Doku Ayrışma Ve Diferansiyel süzülerek Nakli İçin Mitokondri Of Rapid İzolasyon ve saflaştırma

Bu prosedürün genel amacı, sıçan dokusundan hızlı bir şekilde saf ve solunum kapasitesine sahip mitokondriler izole etmektir. Bu işlem, öncelikle doku örneklerinin birleştirilmesi ve homogenize edilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, homogenata subin A ekleyip karıştırmak ve buz üzerinde inkübe etmektir.

Ardından, homojenat BSA ile karıştırılarak süzülür ve tekrar filtrelenir. Son adımlar ise filtratı santrifüjle çöktürmek ve mitokondri pelletlerini respirasyon tamponunda yeniden süspanse etmektir. Nihayetinde, respirasyon analizi ve bir ATP lüminesans testi aracılığıyla izole edilen mitokondrilerin canlı ve respirasyon kapasitesine sahip olduğu gösterilebilir.

Mito kondriyal izolasyon sürelerinin 60 ile 100 dakika arasında olduğu mevcut yöntemlere kıyasla bu tekniğin temel avantajı, canlı ve solunum kapasitesine sahip mitokondrilerin 30 dakikadan daha kısa sürede izole edilebilmesidir. İşlemlere başlamadan hemen önce, ortak çalışan bir laboratuvardan teknisyen Allison mackay, ATP lüminesans analizini uygulamalı olarak gösterecektir. Subin A'yı bir mililitre homojenizasyon tamponunda çözün ve BSA'yı da yine bir mililitre homojenizasyon tamponunda çözün.

Şimdi, altı milimetrelik bir biyopsi örnekleme punch'ı kullanarak iki taze doku örneği toplayarak başlayın ve bunları buz üzerinde, 50 liter santrifüj tüpü içindeki bir XPBS'de saklayın. Hazır olduğunda, dokuyu beş mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponu içeren bir disosiyasyon C tüpüne aktarın. Ardından tüpü doku disosiyasyon cihazına yerleştirip önceden ayarlanmış mitokondri izolasyon döngüsünü seçerek dokuyu homojenize edin.

İşlem tamamlandığında tüpü tekrar buz üzerine yerleştirin ve 250 µL sub to lyin stok çözeltisi ekleyin. Ters çevirme yöntemiyle karıştırın. Karışım homojen göründüğünde, homogenatı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.

Ardından, 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne 40 mikronluk bir ağ filtre yerleştirin ve tüpü buzun içine gömün. Filtreyi homogenizasyon tamponu ile nemlendirin ve tamponu bir atık konteynerine boşaltın. Her şey hazır olduğunda, homogenatı süzüntüye geçecek şekilde filtreden geçirin.

250 µL BSA stok çözeltisi ekleyin ve ters çevirerek karıştırın. Ancak, mitokondriyal protein analizi için bu adım atlanmalıdır. Şimdi iki tane daha hazırlayın.

Buz üzerinde bulunan 50 mililitrelik konik santrifüj tüplerinden birine 40 mikronluk filtre, diğerine ise 10 mikronluk filtre yerleştirin. Her iki filtreyi az miktarda homogenizasyon tamponu ile ıslatın ve bu tamponu atın. Ardından homogenatı önce 40 mikronluk filtreden, sonra ise 10 mikronluk filtreden geçirin.

Bu filtrasyon adımları, mitokondrilerin saflığını önemli ölçüde artırır. Şimdi süzüntüyü önceden soğutulmuş iki adet 1,5 ml mikro santrifüj tüpüne paylaştırın ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.000 G'de santrifüjleyin. Ardından süpernatantı uzaklaştırın ve saflaştırılmış iki mitokondri pelletini yeniden süspanse ederek birleştirin.

Bir mililitre buz soğukluğunda respirasyon tamponu içinde, tüm prosedürün dört santigrat derecede yürütülmesi hayati önem taşır. Saflaştırılmış mitokondriler, izole edilen mitokondrilerin metabolik aktivitesini belirlemek için artık test edilebilir. Bir ATP assay kiti kullanılarak ATP lüminesans analizi gerçekleştirilebilir.

Öncelikle, kit reaktiflerini oda sıcaklığına getirin. Ardından, HT P stok çözeltisini hazırlayın ve buz üzerine yerleştirin. Bir sonraki adım, liyofilize substrat çözeltisine beş mililitre substrat tamponu eklemektir.

