Name: Yapımcı Epitel Hasar Analizi Entamoeba histolytica Enfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Keşfedin Entamoeba histolytica ile epitel hücre etkileşimlerini ve sıkı bağlantıların dağılma mekanizmalarını. Bu yöntem, amebiyaz patogenezinin erken evrelerini anlamak için immunofloresan ve trans epiteliyel elektriksel direnç ölçümü kullanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Federal Bölge Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (ICyTDF, 64/2012'den EO'ya) ve Meksika Bilim ve Teknoloji Konseyi'nden (Conacyt, MS'e 179895) alınan hibelerle desteklenmiştir.

E. 1.. Kuruluş ve Bakım histolytica Kültürler <ol><li> (Diğer tüm kirletici organizmaların tamamen ücretsiz) aksenik biçimde büyümeye Entamoeba histolytica gerginlik hml 1 x 10 5 trofozoitleri: IMSS Teflon liner vidalı kapaklar (ya da bir tek T-1 x 10 6 trofozoitleri ile 18 125 x 16 mm kültür tüpleri klonlamak Şişe, 25) ve 15 ml (veya TYI-S-33 ortamı içinde T-25 bir şişede 50 mi) (TYI suyu% 3 Diamond vitamin karışımı,% 10 ısı ile inaktive edilmiş yetişkin sığır serumu, 0.5 IU / ml penisilin ve 35 ug ile desteklenmiş / ml 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde streptomisin) 19 </li><li> 48-96 saatlik aralıklarla, genellikle, logaritmik büyüme fazının camdan yapılmış bir kültür tüpüne bağlı trophozoit serbest bırakmak için bir buz-su banyosu içinde 5-10 dakika için kültür tüpleri soğutma ile (Şekil 1) hasat trofozoitleri. </li><li> Konik tüp içine kültür transferi ve cel dağıtmak için bunu birkaç kez ters çevirinls. Hemasitometre (Neubauer odası) kullanılarak hücre sayısını belirlemek ve taze TYI-S-33 orta içeren bir kültür tüpünün içine bir inokulum aktarın. <ol><li> Uzun inkübasyon sürelerine (~ 5 gün boyunca ~ 3 x 10 5 hücreleri) ve daha kısa süreler için daha yüksek bir sayı (~ 1 gün ~ 1 x 10 6 hücre) için amip düşük numaraları kullanın. Sayılır uygulanması gibi arzu edilir olsa da inokulum tahmini miktarlar mümkün olduğu kadar, kültürler kuruldu tahmin edilebilir hale gelir. </li><li> Her deney için hücre sayıları optimize trophozoit miktarının titre edilir. </li><li> Yanlışlıkla kirlenme veya tüp kırılması durumunda bir back-up için bir paralel yinelenen kültürünü korumak. </li></ol></li><li> Cap borular sıkı ve yatay açı hareket ettirildiğinde, 5 ° &#39;de 37 ° C&#39;de inkübe. </li><li> Kültürün aşırı büyüme çok lize edilmiş hücreler içeren olabilir çünkü, düzenli olarak görsel inceleme ile Kültürleri kontrol et. </li></ol> MDCK Kültür 2.. Kuruluş ve Bakım &lt;/ P&gt; <ol><li> (Madin Darby Köpek Böbrek) hücre / 0.08 U (insülin, penisilin (100 IU / ml), streptomisin (100 mg / ml) ile takviye edilmiş DMEM ortamı içinde, 10 ml ile tek T-75 şişelerinde I (yüksek direnç) tip MDCK büyümek 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve% 95 havadan oluşan nemli bir atmosferde mi) ve% 10 yeni doğmuş buzağı serumu </li><li> Hücreleri bölmek için, ters bir mikroskop onları kontrol edin. Onlar ~% 85-100 konfluent olduğunda hücreleri bölün. </li><li> , Steril bir başlık ve kültürden ortamı çıkarmak için steril bir cam Pasteur pipet bir vakum aspiratör kullanın. Hücreleri kazıma önlemek için, alt köşesinden ters şişesi ve aspirat medya açmak. </li><li> Bir T-25 şişenin durumunda (5 mi bir T-75 şişe içine önceden ısıtılmış PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1.8 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) 10 ml dağıtın ) ve yavaşça hücreleri yıkamak için şişeye sallayın. Vakum aspirasyon ile PBS çıkarın. Serum tripsin inhibe beri geniş yıkama gereklidir. </li><li> (T-25 balonuna 0.5 ml kullanımı) ve yavaşça tripsin ile hücre katmanı kapsar için şişeyi kaya bir T-75 balon içine,% 0.05 tripsin 1.5 ml dağıtın. </li><li> Inkübatör 5-10 dakika (tam olarak ne zaman tripsin aktivitesi bağlıdır) için inkübe edin. </li><li> Işığa karşı şişeyi tutarak hücre dekolmanı kontrol edin ve hücreleri akan arayın. Hücre dekolmanı (yuvarlak hücreler) de bir mikroskop kullanılarak kontrol edilebilir. Çoğu zaman, hücreler, şişenin yan tarafına hızlı bir yumuşak, tokat ile hızlı serbest bırakın. </li><li> Bir T-75 balonuna (a T-25 balonuna boyunca 5 mi) ile takviye edilmiş DMEM, 15 ml. Yukarı ve aşağı pipetleme 4 veya 5 kez hücreleri yeniden süspanse. </li><li> Hücrelerini yaymak için, taze katkılı DMEM ile hücre süspansiyonu 01:05 sulandırmak. Hücreler sayısı da bir hemositometre kullanılarak bu noktada tespit edilebilir ancak bazı işlemler için özel biçimleri içine hücrelerin bölünmesi durumunda bu genellikle gereklidir. </li></ol> Trophozoite Toplam Lizatlarmm 3. Hazırlanması <ol><li> Cu dan trophozoit AyırBir buz-su banyosu içinde 5-10 dakika için soğutma tüpü ile LTURE boruları. