Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Bu prosedürün genel amacı, saf ve solunumla yetinen mitokondriyi sıçan dokusundan hızlı bir şekilde izole etmektir. Bu, önce doku örneklerinin birleştirilmesi ve homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, alt A tabakasını homojenata karıştırmak ve buz üzerinde inkübe etmektir.

Bunu, homojenat karışımının BSA'da filtrelenmesi ve tekrar filtrelenmesi takip eder. Son adımlar, süzüntüyü döndürmek ve mitokondriyal peletleri solunum tamponunda yeniden süspanse etmektir. Sonuç olarak, sonuçlar, izole edilmiş mitokondrinin solunum analizi ve bir A TP lüminesans testi yoluyla yaşayabilir ve solunuma yetkin olduğunu gösterebilir.

Bu tekniğin, 60 ila yüz dakika arasında değişen mitokondriyal izolasyon sürelerini bildiren mevcut yöntemlere göre temel avantajı, canlı ve solunuma yetkin mitokondrinin 30 dakikadan daha kısa sürede izole edilebilmesidir. Allison mackay, İşbirlikçi bir laboratuvardan bir teknisyen, başlamadan hemen önce A TP lüminesans testini gösterecek. Subin A'yı bir mililitre homojenleştirme tamponunda çözün ve BSA'yı da bir mililitre homojenleştirme tamponunda çözün.

Şimdi altı milimetrelik bir biyopsi örneği zımbası kullanarak iki taze doku örneği toplamaya başlayın ve bunları 50 litrelik bir santrifüj tüpünde buz üzerinde bir XPBS'de saklayın. Hazır olduğunda, dokuyu beş mililitre buz gibi soğuk homojenleştirici tampon içeren bir ayrışma C tüpüne aktarın. Daha sonra tüpü doku ayrışmasına uydurarak ve önceden ayarlanmış mitokondriyal izolasyon döngüsünü seçerek dokuyu homojenize edin.

Tamamlandığında, tüpü tekrar buzun üzerine koyun ve bir stok çözeltisi oluşturmak için 250 mikrolitre alt ekleyin. Bunu ters çevirerek karıştırın. Karışım eşit şekilde dağılmış gibi göründüğünde, homojenatı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.

Ardından, 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne 40 mikronluk bir filtre koyun ve bunu buzun içine koyun. Filtreyi homojenizasyon tamponu ile nemlendirin ve tamponu bir atık kabına atın. Daha sonra her şey hazır olduğunda, homojenatı süzüntüye dökün.

250 mikrolitre BSA stok çözeltisi ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Ancak mitokondriyal protein analizi için bu adım atlanmalıdır. Şimdi iki tane daha hazırlayın.

Buz üzerindeki 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerinden birine 40 mikron, diğerine 10 mikron filtre sığar. Her iki filtreyi de biraz homojenleştirici tamponla ıslatın ve bu tamponu atın. Daha sonra homojenatı önce 40 mikronluk filtreden, ardından 10 mikronluk filtreden dökün.

Bu filtrasyon adımları, mitokondrinin saflığını önemli ölçüde artırır. Şimdi süzüntüyü önceden soğutulmuş iki 1.5 mililitrelik mikro füj tüpü arasına bölün ve bunları dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 9.000 G'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı çıkarın ve iki saflaştırılmış mitokondriyal peleti yeniden askıya alın ve birleştirin.

Bir mililitre buz gibi soğuk solunum tamponunda, tüm prosedürün dört santigrat derecede yürütülmesi hayati önem taşır. Saflaştırılmış mitokondri artık izole edilmiş mitokondrinin metabolik aktivitesini belirlemek için test edilebilir. Bir A TP lüminesans testi, bir A TP test kiti kullanılarak gerçekleştirilebilir.

İlk olarak, kit reaktiflerini oda sıcaklığına getirin. Ardından, HT P stok çözeltisini hazırlayın ve buzun üzerine koyun. Bir sonraki adım, liyofilize substrat çözeltisine beş mililitre substrat tamponu eklemektir.

Bunu nazikçe karıştırın ve karanlıkta yerleştirin. Daha sonra, opak siyah olan 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 mikrolitre solunum tamponu ekleyin. Hazırlanan mitokondriyi 10 mikrolitre A TP standartlarının altındaki kuyulara ekleyin.

