Majör Histo-uyum Kompleks sınıf II Dextramers kullanarak Beyin ve Heart reaktif CD4 T hücrelerinin in situ tespiti

Bu prosedürün genel amacı, MHC Sınıf iki dekstramerler kullanarak yüksek derecede özgünlükle öz-reaktif T hücrelerini tespit etmektir. Bu videoda, miyelin protein lipit proteini ile indüklenmiş deneysel otoimmün ensefalomiyelit faresinin beyninden serebral doku toplanmaktadır. Bu işlem, öncelikle dokuların dikkatlice hasat edilmesi ve donma bloklarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir.

İkinci adım, agar içine gömülmüş dokunun bir viotom ile 200 µm kalınlığında kesitlere ayrılmasıdır. Kesitler daha sonra boyama ve tespit işlemlerinin gerçekleştirildiği 24 kuyucuklu bir plaka içindeki doku odacıklarına aktarılır. Son adım ise doku kesitlerinin mikroskop lamlarına monte edilmesidir.

Son aşamada, dex trimesterleri ve CD4 antikoru ile bağlanmış hücreleri göstermek için konfokal mikroskopi kullanılır. Bu fikir, MHC sınıf II dekstro ER'lerin, antijene özgü self-reaktif CD4 T hücrelerini saptamada geleneksel MHC Sınıf II tetramerlerinden daha hassas olduğunu ilk kez kanıtladığımızda ortaya çıkmıştır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, taze dokuların kesilmesi ve işlenmesinin oldukça zor olması nedeniyle güçlük çekebilirler.

Kesit alma, montaj ve analiz adımlarının zahmetli olması nedeniyle öğrenilmesi güç olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Grubumdan iki doktora sonrası araştırmacı olan Ting, Chandy ve Aaron'ın yanı sıra Dr. Zoe'nin laboratuvarından Christian bu prosedürü gösterecektir. Eksperimental otoimmün ensefalomiyelit (EAE) farelerinin ötanaziyasının ardından, kranyum kavisli makaslar kullanılarak dairesel bir şekilde kesilip kafatası kemikleri pensle dikkatlice kaldırılarak kafatası açığa çıkarın. Beyni, temiz bir bistüri kullanarak künt diseksiyonla çıkarın.

Rerum'u cerebellum'dan ayırın. Rerum'u soğuk 1x fosfat tamponlu salin veya PBS içeren bir tüpe yerleştirin ve işlem sırasına kadar tüpü buz üzerinde bekletin. Rerum'u, buz üzerinde tutulan tek kullanımlık derin tabanlı bir histoloji kaseti kalıbına yerleştirin.

Ardından, eritilmiş %4 PBS tamponlu düşük erime noktalı aerosu kasede dökün. Dokunun gömülmesi için cerebrumu forsepsle nazikçe bastırın ve katılaşma tamamlanana kadar kasedi buz üzerinde bekletin. Katılaştıktan sonra, gömülü dokunun tüm kenarlarındaki fazla aerosu kesin ve cerebrumun ventral yüzeyini hafifçe açığa çıkarın.

Ardından, Vibram doku bloğuna hızlı yapıştırıcı sürün ve transvers kesit alma işlemi için serebronun açıkta kalan ventral yüzeyini yapıştırıcı üzerine yerleştirerek, aros gömülü dokuyu yapıştırılmış yüzeye aktarın. Doku blok üzerine yerleştirilip sabitlendikten sonra hareket ettirmeyin. Aros gömülü dokuyu içeren vibrate tone bloğunu buza yerleştirin ve yapıştırıcının 15 dakika boyunca kurumasını bekleyin.

Bu sırada, hazırlanan doku odacıklarını bir 24 kuyucuklu plakaya, her kuyucuğa bir odacık gelecek şekilde yerleştirin. Doku odacıklarını içeren kuyucukları bir mililitre soğuk 1X PBS ile doldurun ve plakayı buz üzerinde bekletin. Yapıştırıcı kuruduğunda, vibram bıçağını dokunun üst yüzey seviyesine indirin.

Vibram hızını saniyede 0.22 milimetreye ayarlayın ve 200 mikrometre kalınlığında kesitler almak için ileri hareketle kesme işlemine başlayın. Sulu boya yumuşak fırçası kullanarak her bir serebral kesiti ilgili doku haznesine aktarın. Doku bozulmasını önlemek için, kesme işlemi tamamlanana kadar 24 kuyucuklu plakayı buz üzerinde tutun.