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 360 x g&#39;de konik bir tüp ve santrifüj içine kültür aseptik olarak transfer Dikkatle, dekantasyon ile süpernatantı atmak topağa buz soğukluğunda PBS ekleyin, 10 dakika boyunca 360 x g hızında tekrar santrifüj hücreleri ve dağıtmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. TYI-S-33 orta tüm izlerini kaldırmak için iki kez bu adımı tekrarlayın. </li><li> Hemasitometre kullanarak trofozoitleri numarasını belirler. </li><li> Lyse donma-çözülme döngüleri trophozoit. 1 dakika boyunca sıvı azot içinde, buz gibi soğuk PBS içinde seyreltilmiş trophozoit ölçülü bir inokulum (600,000 trofozoitleri / ml) Kopma-dondurma. Kuvvetli bir şekilde 4 ° C ve vorteks de örnek etkisiz hale getirmek. Hücre parçalanmasını tamamlamak için donma ve çözülme 3 kez tekrarlayın. </li><li> % 0.02 β-mersaptoetanol ihtiva eden lizatları içinde mevcut proteazlar etkinleştirir. </li></ol> Trophozoite Salgılanmış Ürünler 4. Hazırlanması <ol><li> Adımları 3,1-3,2 gerçekleştirin. </li><li> BelirlemekHemasitometre kullanarak ve tripan mavi dışlama testi 20 uygulayarak bu noktada hücre sayısı ve canlılığı: <ol><li> 50 ml konik tüp içine 9 x 10 6 3 ml buz gibi soğuk PBS trophozoit ve transfer hücreleri seyreltin. Bu süspansiyonun 10 ul alın ve% 0.4 tripan mavi stok solüsyonu pH değeri 7.2 olan 1 ul ekle. </li><li> Düşük büyütmede hücreleri saymak için bir Neubauer odasını kullanın. </li><li> Tüm hücre sayımı ve mavi hücrelerin boya içine alındı ​​ve bu yüzden ölü kabul edilmelidir, çünkü mavi hücrelerin sayısını ayırın. </li><li> Toplam hücre sayısına göre canlı hücre sayısına bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile canlı hücre yüzdesini hesaplayın. </li></ol></li><li> Yatay açıyı hareket ettirildiğinde, 5 ° &#39;de 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübatör içine trophozoite süspansiyonu içeren konik tüp aktarın. </li><li> 10 dakika için 360 xg salgılanan ürünleri, santrifüj tüpleri toplamak için. Bir tek ve steril şırınga kullanmak ve dikkatle SU toplamakpernatant, topaklardan trophozoit ile örnekleri kirlenmesini önlemek. 0.22 mikron selüloz asetat membrandan süpernatan geçirilerek herhangi bir transfer hücreleri ortadan kaldırır. % 0.02 β-merkaptoetanol ile proteazlar etkinleştirir. </li><li> Ölü hücrelerden salınan moleküllerin farazi istenmeyen kontaminasyonu silmek için, hücre canlılığı tripan mavi dışlama testi uygulamalısınız. Adım 4.2 &#39;de elde edilen ve uygun bir hücre toplam sayısı ile aynı olmalıdır. Bu durumda değilse, toplanan süpernatan ihtiva edebilir salgılanan proteinleri, sadece ve atılmalıdır. </li></ol> Trophozoit, trophozoite lizatları veya Salgılanmış Ürünleri MDCK Hücreler 5. Etkileşim <ol><li> Canlı trophozoit (1:1 lik bir MDCK-to-amip oranında) ile birleşik MDCK hücre mono tabakaları inkübe, trophozoite lizatları (bir MDCK-to-amip 1:2 oranı) veya salgılanan ürünleri (1 arasında bir MDCK-to-amip oranı : 10) 2 ve 30 dakika boyunca (Şekil 2A) boyunca 37 ° C&#39;de. </li><li> İlişkisiz molekülleri ya trophozoit ortadan kaldırmak için buz gibi soğuk PBS ile bir epitel hücreler beş kez yıkayın. </li></ol> Immünofloresans için 6 Numunelerin. Hazırlanması <ol><li> 24-çok-yuvalı hücre kültürü çanağı içine yerleştirilmiş steril cam lamelleri Culture MDCK hücreleri. Bu izdiham 100% ulaşana kadar ters mikroskop hücreleri kontrol edin. Daha sonra, taze desteklenmiş DMEM aracı maddesi 1 ml orta yerine ve daha 24 saat boyunca bir 37 ° C inkübatöre plaka aktarın. </li><li> Bir vakum aspiratör ve steril bir cam Pasteur pipet kullanılarak Ortamı çıkarın ve her bir oyuğa ılık PBS 1 ml. PBS çıkarın ve taze PBS ile yıkama tekrarlayın. Cam pipet ile kuyunun dibinden hücreleri kazımak için özen gösterin. </li><li> Canlı trofozoitleri (T), trophozoite total lizatları (TL) ve salgılanan ürünler (SP): Sıcak 1 ml PBS içinde seyreltilmiş trophozoit arasında farklı koşullar ekleyin. <ol><li> 2 ya da 30 dakika boyunca inkübatör kültür plakası koyun. </li><li> MDCK hücreleri E. ile inkübe olmamalıdır biri seçildi süresi 0 dakika: iki kontrol koşulları hazırlamak histolytica ancak sıcak PBS ile 1 ml; ve bu durumda ikincil antikorlar kontrolü gibi başka bir durum, 2 ya da 30 dakika için T, TL veya SP MDCK inkübe ve primer antikorlar ile inkübasyon sayın. </li></ol></li><li> İlişkisiz molekülleri ya trophozoit yok etmek için soğuk PBS ile epitel hücreler beş kez yıkayın. </li><li> Düzeltme ve -20 ° C&#39;de 30 dakika boyunca% 96 etanol içinde 1 ml hücreleri permeabilize </li><li> Etanolü ortadan kaldırmak için, oda sıcaklığında, 1 ml PBS ile üç hızlı yıkama yapar. </li><li> Numunelerin kurutma önlemek için bir nemli odada, aşağıdaki adımları: <ol><li> Kapalı ve örnekleri güvenle yerleştirilebilir hangi bir ıslak kağıt havlu ile dolu olabilir mevcut herhangi bir düz kutusunu kullanın. Örneğin, boş bir pipet ucu kutusu de bu amaca hizmet eder. </li><li> Bölmenin içinde, eşit bir Parafilm tabakası ve bir pipet bloğun 25 ul koyunher bir lamel için çözeltisi (% 0.5 BSA) ing. </li><li> Ince forseps ile kuyulardan lamelleri almak, dikkatli bir filtre kağıdı ile kenarından aşırı sıvı kaldırmak ve hücreler engelleme çözüm bakacak engelleme solüsyonu (% 0.5 BSA) içeren damla içine lamel koydu. