Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Bu prosedürün genel amacı, hematopoietik kök ve progenitör hücreleri içeren yüksek çözünürlüklü 3D yığınlar elde etmek ve bunları çok noktalı hızlandırılmış görüntüleme yoluyla zaman içinde izlemektir. Bu, önce hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin veya HSC'lerin lipofilik bir boya ile etiketlenmesiyle gerçekleştirilir. HSC'ler daha sonra bir alıcı fareye enjekte edilir.

Fare, sabit hayvan konumlandırması için özelleştirilmiş bir başlık ve numune tutucu kullanılarak mikroskopi için hazırlanmıştır. Daha sonra, hematopoietik kök ve progenitör hücre nişlerinin yüksek çözünürlüklü yığınları elde edilir ve HS PC'leri içeren çoklu kemik iliği yerleşimlerinin hızlandırılmış görüntülemesi gerçekleştirilir ve sonuçta intravital konfokal ve kemik iliği boşluğundaki HSC'lerin lokalizasyonunu ve hareketini göstermek için iki foton mikroskobu kullanılır. Bu tekniğin kemik iliği kesitlerinde immünofloresan gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, dört boyutlu bir ölçekte, üç boyut artı zamanda bilgi yakalayabilmemizdir.

Bu tekniğin etkileri hematolojik hastalıkların tedavisine kadar uzanır, çünkü hematopoietik kök hücreleri kemik iliği içinde doğru işlevlerini garanti altına almak için nereye yönlendirmemiz gerektiğini anlamaya yardımcı olur. Bu yöntem için bu fikir ilk olarak, zaman içinde HS PC'leri takip edebilmenin ne kadar önemli olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi. Bu yöntem, kök hücrelerin nerede bulunduğunu ve zaman içinde nasıl davrandıklarını bilmek istediğimiz kök hücre niş alanıyla ilgili tüm sorularımızı yanıtlamamıza yardımcı olur.

Başlamak için, hematopoietik kök ve progenitör hücreleri, bu laboratuvar tarafından önceki bir coğrafi videoda gösterildiği ve metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi hasat edin. Daha sonra, lipofilik boya DID'yi beş mikromolar final konsantrasyonunda hücre süspansiyonuna ekleyin. Boyanın çözeltiden çökelmemesini ve hücreleri etiketlememesini sağlamak için süspansiyonu hemen vorteksleyin.

Hücreleri yıkamak için hücreleri 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Önce beş dakika boyunca 500 kez G'de döndürün ve sıvıyı boşaltın. Daha sonra hücreleri 200 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin ve bir insülin şırıngasına toplayın.

Geleneksel bir şırınga yerine bir insülin şırıngası önerilir, çünkü iğne ölü alanı yoktur. Hücreleri kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla ölümcül şekilde yayılan bir fareye enjekte etmek için tüm hücre süspansiyonunun fareye uygulanmasına izin vermek. İlk önce fareyi ılık bir odaya yerleştirin.

Kuyruk damarı göründüğünde, vazodilate olarak, fareyi kısıtlayıcıya hareket ettirin. İğneyi dikkatlice kuyruk damarına kaydırın. Hücreleri damar içine enjekte edin.

Enjeksiyona karşı herhangi bir dirençle karşılaşılmamalıdır. Fareyi gece boyunca bırakın. Hücrelerin kemik iliği boşluklarına göç etmesine izin vermek için, fareyi uyuşturun ve petal refleks yoluyla derin anestezinin başlangıcını izleyin.

Kafa derisinin üst kısmını bir doku üzerinde% 70 etanol ile sürün. Farenin gözüne etanol kaçmamasına dikkat edin. Görüntülenecek kalvarium alanını ortaya çıkarmak için, başın arkasında, kulaklar arasında küçük bir kesi yapın, cildi yukarıda tutarken forseps ile cildi yukarı kaldırın.

Makası derinin altına kaydırın ve istenen görüntüleme alanının dışını nazikçe kesin. Kemiği nemli tutmak için açıkta kalan kemiği steril PBS ile nemlendirilmiş steril bir pamuklu çubukla silin. Bu, görüntüleme kalitesini etkileyebilecek aşırı kuruma ve yara izini önler.