Ardından, üç kuyucuğa S myelin protio lipid protein 1 39-1 51 dextro ve CD4 antikoru içeren bir kokteylden 300 µL ekleyerek ikinci bir 24 kuyucuklu plak hazırlayın. Daha sonra, diğer üç kuyucuk setine kontrol amaçlı S Tyler's murine encephalomyelitis virus 70-86 dextro ve CD4 antikoru kokteylinden 300 µL ekleyin. Kuyucukları etiketleme işlemine geçin.

Ardından, spesifik dex kırpıcıları ile boyanmak üzere belirlenen kesitleri içeren üç doku haznesini, her kuyucuğa bir hazne gelecek şekilde 24 kuyucuklu plakanın belirlenmiş üç kuyucuğuna aktarın. Benzer şekilde, kontrollü dex akış kanalları ile boyanmak üzere belirlenen kesitleri içeren üç doku haznesini ilgili kuyucuklara aktarın. Her kuyucukta bir hazne olacak şekilde kuyucukları bir kapakla kapatın.

Plakayı alüminyum folyo ile sarın ve plağı oda sıcaklığında, karanlıkta, 1,5 saat boyunca hafif rotasyona ayarlanmış bir sallama platformuna yerleştirin. İnkübasyon süresinin ardından, doku kesitlerini sallama platformu üzerinde en az 10 dakika boyunca bir mililitre soğuk 1X PBS yıkama çözeltisi içeren taze bir kuyucuğa aktararak yıkayın. Yıkama işlemini üç kez tekrarlayın.

Doku kesitlerinin hazne kenarlarına yapışabileceği için kurumamalarına dikkat edin. Doku haznelerini, bir mililitre filtrelenmiş %4 PBS tamponlu paraformaldehit içeren 24 kuyucuklu plakaya aktarıp, hafif rotasyonlarla bir sallama platformu üzerinde iki saat boyunca inkübe ederek kesitleri sabitleyin.

Kesitleri üç kez daha yıkadıktan sonra, boyanmış ve fikse edilmiş kesitleri temiz bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Kesite dokunmadan, suluboya yumuşak fırçası kullanarak fazla suyu temizleyin ve kesiti montaj medyumu ile monte edin. Mikroskop lamel ile kapatın ve lamların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin.

Karanlık odada, rutin tarama ve görüntüleme işlemleri için bir Nikon A one Eclipse 90 I konfokal mikroskop sistemi kullanın. Başlamak için NIS elements AR yazılımını açın, panelden tetraetil sodyum izotiyosiyanat veya TRITC ve cyan five veya Cy5 kanallarını seçin. TRITC ve Cy5 kanalları için uyarım emisyon dalga boyları varsayılan olarak görünür.

Trit Deniz Kanalı için yeşil, SCI beş kanalı için ise kırmızı yalancı renk atayın. İncelenecek lamı mikroskop tablasına yerleştirin ve 100 kat büyütme altında manuel olarak odaklayın. HV değerini 1,10 ve ofset değerini sıfıra ayarlayın, odakla (focus) düğmesine tıklayın ve voltajı düzenleyin.

Lazerleri optimize etmek için odak taramasına (focus scan) tıklayarak kesiti yukarıdan aşağıya doğru tarayın ve görüntüleme için Z seviyesini belirleyin. Ardından CH serisine tıklayarak görüntüleri sırasıyla elde edin. Kırmızı ve yeşil kanallardan gelen sinyallerin kolokalizasyonuna dayanarak, sarı noktalı hücreler şeklinde görünen destro veya pozitif CD4 pozitif T hücrelerini tanımlayın.

Dextro veya pozitif CD4 pozitif T hücrelerinin kolayca kantitatif sayımını yapmak için bir Olympus FV 500 BX 60 konfokal mikroskobu kullanın. Başlamak için, flu ovu yazılımını açın. Açılır menüden S SI 3 ve SCI 5 boyalarını seçin ve ilgili lazerleri yüklemek için uygula seçeneğine tıklayın.

