Name: Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Öğrenin, iki foton ve konfokal mikroskopi kullanarak yetişkin fare kafatası kemik iliğinde hematopoietik kök hücrelerin 4 boyutlu canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, hücre davranışlarını ve niş dinamiklerini gerçek zamanlı izlemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Görüntüleme Dr Martin Spitaler tarafından yönetilen Imperial College London FİLM tesis, içinde bulunan dik bir Leica SP5 konfokal mikroskop üzerinde gerçekleştirildi. Numune tutucu ve miğfer Samuel Jones ve Dr Simon Schultz tavsiye ile, Imperial College London Kimya Mühendisliği departmanı ile işbirliği içinde yapıldı. Nicola Ruivo Francisco Diaz ve Imperial College&#39;da CBS personeli fare hayvancılığa onların yardım ve tavsiye için etkili oldular. Mark Scott CRUK, KKLF, BBSRC ve HFSP tarafından CRUK ve Cristina Lo Celso tarafından HFSP ve FİLM, Olufolake Akinduro tarafından finanse edilmektedir.

Hayvanların kullanımını içeren tüm işlemler, yerel mevzuata uygun olarak yürütülmektedir. Çalışmalarımız İngiltere&#39;de Home Office yanı sıra Imperial College etik paneli tarafından onaylanmıştır. Izin prosedürleri proje ruhsat belgelerinde açıklanan ve her zaman hayvan refahını sağlamak yönergeleri izleyin edilir. Işin yapıldığı ülkenin hayvan deneyleri ile ilgili mevzuata uymak için emin olun. 1. Etiketleme ve HSPCs Enjeksiyon: <ol><li> Lo Celso 14-15 tarafından tarif edildiği gibi hasat hücreleri. </li><li> PBS içinde 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, hücrelere hazırlayın. NOT: hücreleri saymak için Hemasitometre veya hücre ayırıcı tarafından sağlanan bilgileri kullanın; etiketlenmiş ve enjekte edilecek olan hücre sayısı (- 20,000 HSClerin, 100,000 - örneğin 10.000 leke 300,000 HPC), hücre tipine bağlı olarak değişir; en az 10 5 hücreleri, 100 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ile çalışma durumunda; Serum boyama inhibe gibi, herhangi bir serum olmadan PBS hücrelerin olması önemlidir. </li><li> 5 uM&#39;lik bir nihai konsantrasyonda, hücre süspansiyonu için yaptığı ve solüsyonun dışında çökelmesi ve hücreleri etiketlemek için başarısız değildir boya sağlamak için derhal girdap süspansiyonu ekleyin. </li><li> , 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de eğirme sıvı ayrıldı ve, IV enjeksiyonu (- 150 ul ~ 100) için uygun bir hacmi içinde topağın tekrar askıda bırakılmasıyla yıkanmakta, daha sonra 37 ° C&#39;de 10 dakika boyunca inkübe </li><li> 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri ve bir insülin şırınga içine toplar. NOT: fare için tüm hücre süspansiyonu tatbik edilmesini sağlar, bu nedenle hiçbir iğne ölü alanı vardır ve bu nedenle bir ensülin şırınga bilinen bir şırınga fazla tavsiye edilir. </li><li> Kuyruk ven enjeksiyon yoluyla ölümcül bir ışınlanmış fare içine hücreleri enjekte edilir. NOT: ti gelişir kemik iliği mikro (hematopoetik ve stromal bileşenleri hem de), üzerine Işınlama bilinir, önemli darbeben. Bu tutarlı bir ışınlama için zamanlama, hücre enjeksiyon (en iyi bütünleşme için radyasyondan sonra 4-24 saat) ve görüntüleme sağlamak için bu nedenle çok önemlidir. İşte ışınlama enjeksiyon öncesi 6 saat yapılır ve görüntüleme enjeksiyondan sonra 20 saat yapılır. <ol><li> Kuyruk toplardamanndan yapılan vasodilated görünene kadar sıcak odasına (37 ° C) fare yerleştirin. </li><li> Süzgeç içine fareyi hareket ettirin ve dikkatle kuyruk damar içine iğne kaydırın. </li><li> Ven içine hücreleri enjekte - enjeksiyon için hiçbir direnç karşılaştı edilmelidir. </li><li> Hücreler, kemik iliği alanlarına göç olanak sağlamak amacıyla fare O / N bırakın. </li></ol></li></ol> 2. Görüntüleme için Fare hazırlanması <ol><li> Ince forseps ile bir çift ince bir çift makas gibi, steril bir ortamda bir kullanım öncesi başlık parçası ve mağaza otoklava. </li><li> Mümkün olduğu kadar taze anestetik Makyaj (0.38 ml Ketamin + 0.25 ml Medetomidin + 4.47 ml Su). NOT: otizofluran ve diğer enjektabl dahil olmak üzere ona onaylı anestetikler, çok etkili olacaktır. 1 saat için her 45 dakikada bir uygulanır, 50 ul - anlatılan kokteyl 30 üst-up ile, vücut ağırlığının her 10 gramı başına 0.1 ml periton içine tatbik edilecektir. </li><li> Gerekirse istendiğinde sahne kalibre, mikroskop ve yazılımı başlatmak iki foton lazer açın. Lazerler açın ve onları ısınmak ve görüntüleme için fareyi hazırlarken stabilize sağlar. </li><li> Intraperitoneal enjeksiyon ile anestezi için seçilen anestezik hazırlanan karışım (adım 2.2) kullanılarak fare anestezisi. Şimdi ve protokol boyunca düzenli aralıklarla pedal refleks ile derin anestezi başlangıcını izleyin. NOT: fare işlem boyunca dikkatle izlenmeli ve anestezi yıldırım görünüyorsa gerekir - (2.2 ayrıntılı olarak) (tipik sonra 45 60 dk) daha sonra bir üst-up dozunu uygulamak. Farklı yaş ve cinsiyet fareler arasında bazı varyasyon bekliyoruz. Bu koroYeterli önlemleri sağlamak için yerel veteriner memuru ile anestezi protokolünü görüşmek üzere tant fare refahını sağlamak için alınır. </li><li> Fare gözünde herhangi etanol elde etmek için değil sağlanması, bir doku üzerinde% 70 etanol ile kafa derisi üst çubukla. </li><li> Steril forseps ve makas kullanılarak, dikkatli bir yansıması için kalvaryumun alanı ortaya çıkarmak için kafa derisi orta bölümünü kaldırın: forseps ile cildi kaldırarak kulakları arasındaki başın arka kısmında küçük bir kesi yapmak. Cilt yukarıda tutarak, derinin altına makas kaydırın ve yavaşça istenen görüntüleme alanının dışından birlikte kesti. </li><li> Nemli tutmak için steril PBS ile nemlendirilmiş steril pamuklu çubukla maruz kemik silin. </li><li> Görüntüleme için hazır fare kafatası metal kafa parça takın. <ol><li> Bu, bir macun haline gelene kadar bir ağırlık tekne diş çimento yeterli miktarda karıştırıp ve hızlı bir şekilde s eklenecektir baş kısmının alt yüzeyine uygulamakkull. </li><li> Çimento setleri önce, sonra, emin görüntüleme alanında herhangi bir diş çimento almak için değil yapım, fare kafatası üzerine baş kısmını yerleştirmek ayarlandığı için bekleyin. </li><li> Kafatası nemli tutar Site içi Hidrojeli küçük bir miktar uygulayın. </li></ol></li><li> Sahibine baş kısmını takın ve oluklar tutucu çentikler sığacak sağlanması, vidayı kullanarak sabitleyin. </li><li> Mikroskop aktarmadan önce steril PBS ile steril pamuk tomurcukları ile kafatası ve temiz gelen hidrojel çıkarın. </li><li> , Mikroskop aşamaya yuvasını fare altındaki ısıtma mat konumlandırmak, rektal termometre probu yerleştirin ve yapışkan bant ile sahnede yerde her şey güvenli. </li><li> Onlar anestezi altında iken kurumasına etmemelerini sağlamak için fare gözleri oftalmik merhem küçük bir damla koyun. NOT: anestezi altında iken fare görüntüleme işlemi sırasında herhangi bir anda sahipsiz bırakılmamalıdır. </li></ol>İn Vivo Görüntüleme: Yüksek çözünürlüklü Bacaları ve Time-lapse Toplama <ol><li> Göz parçaları ile kafatası odaklanın. <ol><li> , Saflaştırılmış, steril su ve bir su daldırma lens kullanarak görüntüleme penceresini doldurmak o su damlasını