar uzanır, çünkü E-H-C-P-A-D-H 112 kompleksi gibi bu vir faktörler yeni tedavi stratejilerinde hedef olarak kullanılabilir. Dört. Bu in vitro yöntem, Anica viral faktörünün ilk hastane bölgesi etkileşimine katılımı hakkında fikir verebilir. Ayrıca inbivo, hamster farelerinde enfeksiyon modelleri, kobaylar ve ayrıca insan bağırsak biyopsileri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Kültür.

10 mililitre tamamlanmış DMEM ortamındaki MDCK hücreleri,% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derece. Otantik olarak, 15 mililitre TYIS 33'te, 37 santigrat derecede ortada, havalandırma amoeba histolytica'nın beşinci trofozoitlerine 10 kez büyür. Trofozoitleri ayırmak için, tüpü bir buzlu su banyosunda beş ila 10 dakika soğutun.

Daha sonra kültürü aseptik olarak konik bir tüpe aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 360 kez G'de santrifüjleyin. Şimdi, süpernatanı dikkatlice boşaltın. Peletlere buz gibi soğuk PBS ekleyin ve santrifüjlemeden sonra hücreleri dağıtmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.

Trofozoitleri bir dakika boyunca sıvı nitrojen içinde dondurun, dört santigrat derecede çözün ve kuvvetlice girdap yapmak için bir hemo sitometre kullanarak trofozoit sayısını belirleyin. Şimdi lizatlarda bulunan proteazları %0.02 beta merkaptoetanol ile aktive edin. Üç mililitre buz gibi soğuk PBS'de altı trofozoit için dokuz kez 10 seyreltin ve hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Şimdi, salgılanan ürünleri toplamak için trofo süspansiyonunu iki saat boyunca 37 santigrat derece inkübatörde beş derece eğimli yatay açıyla yerleştirin, tüpü 10 dakika boyunca 360 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice toplamak için tek kullanımlık ve steril bir şırınga kullanın ve numunelerin peletten trofozoitlerle kontaminasyonunu önleyin. Daha sonra aktarılan hücreleri ortadan kaldırmak için, süpernatanı 0.22 mikronluk bir selüloz asetat zarından geçirin.

Şimdi immünofloresan kültürü için proteazları %0.02 beta merkaptoetanol ile aktive edin. Steril cam kapak üzerindeki MDCK hücreleri, 24 adet çok kuyulu hücre kültürü kabının içine kayar. Hücreleri ters çevrilmiş mikroskopta %100 birleşim noktasına ulaşana kadar inceleyin.

Bir mililitre ılık PBS'de seyreltilmiş farklı trofozoit koşullarını ekleyin. PBS'li ve e histolytica içermeyen MDCK hücrelerinin kontrol koşullarının yanı sıra, farklı trofozoit koşullarına sahip, ancak birincil antikorlarla inkübasyon yayan MDCK hücrelerini dahil edin. Kültür plakasını inkübatöre iki veya 30 dakika yerleştirin.

Daha sonra, bağlanmamış molekülleri veya trofozoitleri ortadan kaldırmak için epitel hücrelerini soğuk PBS ile beş kez yıkayın. Nemli bir odada eksi 20 santigrat derecede dakikalarca bir mililitre% 96 etanol ile hücreleri sabitleyin ve geçirgen. Kapak fişlerini dikkatlice kuyulardan çıkarın.

Filtre kağıdı kullanarak kenardaki fazla sıvıyı çıkarın ve kapak fişini hücreler aşağı bakacak şekilde %0,5 BSA bloke etme solüsyonuna daldırın. Numuneleri oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Bu arada, PBS'de birincil antikorların bir karışımını hazırlayın.

Kapak fişlerini engelleme solüsyonundan kaldırın. Fazla sıvıyı filtre kağıdında kurutun. Hücreleri antikor çözeltisine aktarın ve numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Bağlanmamış molekülleri çıkarmak için hücreleri bir mililitre PBS ile beş kez yıkayın. Şimdi PBS'deki iki floresan ikincil antikorun bir karışımını hazırlayın. Nükleer boyama için numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca ikincil antikorlarda inkübe edin.