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> PBS birincil antikor bir karışım hazırlayın: IgM, fare anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112, 1:10 seyreltme) ve tavşan anti-IgG ZO-1 (pα-ZO-1; 1:100 seyreltme). </li><li> Nemli kutu ve pipetle her bir lamel için antikorlar çözeltisi 25 ul Parafilm yeni bir levha yerleştirin. </li><li> , Bloke çözeltiden lamelleri kaldırın bir filtre kağıdı kullanılarak kenarlarında herhangi bir aşırı sıvı kuru ve hücreler, antikor çözeltisi gelecek şekilde damlalar içine yerleştirin. 4 ° C de bir gece inkübe edin </li><li> (Üstte hücre tarafı) 24 çukurlu bir kuyuya her lamel koyun ve PBS 1 ml ekleyin. <ol><li&gt; Bağlanmamış molekülleri uzaklaştırmak için 1 ml PBS ile beş kez yıkayın. </li></ol></li><li> FITC bağlanmış keçi anti-fare IgM (1:100 dilüsyon) ve TRITC (1:50 seyreltme) bağlanmış keçi anti-tavşan IgG: PBS içinde floresan ikincil antikor bir karışım hazırlayın. </li><li> Nemli kutusu ve pipet her lamel için ikincil antikorlar çözeltisi 25 ul içine Parafilm taze bir yaprak yerleştirin. </li><li> 6.10 olarak örnekleri aktarın ve floresan boyaların ağartılmasını önlemek için karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. 6.11.1 adımı tekrarlayın. </li><li> Nükleer boyama için, oda sıcaklığında, 0.05 mM DAPI çözeltisinin 200 ul ile 3 dakika boyunca inkübe edilir ve ışıktan korur. 6.11.1 adımı tekrarlayın. </li><li> , Floresan boyalar tasarruf Vecta Shield cam mikroskop slaytlar üzerinde montaj çözümü antifade 5 ul içine lamelleri (hücreler aşağı bakacak şekilde) yerleştirin. Örnek kurumayı önlemek için oje kullanarak kapak fişleri Seal. </li><li> Uzun süreli depolama için, slaytları tutmak-20 ° C&#39;de mikroskop slayt kutusu </li><li> Z-yığın bölümleri ve xz-düzlemi (Şekil 2A) ile konfokal mikroskopi tarafından hazırlıkları analiz. </li></ol> Proteaz inhibitörleri ya da spesifik bir antikor ile trophozoit 7. Kuluçka <ol><li> Tekrarlayın 3,1-3,2 adımları. Her bir deney için, 4 ° C&#39;de 20 dakika süreyle proteaz (komple 1 mM ve 40 ug / ml E-64) inhibitörleri veya EhCPADH112 (mαEhCPADH112) karşı 30 ug monoklonal antikor 21 (50 ul PBS içinde yeniden süspansiyon haline getirildi) 1 x 10 5 trophozoit inkübe ° C (Şekil 2B). Adım 8.5 &#39;de tarif edildiği gibi ko-inkubasyon deneyleri için, bu preparatlar kullanın. </li></ol> 8. Transepitelyal Elektrik Direnci Ölçümü (TER) <ol><li> Steril transwell geçirgen desteklerin (0.4 mikron gözenek boyutu) üzerine Kültür MDCK hücreleri. Üst bölme içinde, 100 hücre süspansiyonu ul ve alt bölmeye yerleştirmektakviye edilmiş DMEM ortamı içinde 600 ul koyun. <ol><li> Periyodik orta seviyesini kontrol edin. Gerektiği gibi taze ortam ilave edilebilir. </li><li> Bu izdiham 100% ulaşana kadar ters bir mikroskop hücreleri kontrol edin. 2-3 günde bir orta değiştirin. </li><li> Hücre eki (gerekirse) geliştirmek için, hücre süspansiyonuna eklenmeden önce DMEM içinde 37 ° C&#39;de gece boyunca dengeye transwell filtreler. </li></ol></li><li> Etanol içine daldırma ile kaputu STX2 elektrotlar sterilize edin ve daha sonra steril PBS içinde UV ışık altında 15 dakika her biri için. Bir EVOM epitel voltohmmeter elektrotlar bağlayın ve direnç modunu seçin. </li><li> Her transwell üst bölmesinden orta toplayın ve bunları havuzu. Bu karışım ortam 50 ul alın ve trofozoitleri süspansiyonu, 50 ul (PBS içinde 1 x 10 5 trofozoitleri) ile ya da sadece PBS (kontrol) ile birleştirin. Her transwell için de benzer bir karışımı kullanın. </li><li> Her bir Transwell containin üst haznesine karışımları eklemeg MDCK hücreleri. Deney koşulları, trophozoit (kontrol) olmadan trophozoit ya da proteaz inhibitörleri ya da mαEhCPADH112 ile önceden inkübe trophozoit ile ortak-kültür MDCK hücreleri içerir. Filtreleri tarafından sağlanan direnci ortadan kaldırmak için, sadece ortam maddesi ile inkübe transwells kullanın. Her deneysel koşul kullanımı, en az üç transwells için. </li><li> Hemen sonra, transwell her içine STX2 elektrotlar daldırılarak TER ölçer. <ol><li> Uzun elektrot, alt bölmenin alt dokunur ve kısa elektrot (Şekil 2B, bakınız), üst bölmeye ortamı ile kaplı olduğunu emin olun. </li><li> Her zaman dik Elektrotları tutmak için emin olun. Bu önemli ölçüde, tekrarlanabilirlik artıracaktır. Bu verilerin değişimine yol açacak gibi hareketli veya ölçümler sırasında elektrot eğerek kaçının. </li></ol></li><li> Bu ölçüm, ilk TER değeri dikkate alınmalıdır. Ardından, aşağıdaki sırasında TER izlemek30 dakika. </li><li> Nihai TER değerini hesaplamak için, sadece filtrelerin TER değeri çıkarın. Farklı deneylerden elde edilen sonuçları karşılaştırmak için% 100 (Şekil 2B) gibi, bu alan, başlangıç ​​değerleri için her bir veri noktası normalize. </li></ol>