değecek şekilde indirin. </li><li> Işık kaynağı gibi harici bir lamba kullanarak, mikroskop mercekleri kullanılarak kafatasının üst Odak. </li><li> Merkezi dikiş üzerinde görüntüleme alanını yerleştirin ve bir başlangıç ​​pozisyonu olarak koronal sütür bulmak için kafa arkasına doğru hareket ettirin. </li></ol></li><li> Eksitasyon ve emisyon tabloda belirtilen ilgili florofor etkili uyarı ve tespit izin vermek için mikroskop ayarlayın. NOT: Geleneksel galvanometre tarama kafası LAS-AF yazılım platformu ile çalışan bir Leica SP5 dik konfokal Burada kullanılan iken, prosedür kolayca diğer mikroskop / yazılım platformları çoğaltılmış olabilir. Burada kullanılan objektif Leica HCX IRAPO L 25x W / 0.95 NA bDiğer üreticilerin ut eşdeğer lensler uygun büyütme ve yüksek NA mevcuttur <ol><li> 512 x 512 piksel hem XY görüntülerin yanı sıra 400 Hz 3D Z-yığını ve set görüntüleme hızı ve çözünürlüğü yakalamak için bir moduna yazılımı yerleştirin. NOT: Kurulum ve donanım burada 620 mikron bir görüş alanı neden ve bu diğer platformlarda farklı olabilir. </li><li> Birden fazla kanal / parça yanı sıra toplama yöntemi en azından yığınlarının mümkünse veya çerçeveler arasında var ayarlarını değiştirmek için ayarlanmış sağlamak, yakalanan edebiliyoruz, böylece yazılımı ayarlayın. Her yığının edinimi sonunda lazer aydınlatmasını kapatmak, 3 bağımsız çekim ayarlarını ayarlayın. Not: üç kanal kanallar arasında çapraz etkiyi azaltmak için, bu işlem için gerekli olacaktır. </li><li> Kurulum iki foton SHG kemik sinyali (840 nm uyarım; 400-440 nm emisyon) için ilk ardışık tarama için ayarlar; MP lazer için deklanşörü açın ve M sağlamak% 25 ve lazer açıldığında - P kazancı ve ofset doğru kurulum vardır, lazer güç 12.5. Tek dedektör gibi uygun bir PMT seçin ve beyaz rengini değiştirmek. Not: Mevcut bir parlak, daha derin sinyal elde etmek için ne zaman uygun filtreler ile NDD dedektörler kemik tespiti için kullanılmalıdır. </li><li> Tekrar kanal kurulumu kombine otofloresansı için GFP kanal için kullanılan prosedür (543 nm uyarma; 560 - 600nm emisyon) ve DiD (633 nm uyarım; 650-720 nm emisyon) ikinci ayarları altında iki uygun PMT kullanarak, tarayın. Otofloresansı için yeşil ve DiD için kırmızı kanal rengini değiştirin. Not: Otomatik-floresan kanal iki kanal yerleştirilmiştir edilir DiD pozitif hücrelerin daha kolay algılanmasını sağlar gibi yeşil kullanılarak - autofluorescent hücreler nedeniyle iki kanal süre olmak üzere sarı / turuncu renkte görünür DiD hücreleri sadece onlar sadece görünür beri kırmızı olarak görünür kanal DiD. Otomatik floresan kanalgörüntüleme amaçları GFP kanal ile karışıklığı önlemek için, kullanıcının, bu farklı bir renk değiştirilebilir istediği, ancak, yalnızca, bu karşılaştırma için kullanılan herhangi bir son analizde kullanılmaz. </li><li> Son olarak kurulum GFP için üçüncü ve son tarama (488 nm uyarma; 500-530 nm emisyon); Gerekli ve sonra etrafında% 15 488 nm lazer çizgisinin lazer gücünü ayarlamak veya lazer için uygun bir seviye sadece aktif dedektörü olarak uygun bir PMT seçmek ve yeşil onun PseudoColor değiştirmek, kullanıldıkları takdirde obtüratör açık olduğundan emin olun. </li><li> Seçilen kanalın bir önizleme taraması başlar ve dedektör Kazancı ayarlamak ve optimal pozlama için Ofset için bir &#39;Canlı&#39; görüntüleme modunu etkinleştirin. Sıralı penceresinde her tarama için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Kolayca yeniden bu çok kanallı tarama ayarları kaydedin. NOT: Bu kullanıcı sonraki oturumlarda ayarlarını yeniden sağlar. </li></ol></li><li> &#39;Mark a olarak adlandırılan çok-pozisyon yakalama etkinleştirinnd gösterdi yazılım &#39;bulun ve koordinat noktalarını sıfırlayın. </li><li> Merkez ve koronal sütür arasındaki kesişme başlayarak, kemik görüntüleme alanını taramak, hem otoflüoresanı kullanarak kemik iliği alanının derinliğini tarama (sözde yeşil renkli) ve DiD (pseudo-kırmızı renkli) bir bileşik görüntüsü. NOT: autofluorescent hücreler her iki kanal mevcut olabilir ve etiketlenmiş hücreler kompozit görüntü kırmızı-tek hücreler olarak görünür MUYDUNUZ ise kompozit görüntü sarı / turuncu görünecektir. </li><li> Bir hücre tespit edildiğinde, Mark &quot;sol taraftaki Yeni Pozisyon simgesini ekle&quot; Find &quot;penceresinde tıklayarak aracını yeni bir koordinat konumuna (x, y ve z) olarak işaretlemek &#39;Mark ve bulun&#39; . </li><li> Görüş mevcut alan incelendiğinde edildiğinde, sol / sağ / yukarı / aşağı ya bakış bir alanın evre mesafe taşımak. Yavaş yavaş th solundaki bütün görüntüleme pencere alanının etrafında çalışma, görüş her alan için bu işlemi tekrarlayıne merkezi sütür, fare burnuna doğru hareket. Merkezi dikiş çatallanma görünürde sonra, dikiş sağ tarafına gidin ve (koronal sütür doğru, yani) ters yönde sol tarafı taramaya işlemi tekrarlayın. Kullanarak ilgi herhangi bir yeni hücre koordinatlarını işaretleyin &#39;Mark ve Bul&#39; aracı. </li><li> Görüntüleme penceresi Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, &#39;Mark ve bul kullanmak noktaları gözden aracını (istenen noktayı seçin ve tek tek her noktasını gözden). Her pozisyon için her hücrenin Z-yığını üst ve alt Set, (birçok yazılım platformları boşluk yakalayan azaltır her pozisyon için bağımsız z-yığınları yapmak için izin verecektir). Her noktası için, netleme ve aşağı ve 3D z-yığın yakalama için üst ve alt Z pozisyonlarını ayarlayabilir ve bireysel noktasını güncelleştirmek &#39;Mark ve bul. 5 um Z-Stack aralığını ayarlayın ve uygun bir kalite her sıralı tarama kanal için ortalama: Çizgi or Çerçeve ortalama. NOT: ortalamasına taramalarının sayısını arttırmak iktisap süreyi artırır. </li><li> Tüm tarama işlemine başlarken tarafından ilgi her bir nokta için yüksek kaliteli referans yığını Edinme (genellikle oldukça &quot;Capture&quot; den &#39;Başlat&#39; olarak anılacaktır). NOT: Bu tarama gelecekte yüksek hızlı görüntüleme için bir referans olarak hareket edebilir. </li><li> Bir kez, yüksek kaliteli tarama ile tamamladı yakalanması için bir time-lapse ayarını etkinleştirin. </li><li> Time-lapse ayarları, istenilen uzunlukta (örneğin, 5 saat) 5 dakika ve genel çalışma süresi için zaman aralığını ayarlayın. Genel tarama için bu ayarları &#39;Uygula&#39;. NOT: Bir 5 dakika zaman atlamalı aralığını sağlamak için bu tarama süresini azaltmak amacıyla, bir, ortalama için kullanılan taramaları sayısını azaltmak 512 x 512 piksel çözünürlüğünü sınırlamak, gerekli faz düzeltme ile (çift yönlü için tarama dönüştürmek gerekebilir ) Her iki tarama yön align ve / veya 600 Hz veya daha fazla (daha fazla 600 tarama hızını arttırmak içinHz) gösterdi yazılım platformu için görüntüleme alanının yakınlaştırma neden olacaktır. Bu sıralı görüntüleme modu, başlangıçta bir yüksek kaliteli görüntü yığını elde etmek için kullanılan iken, eşzamanlı kazanım time-lapse görüntüleme sırasında hızını artırmak için kullanıldığına dikkat etmek de önemlidir - bu ekstra yerleştirir kanallar arasında bazı hafif çapraz konuşma neden olabilir doğru ayrılmış referans yığınlarının ilk yakalama üzerinde önemi. </li><li> (Göstermiştir yazılımında &#39;Başlat&#39; düğmesine tıklayarak önceki gibi) görüntüleme başlayın. NOT: kurumasına ve vital bulguları ve ısıtma-pad sıcaklığını izlemek değil, düzenli, gerektiğinde fareyi aşırı doz için dikkatli olmak, daha küçük dozlarda uygulanması ile anestezi uygun seviyesini korumak amacını sağlamak için su kontör emin olun boyunca. </li><li> Bittiğinde, rektal prob ve h telleri sağlanması, sahibinden lensi kaldırın ve daha sonra mikroskop aşamasından tutucusunu çıkarınmat yeme zarar görmezler. </li><li> Sahne sahibinin baş kısmını sökün ve dikkatlice fareyi çıkarın. Servikal dislokasyon kullanarak fare itlaf ve kafatası kapalı takarak metal kafa-parça kaldırın. Verilerin diske kaydetmek ve daha sonra analiz için sunucusuna aktarmak. Not: baş parçası, ideal olarak birkaç saat boyunca aseton içinde daldırma ve son olarak kalan çimento kapalı sürtünme ile temizlenir. </li></ol>