Daha sonra, yeterli miktarda diş çimentosunu bir peynir altı suyu teknesinde macun kıvamına gelene kadar karıştırın. Kafatasına takılacak otoklav başlığının alt yüzeyine hızlı bir şekilde uygulayın. Çimento sertleşmeden önce, başlığı farenin kafatasının üzerine yerleştirin, görüntüleme alanına herhangi bir diş çimentosu almamaya dikkat edin ve sertleşmesini bekleyin.

Kafatasını nemli tutan az miktarda intra hidrojel uygulayın ve çimentoyu kururken rahatsız etmemeye dikkat edin. Ardından başlığı tutucuya takın ve yerine sabitleyin. Vidayı kullanarak, olukların tutucu çentiklere oturduğundan emin olun.

Mikroskoba aktarmadan önce hidrojeli steril pamuklu çubuklarla çıkarın. Ardından, tutucuyu mikroskop tablasına yerleştirin ve ısıtma matını farenin altına yerleştirin. Rektal termometre probunu yerleştirin ve sahnedeki her şeyi yapışkan bantla yerine sabitleyin.

Anestezi altındayken kurumalarını önlemek için farenin gözlerine küçük bir damla oftalmik merhem sürün. Fare, anestezi altındayken görüntüleme işlemi sırasında hiçbir zaman gözetimsiz bırakılmamalıdır. Göz mercekleri aracılığıyla kafatasına odaklanmak.

İlk olarak, kalvaryum görüntüleme penceresini bir su daldırma lensi kullanarak arıtılmış steril suyla doldurun. Su damlasına değecek şekilde indirin. Mikroskop göz merceklerini kullanarak kafatasının üst kısmına odaklanın.

Görüntüleme alanını merkezi sütürün üzerine yerleştirin ve koronal sütürü bulmak için başın arkasına doğru hareket edin. Başlangıç konumu olarak, yazılımı XY görüntülerini ve üç DZ yığınını yakalamak için bir moda yerleştirin. Görüntüleme hızını 400 hertz ve çözünürlüğü 512 x 512 piksel olarak ayarlayın.

Yazılımı, birden fazla kanal yakalanacak şekilde ayarlayın ve yığınlar arasındaki veya kareler arasındaki ayarları değiştirmek için toplama yöntemini ayarlayın. Üç bağımsız yakalama ayarı yapın. Her yığının edinilmesinin sonunda lazer aydınlatmanın kapatılması.

Ardından, iki foton ikinci harmonik nesil kemik sinyali için ilk sıralı taramayı ayarlayın. Çoklu foton lazer için deklanşörü açın ve çoklu foton lazer kazancı ve ofsetinin doğru şekilde ayarlandığından emin olun. Ayrıca, lazer gücünün %12.5 ila %25 olduğundan ve lazerin açık olduğundan emin olun.

Tek dedektör olarak uygun bir PMT seçin ve rengi beyaz olarak değiştirin. İkinci ayar altında birleşik otofloresan ve DID için kanal kurulum prosedürünü tekrarlayın. İki uygun p mt kullanarak tarayın.

Otofloresan için kanal rengini yeşile ve DID için kırmızıya değiştirin. Son olarak, GFP tespiti için üçüncü ve son taramayı ayarlayın. 488 nanometre lazer çizgisinin lazer gücünü yaklaşık %15'e ayarlayın, Tek aktif dedektör olarak uygun bir foto çarpan tüpü veya PMT seçin ve sözde rengini yeşil olarak değiştirin.

Seçilen kanalın önizleme taramasını başlatmak için canlı görüntüleme modunu etkinleştirin ve optimum pozlama için dedektör kazancını ve ofsetini ayarlayın. Sıralı penceredeki her tarama için bunu tekrarlayın ve kolay yeniden kullanım için bu çok kanallı taramaların ayarlarını kaydedin. Ardından, bu yazılımda işaretle ve bul olarak adlandırılan çok konumlu yakalamayı etkinleştirin ve koordinat noktalarını sıfırlayın.