<ol><li>Faust, D. M., Guillen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+virulence+factors+in+Entamoeba+histolytica%2C+the+agent+of+human+amoebiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis.</a> Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).</li>
<li>Stauffer, W., Ravdin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica: an update.</a> Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).</li>
<li>Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+and+defense+mechanisms+in+the+development+of+amoebic+liver+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).</li>
<li>Garcia-Rivera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica+%3A+a+novel+cysteine+protease+and+an+adhesin+form+the+112+kDa+surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein.</a> Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).</li>
<li>Leippe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebapores%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol+Today%22%5BJournal%5D)">Amoebapores.</a> Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).</li>
<li>Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+weapons%3A+the+three-dimensional+structure+of+amoebapore%5BTitle%5D)+AND+%22A.+Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore.</a> A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).</li>
<li>Ocadiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EhCP112+is+an+Entamoeba+histolytica+secreted+cysteine+protease+that+may+be+involved+in+the+parasite-virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence.</a> Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).</li>
<li>Sajid, M., McKerrow, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+proteases+of+parasitic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cysteine proteases of parasitic organisms.</a> Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).</li>
<li>Betanzos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EhCPADH112+complex+of+Entamoeba+histolytica+interacts+with+tight+junction+proteins+occludin+and+claudin-1+to+produce+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Lauwaet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+inhibitors+TPCK+and+TLCK+prevent+Entamoeba+histolytica+induced+disturbance+of+tight+junctions+and+microvilli+in+enteric+cell+layers+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro.</a> Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).</li>
<li>Leroy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact-dependent+transfer+of+the+galactose-specific+lectin+of+Entamoeba+histolytica+to+the+lateral+surface+of+enterocytes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture.</a> Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).</li>
<li>Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica+disturbs+the+tight+junction+complex+in+human+enteric+T84+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers.</a> FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).</li>
<li>Leroy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disturbance+of+tight+junctions+by+Entamoeba+histolytica%3A+resistant+vertebrate+cell+types+and+incompetent+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites.</a> Arch Med Res. 31, (2000).</li>
<li>Lauwaet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica+trophozoites+transfer+lipophosphopeptidoglycans+to+enteric+cell+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers.</a> Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).</li>
<li>Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entamoeba+histolytica+Exacerbates+Epithelial+Tight+Junction+Permeability+and+Proinflammatory+Responses+in+Muc2%28-%2F-%29+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice.</a> Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).</li>
<li>Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+produced+by+Entamoeba+histolytica+signals+via+EP4+receptor+and+alters+claudin-4+to+increase+ion+permeability+of+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions.</a> Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).</li>
<li>Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+lectin+and+receptor+mediate+the+adhesion+of+E.+histolytica+to+epithelial+cells.+Relation+of+adhesion+to+the+virulence+of+the+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Invest+Med+%28Mex%29%22%5BJournal%5D)">Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains.</a> Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).</li>
<li>Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+medium+for+the+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+and+other+Entamoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+R+Soc+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba.</a> Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).</li>
<li>Arroyo, R., Orozco, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+identification+of+an+Entamoeba+histolytica+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin.</a> Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).</li>
<li>Diamond, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+cultivation+of+Entamoeba+hitolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica.</a> Science. 134, 336-337 (1961).</li>
<li>Diamond, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+of+axenic+cultivation+of+Entamoeba+histolytica+Schaudinn%2C+1903+and+E.+histolytica-like+amebae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae.</a> J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).</li>
<li>Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDCK+variety+pack%3A+choosing+the+right+strain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The MDCK variety pack: choosing the right strain.</a> BMC Cell Biol. 12, (2011).</li>
<li>Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+intestinal+amebiasis%3A+from+molecules+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease.</a> Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).</li>
<li>Martinez-Palomo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+bases+of+the+cytolytic+mechanisms+of+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Protozool%22%5BJournal%5D)">Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica.</a> J Protozool. 32, 166-175 (1985).</li>
<li>Martinez-Lopez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EhADH112+recombinant+polypeptide+inhibits+cell+destruction+and+liver+abscess+formation+by+Entamoeba+histolytica+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites.</a> Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).</li>
<li>Ocadiz-Ruiz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+silencing+of+the+Ehcp112+gene+on+the+in+vitro+virulence+of+Entamoeba+histolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Parasit+Vectors%22%5BJournal%5D)">Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica.</a> Parasit Vectors. 6, 248 (2013).</li>
<li>Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+imaging+techniques+to+studies+of+epithelial+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions.</a> Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