Bunu nazikçe karıştırın ve karanlık bir yere yerleştirin. Ardından, opak siyah bir 96 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucuğa 100 µL respirasyon tamponu ekleyin. Hazırlanan mitokondrilerden 10 µL miktarını ATP standartlarının altındaki kuyucuklara ekleyin.

Her bir benzersiz mitokondri örneği üçlü şeklinde ekilmeli ve negatif kontrol olarak üç kuyuğa sadece respirasyon tamponu eklenmelidir. Yükleme işlemi tamamlandıktan sonra her kuyuğa 50 µL memeli hücresi lizis solüsyonu ekleyerek devam edin. Plakayı, 120 RPM hızındaki bir orbital çalkalayıcı üzerinde 37 °C'de beş dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında, 1/10 milimolar ile 1/10 mikromolar arasında değişen A TP standart dilüsyonlarını hazırlayın. İnkübasyonun ardından, her bir A TP standardından 10 µL'yi plaka haritasında belirtilen ilgili kuyucuklara ekleyin. Daha sonra, her birine 50 µL rekonstitüe substrat çözeltisi ekleyin.

Ardından, plakayı daha önce yaptığınız gibi beş dakika boyunca tekrar inkübe edin. Plakaları plaka okuyucuda inceleyerek devam edin. Aşağıdaki yazılımı açın.

Yeni bir öğe oluşturun. Deneye tıklayın. Ardından varsayılan protokole tıklayın ve tamam'a basın.

Sol sütundan protokol'ü seçin. Ardından işlem'i (procedure) seçin. Sonra gecikme (delay) seçeneğini seçin ve 10 dakika olarak ayarlayın. Ardından girişi onaylayın (okay).

Şimdi seçin, okuyun ve açılır menüden lüminesansı seçin. Diğer ayarları şu şekilde düzenleyin. Okuma tipi uç nokta integrasyon süresi.

Bir saniye. Filtre setleri bir emisyon deliği optik konumunu, üst hassasiyeti 100, üst prob dikey ofsetini bir milimetre olarak ayarlar. Bu ayar değişikliklerini yaptıktan sonra tamam'a tıklayın.

Plaka düzenine tıklayın ve uygun şekilde ayarlayın. Tamam'a tıklayın. Her şey ayarlandıktan sonra, üst sıradaki plaka okuma simgesine tıklayın ve oku'ya basın.

Spektrofotometre açıldığında, plakayı A1 kuyucuğu sol üst köşeye gelecek şekilde tepsiye yerleştirin. Şimdi sıcaklığı gösteren bir kutu açılacaktır, tamam'a tıklayın ve ardından veri analizine geçin. Yaklaşık 0.18 gram yaş ağırlığındaki iskelet kası örneklerinden, partikül boyutu sayımına göre yaklaşık 24 milyar mitokondri elde edilmiştir.

Aynı boyuttaki karaciğer örneklerinden birkaç milyar daha fazla elde edildi. Partikül sayacı kullanılarak yapılan mitokondri hemositometre okumaları düşük tahmin edilmiştir. İzole mitokondrilerin, ortalama çapı yaklaşık dört ondalık mikron olan tek bir pik altında toplandığını gösteren temsili bir izleme elde edilmiştir.

Bu sonuçlar, bi asit analizi kullanan önceki raporlarla uyumludur. İskelet kası ve karaciğerden elde edilen dokuların gramı başına birkaç miligram mitokondriyal protein ölçülmüştür. Ürün canlı ve solunum yeteneğine sahipti.

Klinik ve cerrahi terapötik müdahale için uygun bir zaman diliminde mitokondriler izole edilmiştir. Transmisyon elektron mikrografları, izole edilen mitokondrilerin tamamının elektron yoğun olduğunu ve 10.000'de birden daha azının hasarlı olduğunu; kontaminasyonun ise ATP analizinde yüz binde birden daha düşük olduğunu göstermiştir. Sonuçlar, mitokondrilerin canlı olduğunu ve ATP içeriğinin miligram mitokondriyal protein başına yaklaşık 11 veya 15 nanomol olduğunu ortaya koymuştur.

Mitokondriyal respirasyon analizi Clark tipi bir elektrot kullanılarak gerçekleştirilmiş ve oksijen tüketiminin, her bir miligram mitokondriyal protein başına dakikada yaklaşık 180 MLE oksijen olduğu ortaya çıkmıştır. RCI değerleri ise, karaciğer skorunun biraz daha yüksek olmasıyla birlikte, her biri yaklaşık 2,5 civarındaydı. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, işlem düzgün bir şekilde yürütülürse 30 dakikadan kısa sürede tamamlanabilir.I.