Ardından, merkezi ve koronal sütür arasındaki kesişme noktasından başlayarak kemik görüntüleme alanını tarayın. Kompozit bir görünümle hem otofloresan hem de DID kullanarak kemik iliği alanının derinliğini tarayın. Bir hücre algılandığında, işaretin ve pencerenin sol tarafındaki yeni konum ekle simgesine tıklayarak bunu yeni bir koordinat konumu olarak işaretleyin.

Geçerli görüş alanı incelendiğinde, sahneyi bir görüş alanının mesafesi kadar hareket ettirin. Her görüş alanı için bu işlemi yineleyin. Yavaş yavaş tüm görüntüleme penceresinin etrafında, merkezi sütürün solunda çalışarak, farenin burnuna doğru hareket edin.

Merkezi sütür çatallanması göründüğünde, dikişin sağ tarafına geçin ve işlemi tekrarlayın. Sol tarafı ters yönde taramak. İşaretle ve bul aracını kullanarak ilgilendiğiniz yeni hücrelerin koordinatlarını işaretleyin.

Noktaları gözden geçirmek için, her konum için her hücrenin etrafında bir Zs yığınının üstünü ve altını ayarlayın. Her nokta için yukarı ve aşağı odaklanın ve üç DZ yığını yakalama için üst ve alt Z konumlarını ayarlayın. İşaretteki tek tek noktayı güncelleyin ve bulun, Zack aralığını beş mikrometreye ve her sıralı tarama kanalının ortalamasını uygun bir kaliteye ayarlayın.

Tüm tarama prosedürünü başlatarak her ilgi noktası için yüksek kaliteli bir referans yığını elde edin. Yüksek kaliteli tarama ile işiniz bittiğinde, yakalama ve zaman atlamalı ayarlar için hızlandırılmış bir ayarı etkinleştirin. Zaman aralığını beş dakikaya ve genel çalışma süresini istenen uzunluğa ayarlayın.

Bu ayarları genel taramaya uygulayın. Bu örnek, üçten fazla noktanın alınmasının nasıl gerçekleştirilebileceğini gösterir: Bu ayarları değiştirerek, çözünürlüğü 512 x 512 piksel ile sınırlayan ortalama tarama sayısı azaltılarak tarama süresi beş dakikalık hızlandırılmış bir aralığa izin verecek şekilde azaltılabilir. Taramayı çift yönlü hale getirmek ve/veya tarama hızını 600 hertz veya daha fazlasına çıkarmak, başlat düğmesine ve gösterilen yazılıma tıklayarak görüntülemeyi daha önce olduğu gibi başlatır.

Görüntüleme tamamlandıktan sonra, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi fare ötenazisini gerçekleştirin. Bir kalvaryum görüntüleme penceresi de dahil olmak üzere özel yapım yüksek hassasiyetli fare tutucusu, ölümcül şekilde ışınlanmış alıcı farelere enjekte edilen etiketli HS PC'lerin uzun süreli görüntülenmesine izin verir, burada gösterilen, kollajenden yaklaşık 90 ila 120 mikrometre kalınlığında kemik iliği alanları içeren tek hücre çözünürlüklü 3D HSPC yığınlarının 2D dilimleridir. Kemik beyaz renkle gösterilir, DID etiketli hücreler kırmızı renkle gösterilir.

Otofloresan hücreler sarı renkle ve osteoblastik hücreler yeşil renkle gösterilmiştir. Burada, bir kez ustalaştıktan sonra yeşil renkte osteoblastik hücrelerin yakınında göç eden, kırmızı renkte HSC etiketli bir DID'yi gösteren, tanımlanan HS PC'lerin 40 hızlandırılmış bir filmi gösterilmektedir. Bu teknik, ameliyat ve ilk görüntüleme için yaklaşık bir saat içinde gerçekleştirilebilmeli ve ardından hızlandırılmış görüntüleme için yeterli süre gelmelidir.

Bu videoyu izledikten sonra, fare buzağısının görüntülemesini ayarlayabilme ve zaman içinde birden fazla HS PC'ye bakabilme konusunda kendinize oldukça güvenmelisiniz.