Hücreleri karanlıkta oda sıcaklığında 200 mikrolitre 0.05 milimolar dappy çözeltisi ile üç dakika inkübe edin. Şimdi, ko-inkübasyon deneylerinde Zack kesitleri ve XZ düzlemleri aracılığıyla konfokal mikroskopi ile preparatları analiz edin. Proteaz inhibitörleri veya spesifik bir antikor kullanarak, her deneysel koşulu proteaz inhibitörleri veya bir monoklonal antikor kültürü ile dört santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

Üst bölmede steril transwell geçirgen destekler üzerindeki MDCK hücreleri, 100 mikrolitre hücresel süspansiyon yerleştirin ve alt bölmeye 600 mikrolitre takviye edilmiş DMEM ortamı yerleştirin. Hazırlanan transwell filtrelerini ters çevrilmiş bir mikroskopta inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin %100 birleşik olduğunu doğrulayın.

Ortamı her bir transwell'in üst bölmesinden bu ortam karışımının 50 mikrolitresine toplayın ve havuzlayın. 50 mikrolitre trofozoit süspansiyonu veya PBS kontrolü ekleyin. Şimdi karışımları, MDCK hücrelerini içeren her bir transwell'in üst odasına aktarın.

Trans epitelyal elektrik direncini ölçmek için STX iki elektrotunu hemen her bir transkuyuya daldırın. Daha uzun elektrotun alt bölmenin altına temas ettiğinden ve daha kısa elektrotun üst bölmede ortamla kaplandığından emin olun. E histolytica aksan koşulları altında kültürlendi ve geç logaritmik ila erken durağan büyüme fazında hasat edildi.

Burada, sıkı ve aderans bağlantıları ile stabilize edilen epitel hücrelerinin hücre temaslarını görselleştirmek için sıkı bağlantı belirteci sıfır bir kullanıldı. Monoklonal antikor ile immünofloresan, amip türevli kompleksin epitel yüzeyi ile etkileşimini incelemek için kullanıldı: trofozoitlerin, trofozoitlerin, toplam lizatların veya salgılanan ürünlerin epitelyal tek tabakaya uygulanması, kompleksin sıkı bağlantı ile kolokalizasyonu ile sonuçlandı. 30 dakika sonra, hücre sınırlarında süreksiz bir ZO bir boyama ve veziküllerde içselleşme gelişti.

Bu bozulma en çok MDCK hücresinin trofozoitler ve trofozoitlerle olan temaslarında belirgindi. Total lizat konfokal lazer mikroskobu, virülans kompleksinin hücreler arası boşluğa doğru nüfuz ettiğini gösterdi. Bozulmuş ze O bir boyama paraziti teması ile birlikte lokalizasyon, epitel bariyer fonksiyonunu bozdu ve trans epitelyal elektrik direncinde% 90'lık bir düşüşle sonuçlandı.

Trofozoitlerin komplekse karşı bir antikor veya proteaz inhibitörleri ile ön inkübasyonu, alınan TER damlasına karşı koruma ile sonuçlandı. Beraber. Bu veriler, hem proteolitik aktivitenin hem de adeziv özelliklerin, e histolytica invazyonu sırasında bu kompleksin önemli virülans faktörleri olduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, EMBA histolytica'nın erken enfeksiyon zamanlarında sıkı bağlantılar açan faktörlerde viral olduğu mekanizmaları nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bu epitel hasarı analizi, lya ürünleri ve hücre kültürleri hazır olduğunda üç saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü elde ederken, bu prosedürü takiben iyonlar için kesin etkileşim sürelerine bağlı kalmayı unutmamak önemlidir. İmmünopresipitasyon testleri gibi diğer yöntemler, enba, histolitika şiddet faktörleri ve epitel proteinleri gelişimi sonrası olası ilişkiler gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Bu teknik, alside etkileşimleri alanındaki araştırmacıların hamster farelerinde, Kobay ve insan dokularında AMS'nin patogenezini keşfetmelerinin yolunu açtı.