Her benzersiz mitokondriyal numune, negatif bir kontrol olarak tek başına üç kuyulu solunum tamponu olan üç kopya plakada kaplanmalıdır. Bir kez yüklendikten sonra her kuyucuğa 50 mikrolitre memeli hücre lizis çözeltisi ekleyerek devam edin. Plakayı 37 santigrat derecede 120 RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde beş dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, bir 10. milimolar ila bir 10. mikromolar arasında değişen A TP standardının seyreltmelerini hazırlayın. İnkübasyonun ardından, plaka haritasında belirtilen ilgili kuyucuklara A TP standartlarının her birinden 10 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, her birine 50 mikrolitre sulandırılmış substrat çözeltisi ekleyin.

Daha sonra plakayı daha önce olduğu gibi beş dakika boyunca tekrar inkübe edin. Plaka okuyucuda plakaları inceleyerek devam edin. Aşağıdaki yazılımı açın.

Yeni bir öğe oluşturun. Deney'e tıklayın. Ardından varsayılan protokole tıklayın ve Tamam'a tıklayın.

Sol sütunda protokol'ü seçin. Ardından prosedür Sonraki, gecikmeyi seçin ve 10 dakikaya ayarlayın. O zaman tamam, giriş.

Şimdi açılır menüden lüminesansı seçin, okuyun ve seçin. Diğer ayarları aşağıdaki gibi yapın. Okuma türü uç nokta tümleştirme süresi.

Bir saniye. Filtre, bir emisyon deliği optik konumunu, en yüksek hassasiyeti 100, üst prob dikey ofsetini bir milimetre olarak ayarlar. Bu ayar değişikliklerini yaptıktan sonra Tamam'ı tıklayın.

Plaka düzenine tıklayın ve buna göre ayarlayın. Tamam'a tıklayın. Şimdi her şey ayarlandıktan sonra, üst satırdaki okuma plakası simgesine tıklayın ve oku'ya tıklayın.

Spektrofotometre açıldığında, plakayı sol üst köşede bir tane olacak şekilde tepsiye yerleştirin. Şimdi sıcaklığı gösteren bir kutu açılacak, tamam'ı tıklayın, ardından verilerin analizine devam edin. Yaklaşık 0.18 gram ıslak ağırlığındaki iskelet kası örnekleri, parçacık boyutu sayımına dayalı olarak yaklaşık 24 milyar mitokondri verdi.

Aynı büyüklükteki karaciğer örnekleri birkaç milyar daha verdi. Mitokondri hemo sitometre okumaları, partikül sayacı kullanılarak hafife alındı. İzole edilmiş mitokondrinin, ortalama çapı bir mikronun yaklaşık onda dördü olan bir tepe altında lokalize olduğunu gösteren temsili bir izleme elde edildi.

Bu, bi asit tahlilinin kullanıldığı önceki raporlarla uyumludur. Mitokondriyal protein, iskelet kası ve karaciğerden alınan doku gramı başına birkaç miligram olarak ölçüldü. Ürün uygulanabilir ve solunum konusunda yetkindi.

Mitokondri, klinik ve cerrahi terapötik müdahale için uyumlu bir zaman diliminde izole edilmiştir. Transmisyon elektron mikrografları, izole edilmiş mitokondrinin tümünün 10.000'de birden daha az hasara sahip elektron göçüğü olduğunu, kontaminasyonun yüz binde bir A TP tahlilinde birden az olduğunu gösterdi. Sonuçlar, mitokondrinin canlı olduğunu ve bir TP içeriğinin miligram mitokondriyal protein başına yaklaşık 11 veya 15 nanomol olduğunu ortaya koydu.

Mitokondriyal solunum analizi, Clark tipi bir elektrot kullanılarak yapıldı ve oksijen tüketiminin dakikada yaklaşık 180 MLE oksijen olduğunu ortaya koydu. Her miligram mitokondriyal protein için RCI değerlerinin her biri 2.5 civarındayken, biraz daha yüksek karaciğer skoru ile bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 30 dakikadan daha kısa sürede yapılabilir.