E. tarafından epitel enfeksiyon sırasında in vitro konukçu-patojen etkileşimlerine incelemek için histolytica, epitel hücreleri ve trophozoit iki köklü kültürleri ile çalışmak için çok önemlidir. Örneğin, daha önce, E. histolytica kültürler genellikle bakteriler veya tripanosomatidlerde 22,23 belirli türleri ile birlikte kurulmuştur. E: Bununla birlikte, ko-kültivasyon konak hücreleri üzerinde gözlenen etkileri tümden ameobas isnat edilemedi ama yerine ko-kültür hü...

Entamoeba histolytica iltihabı ve ishal. E. neden insan amebiazisli, bir bağırsak enfeksiyonu sorumlu tek bir hücre protozoandır histolytica yıllık 50 milyon kişiye kadar bozar, fakat enfekte kişilerin sadece yaklaşık% 10 amebiazisli 1 ile ilişkili belirtiler gelişir. Enfeksiyon E. içeren kontamine gıda veya su yenmesi üzerine oluşur histolytica kistleri. Bağırsak, kolon kistler müsin uygun ve 2 çoğalan canlı trophozoit üretir. Trofozoitleri genellikle dışkı yoluyla atılır kistler oluşturur. Diğer durumlarda ve henüz bilinmeyen nedenlerle, trofozoitleri bağırsak epitel tabakası kırmak ve alttaki dokulara işgal. En kötü durumda, onlar kan dolaşımına girer ve bu tür karaciğer 3 gibi diğer organları da etkileyebilir. Epitelyal bariyer kırma katıldığı epitel hücreleri korumak transmembranal yapıların bozulma gerektirir. Epitel hücreiletişim sıkı (tj) &#39;den oluşan apikal junctional kompleksi tarafından oluşturulur ve bağlantı yerleri (AJ) adherens ve 4 dezmozomlar edilir. En apikal kavşaklar TJ, ve bu nedenle, E affronted ilk engel vardır konak işgali sırasında histolytica ve diğer bazı patojenler. TJ örneğin, komşu hücre reseptörleri ile homo-ya da heterofilik etkileşimleri meşgul klaudin, occludin ve kavşak yapışma molekülleri (JAM) halinde transmembranal yapışma reseptörlerinin oluşmaktadır. Bunlar hücre içi epitel daha fazla mekanik güç sağlamak için aktin hücre iskeletinin yapışma alıcıları (ZO) aile zonula okludinler iskele molekülleri tarafından bağlanmıştır. TJ fazla su ve madde sızıntısını önlemek, bağırsak lümeninden bağırsak doku sızdırmazlık sorumludur. TJ parazit tarafından bozulur sonra Böylece, dokular işgal edilir. E. (i) Targ için amip yapışmasıyla dahil olanlar: histolytica gibi çeşitli moleküller salgılarve hücreler 5; Ekzositoz ile konakçı hücrelerin öldürülmesi katılan (ii) zar aktif faktörleri, örneğin adlandırılır iyon kanalı oluşturucu peptidler 6,7 amebaporlar; ve (iii) hücre dışı matriks proteinlerini yıkıma uğratma ve doku parçalanması aracılık proteinazlar, 5,8,9. Birlikte EhCPADH112 kompleks meydana sistein proteaz EhCP112 ve adezyon molekülü EhADH112 iki E. vardır histolytica TJ 10 sökme de önemli bir rol oynamaktadır proteinleri virülansa. Canlı trofozoitleri, toplam lizatları ve salgılanan ürünler epitel bariyerin TJ karmaşık ve işlev bozuklukları moleküler değişikliklere sebep olur. Bu çalışmada, EhCP112 EhADH112 ve bu nedenle örneğin, kolaylaştırıcı, occludin ve içselleştirme ve hücre proteinleri degradasyonuna götüren Claudin-1 proteinleri ile etkileşim olduğu gösterilmiştir paraselüler yolu aracılığıyla histolytica giriş. Bizim veri ve bu of diğer gruplar 11-17 şiddetle parazit istilasına izin özgü konak-patojen etkileşimleri gerekliliğini göstermektedir. Bu etkileşimlerin moleküler temelini çözülüp Amebiazis patogenezi daha iyi anlaşılması için büyük önem taşımaktadır. Artan paraselüler geçirgenliği ile karakterize trophozoit ile TJ selektif bozukluğu, transepitelyal, elektrik direncinde bir azalma (TER) ile ölçülebilir. Ev sahibi epitel doğru parazit proteinleri aktarım immünofloresan boyama ve konfokal lazer mikroskopisi, ayrıca olası doğrudan etkileşimleri gösteren epiteliyal birleşim yeri belirteçleri ile amoeba hastalık oluşturma faktörlerinin eş-lokalizasyonu ortaya bir yöntem ile belirlenebilir. Bu yazıda, epitel hücreleri ve trofozoitleri, ekili hasat ve konak-patojen etkileşimleri ve sonuçlarını incelemek için manipüle nasıl ayrıntılı olarak açıklar.