<ol><li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hematopoietic+Stem+Cell+Niche+at+a+Glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The Hematopoietic Stem Cell Niche at a Glance.</a> J Cell Sci. 124 (Pt 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Wang, L. D., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Niches+in+the+Origination+and+Differentiation+of+Hematopoietic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic Niches in the Origination and Differentiation of Hematopoietic Stem Cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 643-655 (2011).</li>
<li>Schofield, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relationship+Between+the+Spleen+Colony-forming+Cell+and+the+Hematopoietic+Stem+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells%22%5BJournal%5D)">The Relationship Between the Spleen Colony-forming Cell and the Hematopoietic Stem Cell.</a> Blood Cells. (1-2), 7-25 (1978).</li>
<li>Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+Between+Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Interaction Between Satellite Cells and Skeletal Muscle Fibers.</a> Development. 109 (4), 943-952 (1990).</li>
<li>Cotsarelis, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-retaining+Cells+Reside+in+the+Bulge+Area+of+Pilosebaceous+Unit%3A+Implications+for+Follicular+Stem+Cells%2C+Hair+Cycle%2C+and+Skin+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Label-retaining Cells Reside in the Bulge Area of Pilosebaceous Unit: Implications for Follicular Stem Cells, Hair Cycle, and Skin Carcinogenesis.</a> Cell. 61 (7), 1329-1337 (1990).</li>
<li>Doetsch, F., Caillé, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+Zone+Astrocytes+are+Neural+Stem+Cells+in+the+Adult+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subventricular Zone Astrocytes are Neural Stem Cells in the Adult Mammalian Brain.</a> Cell. 97 (6), 703-716 (1999).</li>
<li>Palmer, A. E., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Calcium+Signalling+Using+Genetically+Targetable+Fluorescent+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring Calcium Signalling Using Genetically Targetable Fluorescent Indicators.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1057-1065 (2006).</li>
<li>Lewandowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Cellular+Imaging+Pinpoints+the+Role+of+Reactive+Oxygen+Species+in+the+Early+Steps+of+Adult+Hematopoietic+Reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo Cellular Imaging Pinpoints the Role of Reactive Oxygen Species in the Early Steps of Adult Hematopoietic Reconstitution.</a> Blood. 115 (3), 443-452 (2010).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Imaging+of+Specialized+Bone+Marrow+Endothelial+Microdomains+for+Tumour+Engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo Imaging of Specialized Bone Marrow Endothelial Microdomains for Tumour Engraftment.</a> Nature. 435 (7044), 969-973 (2005).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+Tracking+of+Individual+Haematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cells+in+their+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal Tracking of Individual Haematopoietic Stem/Progenitor Cells in their Niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Xie, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Functional+Haematopoietic+Stem+Cell+Niche+Using+Real-time+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Detection of Functional Haematopoietic Stem Cell Niche Using Real-time Imaging.</a> Nature. 457 (7225), 97-101 (2009).</li>
<li>Köhler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Cellular+Dynamics+and+Endosteal+Location+of+Aged+Early+Hematopoietic+Progenitor+Cells+Revealed+by+Time-lapse+Intravital+Imaging+in+Long+Bones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Altered Cellular Dynamics and Endosteal Location of Aged Early Hematopoietic Progenitor Cells Revealed by Time-lapse Intravital Imaging in Long Bones.</a> Blood. 114 (2), 290-298 (2009).</li>
<li>Schultz, S. R., Kitamura, K., Post-Uiterweer, A., Krupic, J., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Pattern+Coding+of+Sensory+Information+by+Climbing+Fibre-evoked+Calcium+Signals+in+Networks+of+Neighboring+Cerebellar+Purkinje+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial Pattern Coding of Sensory Information by Climbing Fibre-evoked Calcium Signals in Networks of Neighboring Cerebellar Purkinje Cells.</a> J Neuroscience. 29 (25), 8005-8015 (2009).</li>
<li>Lo Celso, C., Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Imaging+of+Transplanted+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Mouse+Calvarium+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo Imaging of Transplanted Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Mouse Calvarium Bone Marrow.</a> Nat Protoc. 6 (1), 1-14 (2011).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Transplantation+of+Hematopoietic+Stem+Cells+%28HSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs).</a> Journal of Visualized Experiments. (2), e157(2007).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso,, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Seeing+to+Believing%3A+Labelling+Strategies+for+in+vivo+Cell-tracking+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From Seeing to Believing: Labelling Strategies for in vivo Cell-tracking Experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relationship+Between+Bone%2C+Hemopoietic+Stem+Cells+and+Vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The Relationship Between Bone, Hemopoietic Stem Cells and Vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Nombela-Arrieta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Haematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cell+Localization+and+Hypoxic+Status+in+the+Bone+Marrow+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Haematopoietic Stem and Progenitor Cell Localization and Hypoxic Status in the Bone Marrow Microenvironment.</a> Nature Cell Biology. 15, 533-543 (2013).</li>
</ol>

Açıklanacak bir şey yok.