İncelenecek lamı mikroskop tablasına yerleştirin ve SI three lazeri açıkken düşük büyütmede manuel olarak odaklayın, odakla butonuna tıklayın ve inflamatuar odağı odaklayın. Objektifi 100 kat büyütmeye getirin. Açılır menüden dosya boyutunu beş 12 üzerinden beş 12 olarak ayarlayın, odakla butonuna tıklayın ve S SI three ve sci five lazerlerini ayrı ayrı optimize etmek için PMT kazanç (gain) ve ofset değerlerini ayarlayın, Z tablasına tıklayın ve ardından her iki lazer de açıkken odakla butonuna tıklayın.

Yukarı ve aşağı oklarına tıklayarak Z tablasının kalınlığını ayarlayın. Z aralığını iki mikrometre olarak belirleyin. Durdur'a tıklayın ve seçiminizi yapın.

1, 2 ve 3'ü arayın. Ardından X, y, Z'ye tıklayın ve inflamatuar odak içindeki seçili alan için Z serisi görüntüleri almaya başlayın; Z seri görüntülerini VI dosyaları olarak kaydedin. Görüntü dosyalarını kaydetmek için Z seri görüntüden görüntüyü seçin ve ardından TIFF formatında kaydedin.

Çoklu TIFF görüntülerini her zaman kaydedin. İlk olarak verileri korumak için, bir sonraki adım her iki dekstrin düzenleyici setiyle boyanmış üç çift kesiti incelemektir. İlk olarak, aynı odak düzleminde Z serisinin tekrarlanmasını önlemek için lamları yatay-dikey yukarı ve yatay-dikey aşağı hareketlerle tarayarak Z seri görüntülerini alın.

Z serisi görüntüler yakalandıktan sonra, dosyaları lam numaralarını, kesit isimlerini ve alınan Z serisi görüntü sayısını belirterek adlandırın. Dextro pozitif CD4 pozitif T hücrelerini, toplam CD4 pozitif T hücre sayısına oranla saymak için ImageJ yazılımını kullanın. ImageJ'de sayıcı tipini seçin, "show all" (tümünü göster) seçeneğini işaretleyin ve her hücrenin merkezine tıklayarak saymaya başlayın; yan okları kullanarak farklı Z serisi görüntülerde saymaya devam edin.

Tüm CD4 T hücrelerini saydıktan sonra, başka bir sayıcı türü seçin ve dekstro pozitif CD4 pozitif T hücrelerini sayın. İki farklı sayıcı ile sayılan toplam hücre sayısını elde etmek için sonuçlar sekmesine tıklayın. Miyelin proteolipid protein veya PLP spesifik CD4 T hücrelerinin tespiti, EAE farelerinden elde edilen ve anti-CD4 ile PLP 1 39 ile 1 51 deksterleri veya kontrol TMEV 70 ile 86 deksterlerini içeren kokteyllerle boyanmış taze kesilmiş serebral kesitler kullanılarak LSCM ile gerçekleştirilmiştir.

Serebral kesitlerin ko-boyama analizi, kırmızı renkte PLP 1 39 ila 1 51 dekramerleri için pozitif olan hücreleri ve yeşil renkte CD dört antikoru için pozitif olan hücreleri göstermektedir; çift pozitif hücreler ise sarı renkte görünmüştür. Ko-boyalı hücreler çevresinde noktasal benekler göstermiştir. Kontrol TMEV 70 ila 86 ile boyanan kesitte böyle bir özellik gözlemlenmemiştir.

Kardiyak miyozin spesifik CD4 T hücrelerinin, kardiyak miyozin ağır zincir α3 34-352 dexterları ile in situ boyama kullanılarak tespiti de gerçekleştirilmiştir. Bu görüntülerin LSCM ile analizi; MYHC 3 34-352 dexterları için pozitif hücrelerin kırmızı, CD4 için pozitif hücrelerin yeşil ve hem dexter hem de CD4 ile bağlanan hücrelerin ise sarı noktasal hücreler şeklinde olduğunu göstermiştir. Kontrol RNA'ları 43-56 dexterları için arka plan boyaması ihmal edilebilir düzeydeydi. Bu teknik, düzgün bir şekilde uygulandığında, yayınlanmış diğer protokollerin gerektirdiği üç günün aksine yaklaşık 8 ila 10 saatte tamamlanabilmektedir.

Bu işlemi uygularken, reaktifleri önceden hazırlamanın ve adımları sistematik bir şekilde takip etmenin önemli olduğunu unutmayın. Bu videoyu izledikten sonra, hedef dokulardaki C-reaktif CD four T hücrelerinin sayımı için dokuların nasıl kesileceği ve boyanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.