<table><tbody><tr><td>Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Klon A&nbsp;</td><td>IMSS Hastanesi, Meksika</td><td></td><td>Virülan trofozoitler olmadan/sayısı 18&nbsp; </td></tr><tr><td>TYI et suyu</td><td>Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich</td><td>211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879</td><td>%3,45 BBL Biyosat pepton 58 mM glikoz 39 mM NaCl 5 mM KH<alt>2</alt>P<O>4</alt> 6,5 mM K2HPO4 16,3 mM askorbik asit 8,1 mM L-sistein 0.1 mM ferrik amonyum sitrat, pH 6.8 19 </td></tr> <tr><td>sığır serumu yetişkin</td><td>Microlab, Labs., Mex'i ayarlayın.</td><td>SU146</td><td>%10'da kullanın ve 56 dereceye kadar inaktive edin; 30 dakika için C</td></tr><tr><td>Elmas&nbsp; vitamin&nbsp; karışımı- Tween 80</td><td>İn vitro</td><td>SR-07</td> %3 <td></td></tr><tr><td>Penisilin&nbsp'de kullanın;</td><td>Göl kenarı,&nbsp; M&eacute;x.</td><td>34564SSA IV</td><td>0.5 IU/ml</td></tr><tr><td>Streptomisin&nbsp;</td><td>Göl kenarı,&nbsp; M&eacute;x.</td><td>75757SSA IV</td><td>35 ve mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Pyrex 15 ml PTFE kaplı fenolik kapaklı vidalı kapaklı kültür tüpleri</td><td>Corning-Pyrex</td><td>9826-16X</td><td>16 x 125 mm, kapasite 15 ml ve sıcaklığın etkilerine dayanıklı özel formülden imal edilmiş</td></tr><tr><td>kapaklar Hücre kültürü plakaları, 6 Kuyulu</td><td>Corning-Costar</td><td>3516</td><td>Steril plakalar, kuyu çapı 34,8 mm ve büyüme alanı 9,5 cm2.&nbsp; Kapaktaki halkalar çapraz kontaminasyonu önler</td></tr><tr><td>25 cm2 hücre kültürü şişesi</td><td>Corning-Costar</td><td>430168</td><td>Eğimli boyun şişeleri</td></tr><tr><td>MDCK (Madin Darby köpek böbreği) tip I</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CCL34</td><td>60th ve 90th geçişi arasında büyüyen böbrek epitel hücreleri</td></tr><tr><td>DMEM ortamı&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>12800-017</td><td>Dulbecco'nun yüksek glikozlu Modifiye Eagle Medium'u.</td></tr><tr><td>Yenidoğan Buzağı Serumu</td><td>İn vitro</td><td>S-02</td><td>%10 oranında kullanın. &nbsp;</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin karışımı&nbsp;</td><td>İn vitro&nbsp;</td><td>A-01</td><td>Stok çözeltisi 10.000 U/&mikro; g/ml</td></tr><tr><td>İnsülin&nbsp; &nbsp;</td><td>AMSA</td><td>398MJ94SSA IV</td><td>Stok çözeltisi 100 IU / ml</td></tr><tr><td>Tripsin çözeltisi&nbsp;</td><td>İn vitro</td><td>EN-005</td><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen% 0.05 enzim çözeltisi</td></tr><tr><td>75 cm2 hücre kültürü şişesi</td><td>Corning-Costar</td><td>430720</td><td>TYI-S-33 ortamında trofozoit kültürü için eğimli boyun şişeleri</td></tr><tr><td>Transwell geçirgen destekler</td><td>Corning-Costar</td><td>3470</td><td>0.4 &; M polyester membran, 24 oyuklu plakada 6,5 mm kesici uç, büyüme alanı 0,3 cm2</sup</td></tr><tr><td>>24 oyuklu hücre kültürü kabı&nbsp; &nbsp;</td><td>Corning-Costar</td><td>3524</td><td>Berrak polistiren, optimal hücre bağlanması için işlenmiş, gama radyasyonu ile sterilize edilmiş ve sertifikalı pirojenik olmayan</td></tr><tr><td>Komple Mini</td><td>Roche</td><td>11836 153 001</td><td>Proteaz inhibitör kokteyli, geniş bir serin, sistein ve metalo-proteaz spektrumunu inhibe eder. Son konsantrasyon 1 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trans-epoksisüksinil-L-lösilamidó (4-guanidino) bütan (E-64)</td> <td>SIGMA-Aldrich</td><td>E3132</td><td>Sistein proteaz inhibitörü, son konsantrasyon 40 ve mikro; g/ml</td></tr><tr><td>P & alfa; ZO-1&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td>IgG tavşan poliklonal&nbsp; antikor&nbsp; karşı&nbsp; ZO-1 insan proteini m&alfa'nın orta bölgesinde sentetik bir peptit</td></tr><tr><td>; EhCPADH112 EhCPADH112</td><td></td><td><'nin C-terminalinde bulunan 444-601 epitopuna karşı&IgM fare monoklonal antikoru&nbsp; Olmayan ev yapımı antikor>21,27</td><td></td></tr><tr><td>FITC-keçi anti-fare IgM</td><td>Zymed</td><td>62-6811</td><td>Floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli keçi anti-fare ikincil&nbsp; antikor</td></tr><tr><td>TRITC-keçi anti-tavşan IgG (H + L)</td> <td>Zymed</td><td>816114</td><td>Tetrametil-rodamin izotiyosiyanat (TRITC) etiketli&nbsp; keçi anti-tavşan IgG & nbsp; ikincil antikor.</td></tr><tr><td>STX2</td><td>Elektrot Dünyası Hassas Alet&nbsp;</td><td>102711</td><td>4 mm genişliğinde ve 1 mm kalınlığında sabit bir çift çift elektrottan oluşur. Elektrot çiftinin her bir çubuğu, voltajı ölçmek için bir gümüş/gümüş klorür peleti ve akımı geçirmek için bir gümüş elektrot içerir. EVOM</td></tr><tr><td>EVOM epitelyal voltohmmetre</td><td>World Precision Instrument ile kullanım için&nbsp;</td><td>12111</td><td>Direnç modunda kullanın ve TER ölçümleri sırasında fişten çekin</td></tr><tr><td>Neubauer odası</td><td>MEARIENFELD</td><td>610610</td><td>Hemositometre ve nbsp;</td></tr><tr><td>Leica TCS_SP5_MO</td><td>Leica</td><td>Microsystems</td><td>CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN yazılımı ile Leica Numarasız/Numarasız Lazer Konfokal Mikroskopi</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td><td>H-1000</td><td>Floresan</td></tr><tr><td>4 ', 6-diamino-2-fenilindol (Dapi)</td> <td>için</td> montaj ortamı <td>SIGMA D-9542</td><td>0.05 mM nihai konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td> <td>ABD Biyolojik</td><td>A-1310</td>% <td>0.5&nbsp; bloke edici çözelti için son konsantrasyon</td></tr></tbody></table>