Ne gerçekleştirildi? Bu protokol Fare kalvaryal kemik iliğinde arıtıldı FACS göçünü ex vivo etiketli nakledilen HSPCs izlemek için hızlandırılmış çok boyutlu görüntüleme kullanır. Tek nakledilen hücrelerin tanımlanması elde edilmiştir ve bu yüksek doğruluk ile zaman (saat) uzun süreler boyunca takip edilmiştir. Solunum kaynaklı hareket eserler minimize edilmiş ve hücreler tekrar tekrar uzun bir zaman boyunca reimaged edilmiştir. Gelecek tarifi nedir? Tekniğinin geliştirilmesi kısaltmak ve Not (fare kurtarma işlemini kolaylaştırmak için bir hafta veya daha fazla ve bu izofluran gibi gaz anestezik kullanımı boyunca, birden fazla gün görüntüleme için izin kurtarma deneylerde doğru ilerleme olabilir: Kurtarma deneyler kesinlikle gerektirir Steril cerrahi koşullar ve uygun analjezik uygulanması). DevBir in vivo boyaların daha büyük bir renk paleti yanı sıra, aynı zamanda, çok-etiketleme deneyleri kolaylaştırmak kemik iliği içinde hücre-hücre etkileşim daha fazla bilgi sağlar ve gelecekte daha karmaşık deneyler için sağlayacak hematopoietik hücrelerin etkili genetik etiketleme e Gelişim. Ayrıca, birden çok kemik iliği yapıları ve stroma bileşenlerinin eş zamanlı etiketleme HSPC nişler yer alan olayların bir daha tam bir resim sağlayacaktır. Hızlandırılmış filmlerin görüntü kararlılığı ayrıca stabilize edici mikroskop hem de görüntü tarihi algoritmaları kullanarak numune ve postacquisition sıcaklık gradyanları minimize preacquisition geliştirilebilir. Sınırlamalar: Açıklanan tekniği bazı sınırlamalar sunar. Enjekte edilebilir anestetiklerin uygulamasının ardından farelerin hayatta kalma süreleri önceden tahmin edilemez ve bu bireysel yanıtına bağlı olarak tecrübe komplikasyonlara çok kolayanestezik. Fare anestezi kurtarmak için ve fare ideal zaman atlamalı görüntüleme süresini sınırlayarak, tahsil edilecek olup olmadığını dikkatlice planlamak önemlidir genellikle, bir görüntüleme oturumu artık zordur. Enjekte anestezik kullanılması, her görüntüleme oturumda sürebilir zaman sınırlar. Bu anestezik küçük bir doz EÖ tarafından anestezi uzatmak mümkün olsa da, zor bu doğru ve fareyi doz aşımı in vivo görüntüleme erken fesih en sık nedenlerinden biridir gerçekleştirmek olduğunu. Izofluran&gt; 2 saat uzun idare nadiren başarılı sonra gaz anestezi fare ancak hızlı iyileşme, daha az toksik ve daha uzun bir ilk görüntüleme oturumları için izin verir. Tekniğin diğer kısıtlılığı nedeniyle hızla görüntüler elde etmek için gerekliliğine, çok noktalı time-lapse görüntüleme sırasında elde edilebilir görüntülerin sınırlı çözünürlük. Fokal sürüklenme veya alanı ile birleştiğinde, (diski atlar) Yukarıdaki ussed, hücrelerin izleme zorlaştırabilir. Alternatif yöntem Karşılaştırma: HSPCs genellikle DiD lipofilik boya ile etiketlenmiş, ancak [16] gözden gibi DiR ve DII boyalar, eşdeğer alternatifler ve diğer hücre boyalar sürece yeterince parlak kullanılabilir vardır. Hücrelerin ex vivo etiketlendirmesi HKH&#39;lerin uzun vadeli fonksiyonunu etkilemez gösterilmiştir olsak da, bu hücre bölünmesiyle seyreltildi ve neredeyse sınırlama (ya da herhangi bir başka kimyasal boya) sahiptir. HKH&#39;lerin transplantasyonu izleyen ilk günlerde çoğalırlar yana, bu hücreler için gürültü oranı sinyal hızla bozulur. Genetik manipülasyon ve floresan proteinleri ifade ile hücrelerin etiketlenmesi endojen floresan proteinleri kafatası kemik yoluyla tespit edilebilir bir sinyal üretmek için yeterince yüksek seviyelerde ifade edilir sürece, uygulanabilir bir alternatif bir yöntemdir. Alternatif techn vardırMevcut iques kendi yararları ve sınırlamaları ile, kemik iliği alanı içinde her HSPCs görüntülenmesine gerçekleştirmek için. Konfokal görüntüleme cerrahi matkap ile tibia ve kemik minesinin incelmesi ekspojurlar takip ederken, fiber optik tabanlı görüntüleme cihazlarının yerleştirilmesi, uzun kemiklerde [8] kemik iliği sulandırma görüntüleme için izin [12] HSPCs ikamet detaylı görüntülerini üretti uzun kemiklerin çevresel alanları. Bununla birlikte, bu yöntemler, çok daha fazla invasif burada tarif edilen ve bu nedenle aynı fare içinde aynı kemik iliği alanda odaklanarak görüntüleme tekrar ederiz mani olandan bulunmaktadır. Ayrıca, bu teknikler geniş bir çevre dokuda hasar kaçınılmaz cevap veren gözlenen hücrelerini etkiler olasıdır. HSPCs kesilmiş, çatlak uyluk [11] üzerinde yer lamelleri ile kısa bir süre için görüntülenmiş olan, üzerine HSPCs doku bu sert, ancak hazırlama etkisi değil, Clear, ve teknik tek bir zaman noktasında elde etmek için gözlemler benzersiz kullanılmıştır. Sabit kemikler lekeli, seri bölüme ayrılır ve elde edilen görüntüleri damar atmalarını kullanılan, özellikle mükemmel 3D çözünürlük sağlayan bir 3D modeli yeniden inşa edilmiştir [17], ve son zamanlarda Lazer Tarama Cytometry (LaSC) kantitatif elde etmek için kullanılır olmuştur in situ HSPCs tedbirler hakkında, [18] immunboyama tarafından vurgulanan, ancak hücreler davranışları hakkında herhangi bir zamansal bilgi sağlayamıyoruz. Yeni yöntemin tarif edilen teknikler 4D hücrelerin izlenmesi için 3 boyutlu olarak iyi bir çözünürlük, yeterli geçici örnekleme bir kombinasyonunu sağlar ve bu nedenle, kemik iliği ile etkileşim HSPCs uzun süreli izleme elde etmek için ideal bir yaklaşım sağlar, göreceli olarak-invaziv mikroçevresinin.

Kök hücre nişler gibi koku ampul, kas lifi, saç folikülü şişkinlik veya MSS subventricular 4-7 olarak yıllardır 3 tanınan ve de birçok dokuda karakterize edilerek rağmen hematopoetik kök hücreler (HKH&#39;lerin) ve kemik iliği mikro arasındaki etkileşimler ( BM) için hala tam olarak bağlı kemiğe boyunca tek hücrelerin yanı sıra dokunun kendisinin çok sıvı gözlemlemek zor anlaşılır. Farklı hücre tipleri ve düzenleme sinyallerinin karmaşık bir ağ sükunet arasındaki dengeyi düzenlemekten sorumlu olduğunu, kesip çıkartma veya HSC ya da mikro-kendisi stromal hücreler içindeki belirli genlerin aşırı ifade göre fonksiyonel çalışmalarda da bir dizi aracılığıyla, gösterilmiştir , çoğalma, genişleme ve HKH&#39;lerin 1-2 farklılaşması. HKH&#39;lerin ve nişler arasındaki karışma yalnızca doğrudan gözlem yoluyla derinlemesine anlaşılabilir. Bu ach olduğunusadece mikroskopi açısından mevcut teknolojiyi birleştirerek gelişmiş görüntüleme protokollerinin gelişmesine ievable sayesinde, aynı zamanda numune tutucu çözümleri ve toplama yazılımı. Fare kalvaryal kemiklerin BM bölmesine aktarılmıştır hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) tek hücre çözünürlüklü canlı görüntüleme aşılanması HSPCs daha olgunlaşmamış hücrelerin SDF-1 ve VCAM-1-pozitif damarların 8-9 yakınma ve bu lokalize olduğunu gösterdi onların döl 10 daha uzak ise GFP pozitif osteoblastik hücreler (osteoblast kısıtlı kollajen 1α promotör GFP sürücüler hangi Col2.3-GFP transgenik fare hattı,) 20 mikron - 15 içinde bulunur. Benzer gözlemler disseke ve kırık femur kemikleri 11&#39;den ve inceltilmiş tibeal kemiklerden 12 elde edildi. Kalvarial kemik iliği Görüntüleme th içinde HSPCs doğrudan görselleştirme ulaşmak için en az invaziv bir yaklaşım kalırEIR yerli mikroçevresinin. Herhangi bir canlı numune, görüntüleme ile, numune hareketi için gereksiz bozulmaları önlemek için mümkün olduğu kadar yine örnek tutmak için içsel bir ihtiyaç vardır. Nefes Kalvaryal kemik iliği görüntülerken kaçınılması gereken fare kafa salınım hareketleri neden olur. Onlar frontal kemiklerin engel çünkü beyin görüntüleme ve elektrofizyoloji örneğin kullanılan geleneksel stereotaktik sahipleri, kalvaryumun görüntüleme için uygun değildir. Canlı görüntüleme ve elektrofizyoloji çalışmaları 13 sırasında sıkıntı en aza indirmek için kullanılan bir fare tutucu başlayarak, 2 komponent tutucu bir ile tutuş sağlayan büyük bir koluna bağlı bir görüntüleme penceresi oluşturmak için fare kafasına sabitlenen küçük bir parça ile geliştirilmiştir mikroskop sahne sıkıca tutan ağır taban plakası. Hala yerinde kafasını hareketsizleştirerek ve yeterli m ortadan kaldırırken, fare kafatası kafa parçasını emniyete ücretsiz nefes sağlarnefes nedeniyle Hareketleri. Tutucu gövdeye baş parçasını birbirine bağlayan &quot;kilit ve anahtar&quot; mekanizması penceresinin büyüklüğü bu nedenle ameliyat basitleştirilmesi, konumlandırma netliği kadar artan en aza sağlar, ve aşamaya taban plakasının uygun Mikroskop doğru hizalama için izin verir. Doğru hareketli hücreleri izlemek için, çok noktalı bir zaman atlamalı protokol süresi noktaları arasındaki 5 dk aralıklarla zamanla hücrelerin izlenmesini sağlamak için tasarlanmıştır. Burada, etiketli MUYDUNUZ HKH&#39;lerin col2.3GFP osteoblasitc muhabiri fareler 10,14 enjekte ve yaklaşık 20 saat sonra görüntülenmiş. Tasarlanmıştır ve birden fazla saatlik bir süre içinde aynı bölgelerde hızlı çok noktalı zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için gereken görüntüleme ayarları detaylı olarak tarif edilmektedir fare tutucu.