yapımcı epitel hasar analizi<em&gt; entamoeba histolytica</em&gt; enfeksiyon

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica insan amebiazisli etkeni, tropikal ülkelerde ishal ve karaciğer apsesi önemli bir nedenidir. Enfeksiyon intestinal epitel hücreleri ile patojenin etkileşimle başlatılır. Bu etkileşim, örneğin sıkı bir birleşme (TJ) arası yapılar olarak bozulmasına yol açar. TJ bağırsak lümeninden ana doku ayırmak için epitel tabakasının sızdırmazlık sağlar. Son çalışmalar parazit protein EhCPADH112 tarafından TJ bozulma E. için bir ön koşul olduğunu kanıt epitel bariyeri disfonksiyonu eşlik histolytica işgali. Bu nedenle, E sırasında TJ sökme katılan moleküler mekanizmaların analizi histolytica işgali Amebiazis patogenezinde anlayışımızı geliştirmek için büyük önem taşımaktadır. Bu makale ilk konak-patojen etkileşimleri değerlendirme ve parazit işgali potansiyelini sağlayan kolay bir model sunuyor. Analiz edilecek parametreler t katmakransepithelial elektriksel direnç, epitel yüzey reseptörleri, ifade değişiklikleri ve epitel kavşak işaretleri ve epitel hücrelerin içinde parazit moleküllerin localisation ile EhCPADH112 etkileşimi.

Başarılı bir E için histolytica kültürü, iki önemli şartlar yerine getirilmelidir: logaritmik fazda aksenik koşulları ve hasat büyüme. E: Daha önce, kültürler histolytica kolayca bakteri veya tripanosomatidlerde 22 belirli türler ile birlikte kurulmuştur. Ancak, günümüzde bu metabolize bakteri, mantar, protozoa veya metazoan hücre serbest bir ortamda amip belirsiz bir subcultivation anlamı, bu parazitin aksenik ekimi olması yaygındır. Buna ek olarak, büyüme erken durağan fa...

Entamoeba histolytica insan enfeksiyon amebiazisli, tropikal ülkelerde ishal önemli bir nedeni yol açar. Enfeksiyon, hücre-hücre kontaktların açılmasına ve dolayısıyla ishal, bazen karaciğer enfeksiyonu tarafından takip edilen tahrik, intestinal epitel hücreleri ile patojenik etkileşimleri ile başlatılır. Bu makale Amebiazis patogenezinde anlayışımızı geliştirmek için erken konak-patojen değerlendirmek için bir model sunar.

Yapımcı Epitel Hasar Analizi<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Enfeksiyon

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Bu prosedürün genel amacı, erken konakçı patojen etkileşimlerini ve TBA.Histolytica'nın invazyon potansiyelini değerlendirmektir. Öncelikle, sağlam trofozoitlerin, trofozoitlerin, toplam lizatların veya salgılanan trofozoitlerin hazırlıklarını yapın. Ardından, konakçı epitel hücrelerini farklı trofozoitlerin uygun konsantrasyonları ile inkübe edin.Şimdi, AM immünofloresan yöntemi kullanarak, tedavi edilen epitelyal kültürleri, epitelyal hücrelerin sıkı bağlantılarıyla etkileşime giren seçili ABA histolytica proteinleri açısından analiz edin; ayrıca trans-epitelyal elektriksel direnç ile parasellüler bariyerdeki değişimleri ölçün. Birlikte değerlendirildiğinde, sonuçlar TBA Histolytica tarafından sıkı bağlantıların dağıtıldığını gösterebilir ve ayrıca seçili komplekslerin bu süreçteki katılımını belirleyebilir. Bu tekniğin temel avantajları, Eva histo faktörlerinin konak epitelyumuna translokasyonunu değerlendirmek ve bu evaların katılımını kanıtlamak için parazitin farklı ürünlerinin kullanılmasıdır.Enfeksiyonun çok erken evrelerinde, tüm hücrelerin eklem yerlerinin açılmasındaki etkileri. Bu yöntem, epitelyum ve diva isli parazit arasındaki moleküler etkileşimlerin anlaşılması gib