<table><tbody><tr><td>Ketamin (Narketan 100 mg / ml)</td> <td>Vetoquinol</td><td>407575 0107 C</td><td>Bunun yerine başka anestezikler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Medetomidin (Domitor 1 mg / ml)</td> <td>Elanco</td><td>134800-2</td><td>Bunun yerine başka analjezikler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Canlı DiD hücre etiketleme çözümü</td><td>Roche Products Ltd.</td><td>V22887</td><td>Diğer renkler de mevcuttur ve gerekirse kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Lacrilube oftalmik merhem</td><td>Allergan</td><td>n/a</td><td>yerel veteriner Kemdent</td></tr><tr><td>"Diamond Carve" cam iyonomer çimentosu</td><td>Associated Dental Products Ltd. tarafından</td> reçete ile temin edilebilir Kemdent <td>SUN527</td> aracılığıyla <td>A3 gölgesini kullanıyoruz, ancak herhangi bir çimento tonu kullanılabilir.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>çoklu eşdeğer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsülin şırıngaları</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>SS10M3109</td><td>1 ml, 31 G</td></tr><tr><td>Fare tutucu</td><td>Harvard Aparatı</td><td>340031</td><td>Koni tipi (küçük)</td></tr><tr><td>Otoklavlı forseps ve makas</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT577 AGT5034</td><td>İris makası - 90 mm; Dumont HP cımbız (0,06 mm uç)</td></tr><tr><td>Tartı teknesi ve çimento karıştırıcı</td><td>VWR</td><td>611-1996/231-0370</td><td>5 ml tartı teknesi (siyah)/ Ahşap dil bastırıcı</td></tr><tr><td>Leica SP5 motorlu kademeli ve iki fotonlu lazerli dik konfokal mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td> Fiyat <td>teklifi için arayın</td></tr><tr><td>25x su daldırma objektif lensi (NA = 0.95)</td><td>Leica Microsystems</td><td>11506323</td><td>HCX IRAPO L lens</td></tr><tr><td>Özel tasarlanmış fare tutucu</td><td>Imperial College Mühendislik Atölyesi Ayrıntılar</td><td></td><td>için Şekil 1'e bakın</td></tr><tr><td>Rektal termometre problu ısıtma yastığı</td><td>BASi Enstrümantasyon</td><td>FHC-40902/ FHC-40908/ FHC-4090502</td><td>Isı matı/ Kontrol kutusu/ Termometre probu</td></tr></tbody></table>

yetişkin fare kalvaryal kemik İliği içinde hematopoietik kök hücrelerin vivo 4-boyutlu takip

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Sakinleştikten ve çoğalması, kendini yenileme ve farklılaşmış döl üretimi arasında hassas bir denge sayesinde, hematopoetik kök hücreler (HKH&#39;lerin) tüm olgun kan hücresi soylarının ciro korumak. Belirli HSC kaderi açan karmaşık sinyallerin koordinasyon HKH&#39;lerin ve hala anlaşılamamıştır karmaşık kemik iliği mikro, [1-2] arasındaki etkileşim dayanır. Biz çok adım confocal ve in vivo görüntüleme teknikleri iki-foton ile istikrarlı hayvan konumlandırma için yeni geliştirilen bir örnek tutucu birleştirerek, yüksek çözünürlüklü 3D HSPCs içeren yığınları ve onların çevresindeki nişler elde etmek ve zamanla onları izlemek nasıl mümkün olduğunu açıklamak Çok noktalı time-lapse görüntüleme yoluyla. Yüksek çözünürlüklü görüntüleme tespit ex vivo olarak etiketlenmiş hematopoetik kök ve progenitör hücreler (HSPCs) kemik iliği içinde ikamet verir. Dahası, multi-noktalı time-lapse 3D görüntüleme, odaha hızlı alma ayarları ile btained, HSPC hareket ve HSPCs ve stroma hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimleri hakkında doğru bilgi sağlar. GFP pozitif osteoblastik hücrelerde ilgili olarak HSPCs takibi bu yöntemin örnek teşkil eden bir uygulama olarak gösterilmiştir. Bu teknik, fare kemik iliği calvarium mekan içinde herhangi bir ilgi, uygun şekilde etiketlenmiş, hematopoietik ve stromal hücre izlemek için kullanılabilir.

Yapılan özel bir kalvaryumun görüntüleme penceresi dahil yüksek hassasiyetli fare tutucu ölümcül ışınlanmış alıcı farelerde (Şekil 1A) enjekte FACS arıtılmış, etiketli HSPCs uzun süreli görüntüleme sağlar. Tipik olarak, 15 ile enjekte edilmesinden sonra - 20 bin işaretli hücrelerin, 8-15 hücreler kafatası ertesi gün kemik iliği görüntüleme alanı içinde genellikle tanınabilir. Tespit HSPCs (Şekil 1C ve film) 4D zaman atlamalı filmleri izledi 120 mikron kalınlığında, (Şekil 1B), - İşte yaklaşık 90 kemik iliği alanları HSPC içeren tek hücreli çözünürlüklü 3D yığınları kazanmak için nasıl gösterilir. Diş çimento optimal hazır değilse, optimumun altında sonuçlar, örneğin, su ve tutucunun üst tepesinde edilebilir olsa da, sigara kapalı alanlardan akabilir, elde edilir, herhangi bir zaman süresi olan daldırma objektif değildir su içine siyah f yol açar<html> Rames. Görüntülerin bazı sürüklenme ani atlar yol ancak fare ilerleyici ayrılması yol açan, uygun olmayan çimento yapışma ile vurgulanmış ve kurmak görüntüleme düzensizlikler tarafından edilebilir nedeni fare tutucunun malzemelerin termal genleşme kaçınılmazdır time-lapse görüntüleme sırasında odak. Daha önce görüntülenmiş pozisyonları Revisiting zaman çok noktalı time-lapse görüntüleme sırasında Drift de sahne hareketleri yanlışlıklar neden olabilir. Zaman atlamalı filmleri Drift ve kekeme eserler görüntü kaydı algoritmaları kullanarak düzeltilebilir. Tablo 1. Uyarma ve emisyon ayarları. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:204px;"> Renk Kanal </td><td style="width:213px;"> Uyarma </td><td style="width:208px;"> Emisyon </td></tr><tr><td style="width:204px;"> GFP </td>13px; &quot;&gt; 488 nm </td><td style="width:208px;"> 500-530 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> Otofloresans </td><td style="width:213px;"> 543 nm </td><td style="width:208px;"> 560-610 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> DiD </td><td style="width:213px;"> 633 nm </td><td style="width:208px;"> 640-700 nm </td></tr><tr><td style="width:204px;"> SHG </td><td style="width:213px;"> 840 nm (MP) </td><td style="width:208px;"> 400-450 nm </td></tr></tbody></table><img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51683/51683fig1highres.jpg" width="600" /> Fare kalvaryumun içinde HSPCs in vivo 4D görüntülemede Şekil 1.. Deney (A) Taslağı (B - C).. Elde edilmiş sonuçlara örnekler (B), 3 boyutlu bir yığından 2B dilim (toplam derinliği 114 um), kollajen kemik (beyaz) bir sinyal ihtiva eden etiketli MUYDUNUZ hücreler (kırmızı) , autofluorescent cells (sarı) ve osteoblastik hücreleri (yeşil). Ölçek çubukları:. Osteoblastik hücreleri (yeşil) yakınına göç bir etiketli MUYDUNUZ HSC (kırmızı) gösteren