analysis-epithelial-damage-produced-entamoeba-histolytica

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, inflamatuar bir bağırsak hastalığı olan DSS'nin neden olduğu kolitin bir fare modelinde kolon hasarını değerlendirmek için hematoksilen ve eozin (H&amp;E) boyama yöntemini göstermektedir. Kolonu DSS ile tedavi edilen bir fareden izole ettikten ve dokunun bölümlerini elde ettikten sonra, bölümlerin H&amp;E boyaması, inflamasyonun aracılı doku hasarını tanımlamaya yardımcı olur.

DSS'nin Neden Olduğu Kolitte Kolon Hasarını Değerlendirmek için Hematoksilen ve Eozin Boyama

Anti-inflamatuar etkilerin doğru değerlendirilmesi, inflamatuar barsak hastalığının tedavisi için potansiyel yeni ilaçların değerlendirilmesi için son derece önemlidir. Dijital holografik mikroskopi, murin ve insan kolon dokusu örneklerinde inflamasyonun değerlendirilmesinin yanı sıra in vitro epitelyal yara iyileşmesinin otomatik multimodal değerlendirmesini sağlar.

Dijital Holografik Mikroskop ile multimodal Kantitatif Faz Görüntüleme Doğru Bağırsak İltihabı ve Epitel Yara Şifa Değerlendirdi

enflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD) Mevcut tedaviler, hastalığın semptomlarını hafifletmek amaçlamaktadır, ancak ciddi yan etkilere neden olabilir. Böylece, alternatif stratejiler hayvan kolit modellerinde araştırılmaktadır. Burada, klinik IBD işaretleri diyet takviyeleri yararlı etkileri böyle bir kolit modelinde analiz edilmektedir açıklar.

Deneysel Kolit sırasında Bağırsak epitel Bariyer Fonksiyonları Üzerine Ek Beslenme Faydalı Etkileri Analizi

Burada, kalsiyum (Ca2 +) yanıt Shigellatarafından enfekte HeLa hücreleri tarafından elde edildi görselleştirmek için protokolleri mevcut. Bakteriyel enfeksiyon parametrelerini optimize ve Ca2 + floresan problar ile görüntüleme, enfeksiyon kinetik büyük bir aralığı içinde bakteriler tarafından indüklenen atipik küresel ve yerel Ca2 + sinyalleri karakterize edilmektedir.

Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

İntravital mikroskopiden yararlanan burada sunulan yöntem, canlı hayvanlarda bağırsak epitel hücresi dökülmesinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesidir. Bu nedenle anestezili farelerin topikal lekeli bağırsak mukozası (acriflavine ve rhodamineB-dextran) konfokal mikroskopi kullanılarak tek hücreçözünürlüğe kadar görüntülenir.

İntravital Mikroskopi Tabanlı Bir Yaklaşım Bağırsak Geçirgenliği ve Epitel Hücre Dökülme Performansını Değerlendirmek için

Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Mevcut protokol, in vitro epitel hücre dizileri kullanılarak Shigella aderansı, invazyonu ve hücre içi replikasyonunu sorgulamak için enfeksiyon testlerini açıklamaktadır.

Shigella ile Epitel Hücre Enfeksiyonu Analizleri

Çalışma, doku kök hücresinden türetilen bağırsak organoidleri kullanılarak bakteriyel enfeksiyonun in vitro incelenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Protokol, organoidlerin iki boyutta nasıl kültürleneceğini ve farklılaştırılacağını, onları yapışkan-invaziv Escherichia coli ile enfekte edeceğini ve epitel bariyer sızıntısı, enfeksiyon görüntüleme ve epitel RNA yanıtı gibi önemli okumaları nasıl değerlendireceğini açıklar.

Konak-bakteri etkileşimlerini incelemek için invazin veya bazal zar ekstraktı üzerine iki boyutlu organoid kültürü

Yapışkan-invaziv Escherichia coli suşlarında antibiyotik direnci, geleneksel gentamisin koruma testi kullanılarak bakteriyel invaziyanı değerlendirmede zorluklar yaratmaktadır. Bakteriyel istilayı nicel olarak değerlendirmek için koloni oluşturan birimlerin sayılması ve enfekte hücrelerin immünofluoresans konfokal mikroskopisi ile niteliksel olarak görselleştirilmesi için geliştirilmiş bir yöntem tanımlanmıştır.

Escherichia coli hücre istilasının nicelendirilmesi ve görselleştirilmesi için amikacin koruma testi

Bu protokol hazırlanması için sentetik bir tRNA substrat...

Entamoeba histolytica DNA ve tRNA Metiltransferaz Dnmt2 (Ehmeth) Enzim ile in vitro tRNA Metilasyon Testi

Keşfedin Entamoeba histolytica ile epitel hücre etkileşimlerini ve sıkı bağlantıların dağılma mekanizmalarını. Bu yöntem, amebiyaz patogenezinin erken evrelerini anlamak için immunofloresan ve trans epiteliyel elektriksel direnç ölçümü kullanır.

Yapımcı Epitel Hasar Analizi

Daha fazla video keşfet