bir 4D time-lapse film 100 mikron (C) 2D dilimleri. Noktalı çizgi, hücre yer değiştirmesini ortaya koymaktadır. Ölçek çubukları: 50 um (B) ve 100 um (° C). NOT:. Video makalede sırasında gösterilmiştir (C) time-lapse edinimi elde film <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51683/51683fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Bu prosedürün genel amacı, hematopoetik kök ve progenitör hücreleri içeren yüksek çözünürlüklü 3B yığınlar elde etmek ve bunları çok noktalı zaman ayarlı görüntüleme yoluyla zaman içinde izlemektir. Bu işlem, öncelikle hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin veya HSC'lerin lipofilik bir boya ile işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından HSC'ler, alıcı bir fareye enjekte edilir.Fare, hayvanın stabil bir şekilde konumlandırılması için özelleştirilmiş bir başlık ve örnek tutucu kullanılarak mikroskopiye hazırlanır. Ardından, hematopoetik kök ve progenitör hücre nişlerinin yüksek çözünürlüklü yığınları elde edilir ve HSPC'leri içeren birden fazla kemik iliği bölgesinin zaman ayarlı görüntülemesi yapılır; nihayetinde, kemik iliği boşluğundaki HSC'lerin lokalizasyonunu ve hareketini göstermek için intravital konfokal ve iki foton mikroskopi kullanılır. Bu tekniğin, kemik iliği kesitleri üzerindeki immünofloresans gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bilgileri dört boyutlu bir ölçekte, yani üç boyut artı zaman şeklinde yakalayabilmemizdir.Bu tekniğin etkileri, hematopoetik kök hücrelerin doğru şekilde işlemesini garanti etmek için onları kemik iliği içerisinde nereye yönlendirmemiz gerektiğini anlamaya yardımcı olduğu için hematolojik hastalıkların tedavisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntemle ilgili fikrimiz ilk olarak, HSPC'leri zaman içinde takip edebilmenin ne kadar kritik olduğunu fark ettiğimizde ortaya çıktı. Bu yöntem, kök hücrelerin nerede bulunduğunu ve zaman içinde nasıl davrandığını öğrenmek istediğimiz kök hücre nişi alanı ile ilgili tüm sorularımızı yanıtlamamıza yardımcı olmaktadır.Başlamak için, bu laboratuvar tarafından daha önceki bir geo videosunda gösterilen ve metin protokolünde referans verilen yöntemle hematopoetik kök ve progenitör hücreleri hasat edin. Ardından, hücre süspansiyonuna beş micromolar son konsantrasyonda lipofilik boya DID ekleyin. Boyanın çözeltiden çökelmesini ve hücrelerin etiketlenememesini önlemek için süspansiyonu hemen vorteksleyin.Hücreleri yıkamak için 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. İlk olarak 500 ×g'de beş dakika santrifüj yapın ve sıvıyı dökün. Ardından hücreleri 200 µL PBS içinde yeniden süspanse edin ve bir insülin şırıngasına toplayın.Hücre süspansiyonunun tamamının fareye uygulanabilmesi için, iğne ölü boşluğu bulunmadığından, geleneksel şırıngalar yerine insülin şırıngası kullanılması önerilir; böylece hücreler, letal dozda ışınlanmış fareye kuyruk ven enjeksiyonu yoluyla enjekte edilir. İlk olarak fareyi sıcak bir bölmeye yerleştirin.Kuyruk veni vazodilate olmuş şekilde görünür hale geldiğinde, fareyi sabitleyiciye yerleştirin. İğneyi dikkatlice kuyruk venine kaydırın. Hücreleri ven içine enjekte edin.Enjeksiyon sırasında herhangi bir direnişle karşılaşılmamalıdır. Fareyi gece boyunca bekletin. Hücrelerin kemik iliği boşluklarına göç etmesini sağlamak için fareyi anesteziye alın ve derin anestezinin başlangıcını petal refleksi aracılığıyla izleyin.Kafa derisinin üst kısmını, bir mendil üzerine damlatılmış %70 ethanol ile silin. Farelerin gözlerine ethanol kaçmamasına dikkat edin. Görüntülenecek kalvaryum bölgesini açığa çıkarmak için, forsepsle deriyi yukarıda tutarken kulakların arasında, başın arka kısmında küçük bir insizyon yapın.Makası derinin altına kaydırın ve istenen görüntüleme alanının dışı boyunca nazikçe kesin. Kemiği nemli tutmak için açığa çıkan kemiği steril PBS ile nemlendirilmiş steril bir pamuklu çubukla silin. Bu işlem, görüntüleme kalitesini etkileyebilecek aşırı kurumayı ve skar oluşumunu önler.Ardından, bir dental cement yeterli miktarda, bir whey boat içinde macun kıvamına gelene kadar karıştırın. Bunu, kafatasına takılacak olan otoklav başlığının alt yüzeyine hızla uygulayın. Çimento donmadan önce, görüntüleme alanına herhangi bir dental cement bulaşmadığından emin olarak başlığı farenin kafatasına yerleştirin ve donmasını bekleyin.Kuruma aşamasında çimentoyu bozmamaya dikkat ederek, kafatasını nemli tutan az miktarda intra hidrojeli uygulayın. Ardından baş parçasını tutucuya takın ve yerine sabitleyin. Kanalların tutucu çentiklerine tam oturduğundan emin olarak vidayı kullanın.Mikroskoba aktarmadan önce hidrojeli steril pamuklu çubuklarla temizleyin. Ardından, tutucuyu mikroskop tablasına yerleştirin ve ısıtma matını farenin altına konumlandırın. Rektal termometre probunu yerleştirin ve her şeyi yapışkan bantla tablada sabitleyin.Farelerin anestezi altındayken gözlerinin kurumamasını sağlamak için gözlerine küçük bir damla oftalmik pomad sürün. Anestezi altındaki fare, görüntüleme işlemi sırasında hiçbir zaman gözetimsiz bırakılmamalıdır. Okülerler aracılığıyla kafatasına odaklanın.İlk olarak, su daldırma lensi kullanarak kalvaryum görüntüleme penceresini saflaştırılmış steril su ile doldurun. Lensi, su damlasına temas edecek şekilde aşağı indirin. Mikroskop okülerlerini kullanarak kafatasının üst kısmına odaklanın.Görüntüleme alanını merkezi sütür üzerine konumlandırın ve koronal sütürü bulmak için başın arka kısmına doğru ilerleyin. Başlangıç konumu olarak, yazılımı hem XY görüntüleri hem de üç DZ yığını yakalama moduna getirin. Görüntüleme hızını 400 hertz, çözünürlüğü ise 512 by 512 piksel olarak ayarlayın.Yazılımı birden fazla kanalın yakalanacağı şekilde ayarlayın ve toplama yöntemini yığınlar veya kareler arasında ayarları değiştirecek şekilde belirleyin. Üç bağımsız yakalama ayarı oluşturun. Her yığının kazanımı sonunda lazer aydınlatmasını kapatın.Ardından, iki fotonlu ikinci harmonik üretimi kemik sinyali için ilk ardışık taramayı kurun. Çok fotonlu lazerin panjurunu açın ve çok fotonlu lazer kazancı ile ofsetinin doğru şekilde ayarlandığından emin olun. Ayrıca, lazer gücünün 12.5 ile 25% arasında olduğunu ve lazerin açık olduğunu kontrol edin.Tek dedektör olarak uygun bir PMT seçin ve rengi beyaza çevirin. İkinci ayar altında, kombine otofloresans ve DID için kanal kurulum prosedürünü tekrarlayın. İki uygun PMT kullanarak tarama yapın.Kanal rengini otofloresans için yeşile, DiD için ise kırmızıya değiştirin. Son olarak, GFP tespiti için üçüncü ve son taramayı ayarlayın. 488 nanometrelik lazer hattının lazer gücünü yaklaşık %15'e ayarlayın. Tek aktif dedektör olarak uygun bir fotomultiplier tüp veya PMT seçin ve bunun yalancı rengini yeşile değiştirin.Seçili kanalın önizleme taramasını başlatmak için canlı görüntüleme modunu etkinleştirin; optimal pozlama için detektör kazancını (gain) ve ofsetini ayarlayın. Bunu ardışık penceredeki her tarama için tekrarlayın ve bu çok kanallı taramaların ayarlarını kolayca yeniden kullanmak üzere kaydedin. Ardından, bu yazılımda "mark and find" (işaretle ve bul) olarak adlandırılan çok konumlu yakalama özelliğini etkinleştirin ve koordinat noktalarını sıfırlayın.Ardından, merkezi ve koronal sütürlerin kesişim noktasından başlayarak kemik görüntüleme alanını tarayın. Kompozit görünüm kullanarak, hem otofloresans hem de DID ile kemik iliği alanının derinliğini tarayın. Bir hücre tespit edildiğinde, işaretleme ve pencerenin sol tarafındaki yeni konum ekle simgesine tıklayarak burayı yeni bir koordinat konumu olarak işaretleyin.Mevcut görüş alanı incelendiğinde, sahneyi bir görüş alanı mesafesinde kaydırın. Bu işlemi her görüş alanı için tekrarlayın. Merkezi sütürün solundaki tüm görüntüleme penceresi boyunca, farenin burnuna doğru ilerleyerek kademeli olarak çalışın.Merkezi sütür bifurkasyonu göründüğünde, sütürün sağ tarafına geçin ve prosedürü tekrarlayın. Sol tarafı ters yönde tarayın. Mark and find aracını kullanarak ilgilendiğiniz yeni hücrelerin koordinatlarını işaretleyin.Noktaları gözden geçirmek için, her konumdaki her hücrenin etrafında bir Zs yığınının üst ve alt sınırlarını belirleyin. Her nokta için yukarı ve aşağı odaklama yaparak üç DZ yığın yakalama işlemi için üst ve alt Z konumlarını ayarlayın. İşaretle ve bul kısmındaki ilgili noktayı güncelleyin, Zack aralığını 5 µm olarak ayarlayın ve her bir ardışık tarama kanalı için ortalamayı uygun bir kaliteye getirin.Tüm tarama prosedürünü başlatarak her ilgi noktası için yüksek kaliteli bir referans yığını elde edin. Yüksek kaliteli tarama tamamlandığında, görüntüleme için zaman atlamalı (time-lapse) ayarı ve zaman atlamalı ayarları etkinleştirin. Zaman aralığını beş dakika ve toplam çalışma süresini istenen uzunluğa ayarlayın.Bu ayarları genel taramaya uygulayın. Bu örnek, üçten fazla noktanın kazanımının nasıl gerçekleştirilebileceğini göstermektedir. Bu ayarlar değiştirilerek, ortalama alma için kullanılan tarama sayısı azaltılıp çözünürlük 512 by 512 piksel ile sınırlandırılarak, beş dakikalık bir zaman atlamalı aralığa izin verecek şekilde tarama süresi kısaltılabilir. Tarama çift yönlü hale getirilerek ve/veya tarama hızı 600 hertz veya üzerine çıkarılarak, başlat düğmesine tıklanıp gösterilen yazılım aracılığıyla görüntüleme daha önce olduğu gibi başlatılır.Görüntüleme tamamlandığında, metin protokolünde detaylandırıldığı şekilde fare ötanazisini gerçekleştirin. Kalvaryum görüntüleme penceresini de içeren özel yapım yüksek hassasiyetli fare tutucu, letal düzeyde ışınlanmış alıcı farelere enjekte edilen işaretli HS PC'lerin uzun süreli görüntülenmesine olanak tanır; burada, yaklaşık 90 ila 120 mikrometre kalınlığındaki HSPC içeren kemik iliği bölgelerinin tek hücre çözünürlüklü 3D yığınlarının 2D kesitleri gösterilmektedir, sinyal kollajenden gelmektedir. Kemik beyaz renkte, DID ile işaretlenmiş hücreler ise kırmızı renkte gösterilmiştir.Otofloresan hücreler sarı renkte, osteoblastik hücreler ise yeşil renkte gösterilmiştir. Burada, A DID ile işaretlenmiş kırmızı renkli bir HSC'nin, yeşil renkteki osteoblastik hücrelerin yakınında göç ettiğini gösteren, tanımlanan HS PC'lerin 40 kat hızlandırılmış bir zaman atlamalı videosu sunulmuştur. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, cerrahi işlem ve ilk görüntüleme yaklaşık bir saatte, ardından zaman atlamalı görüntüleme için gereken süre kadar sürede tamamlanabilmelidir.Bu videoyu izledikten sonra, fare kalfının görüntülemesini kurma ve zaman içinde birden fazla HS PC'yi inceleme konusunda kendinize oldukça güveniyor olmalısınız.

in-vivo-4-dimensional-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Protokol, femoral kemik iliğindeki hücrelerin hareketini in vivo olarak izlemek için kullanılabilecek yeni bir murin femur pencere odası modelini tanımlar. İntravital multifoton floresan mikroskobu, zaman içinde femur kemik iliğinin üç bileşenini (vaskülatür, kollajen matrisi ve nötrofiller) görüntülemek için kullanılır.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Farelerde farklı insanlaştırılmış kemik iliği nişleri oluşturmak ve canlı görüntü oluşturmak için bir yöntem sunulmuştur. İnsan mezenşimal hücreleri tarafından oluşturulan destekleyici niş dayanarak, insan endotel hücrelerinin eklenmesi, insan damarlarının oluşumunu indüklerken rhBMP-2 ilavesi, insan-fare kimerik olgun kemik dokusunun oluşumunu indükler.

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Bu protokol, gen düzenlenmiş hücreler de dahil olmak üzere birkaç hematopoietik veya lösemik kök hücrenin murin ksenogreft modellerinde intrafemoral enjeksiyonunu tanımlar, bu da sadece hücrelerin hızlı ve güvenli bir şekilde nakledilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda kemik iliğinin seri analizlerini de sağlar.

Canlı fareler kullanılarak yapılan basitleştirilmiş intrafemoral enjeksiyonlar, sürekli kemik iliği analizine izin verir

İntravital mikroskopi, doku rejenerasyonu ve tümör gelişimi gibi dinamik biyolojik süreçlerin incelenmesine izin verir. Oldukça dinamik bir doku olan kalvarial kemik iliği, hematopoez ve vasküler fonksiyon hakkında bilgi verir. Biyouyumlu bir 3D baskılı kafa sabitleme implantı kullanmak, tekrarlayan uzunlamasına görüntülemeye olanak tanıyarak doku dinamikleri ve tümör mikro çevresi hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Kalvarial Kemik İliğinde Vasküler Dinamiklerin İntravital Longitudinal Görüntülenmesi

Öğrenin, iki foton ve konfokal mikroskopi kullanarak yetişkin fare kafatası kemik iliğinde hematopoietik kök hücrelerin 4 boyutlu canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, hücre davranışlarını ve niş dinamiklerini gerçek zamanlı izlemeyi mümkün kılar.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Daha fazla video keşfet