Name: Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı Mycobacterium tuberculosis Özel Transkript (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Öğrenin, mesodiseksiyon tekniğiyle formalin sabitlenmiş parafin gömülü dokulardan RNA izolasyonunu. Mycobacterium tuberculosis granülomlarında gen ekspresyon analizi için bu yöntem, enfeksiyon araştırmalarında yeni bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, ve P51OD011104: Yazarlar bu araştırmanın destek için aşağıdaki NIH ödül / subawards kabul etmek istiyorum.

2iD Görüntüleme Yazılımı ile 1. Kalibre Mesodissection Enstrüman 2iD görüntüleme yazılımı bu maddenin geri kalanı için yazılım veya program ya olarak adlandırılacaktır. Bu adımı doğru görüntüyü izlemek yanı sıra birden fazla slayt kareleri uyum için gereklidir. <ol><li> Enstrüman ve bilgisayarı açın. </li><li> Açık yazılım ve &quot;kalibrasyon aracı&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Joystick&#39;i kullanarak sahne seyahat kalibre. Sol üst konuma aşamasına gider. Programda adım 1 altında basın &quot;set&quot;. </li><li> Doğru konumunu indirmek için sahneye taşımak. Programda adım 2 altında basın &quot;set&quot;. </li><li> İlk kafası düzeneğini yükseltmek için &quot;Z-tuşuna&quot; basarak aspirasyon kalibre. Joystick basın &quot;aspire darbe&quot; butonuna ve &quot;diseksiyon&quot; butonuna dalgıç kontrol çubuğu kadar üst pozisyona ulaşır. Programın 3. adımda altında basın &quot;set&quot;. </li><li> Basın &quot;aspirat sıfırlama &amp;# 8221; düğmesine basın. Piston 4. adımda alt pozisyon basın &quot;set&quot; durur kez. </li><li> &quot;Ölçek sekmesine&quot; üzerine tıklayın. </li><li> Boş tarafına kalibrasyon cetvel yerleştirin. </li><li> Gerekirse mikroskop odaklanın. </li><li> Fareyi kullanarak iki ölçek bar arasında bir çizgi çizin. </li><li> 2. adım. Basın &quot;hesaplama&quot; butonuna etiketli kutuda mesafeyi girin. </li><li> &quot;Crosshair&quot; sekmesine tıklayın. 1 motor hızını çevirin. </li><li> Kafa montaj içine xScisor yerleştirin. &quot;Z-ekseni&quot; düğmesine basarak z-ekseni hazır pozisyona alt kafa montaj. NOT: kafası düzeneği üst diseksiyon enstrüman üzerinde büyük bir yapıdır. XScisor bu maddenin geri kalanı için sarf değirmen biti olarak adlandırılacaktır. </li><li> Joystick düğmesine &quot;diseksiyon meşgul&quot; tıklayın. NOT: Bu düğme joystick üstünde yer almaktadır. </li><li> Görsel dönme merkezini tanımlayın. Bunu yapmak için, define ile dönme merkezi üzerinde crosshair merkezini taşımakProgramın adım 1&#39;de d parametresi. Crosshair hizalamak için piksel ayarlamak için &quot;x&quot; ve &quot;y ekseni&quot; barlarda yukarı ve aşağı okları kullanın. &quot;Done&quot; sekmesini tıklayın. </li><li> &quot;Ev&quot; simgesine tıklayın. NOT: Bu sağ üst köşesinde bulunan bir ev görüntüsü ile temsil edilir. </li></ol> 2.. Referans resim oluşturun <ol><li> Sahnede H &amp; E slayt yerleştirin. Slayt üstüne opak kapak yerleştirin. H &amp; E slayt istenen alana joystick&#39;i hareket ettirerek araç sürücü. Oluşturulan görüntü kaydetme. NOT: &quot;yakalama referans&quot; sekmesi veya &quot;teşrih&quot; sekmesi Ya bu adımı tamamlamak için kullanılabilir. </li></ol> 3. Diseksiyon için Doku hizalama <ol><li> Ana ekranda &quot;dokusu disseke&quot; seçeneğini tıklayın. </li><li> &quot;Operatörü&quot;, &quot;diseksiyon katılım numarası&quot;, &quot;referans erişim numarası,&quot; &quot;xScisor barkod numarası&quot; &amp; # doldurun8220; diseksiyon sıvı lot numarası, &quot;&quot; xScisor boyutu &quot;ve&quot; setup &quot;sekmesinde&quot; açıklama &quot;. </li><li> &quot;Doku bulmak&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> İthalat önceden referans görüntü kaydedilir. </li><li> Sahnede 5 mikron kalınlığında bir boyanmadı FFPE slayt yerleştirin. Referans resimde gösterilen ile aynı alana sahne hareket ettirin. &quot;Insert image&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> &quot;Hizalama&quot; sekmesine tıklayın. Boyanmamış görüntü referans görüntüyü hizalamak için fare ve ilişkili okları kullanın. </li></ol> 4. Slayt Annotate <ol><li> &quot;Annotatesekmesindeki&quot; sekmesine tıklayın. </li><li> Microdissected olacak slayt istenilen alanın etrafında bir daire çizmek için fareyi kullanın. </li></ol> 5.. Sarf Mill Bit yükleyin <ol><li> Bir sıvı hareket yukarı ve aşağı birkaç kez pistonu çekerek, burada istenen tampon, PKD tampon ile sarf değirmen biraz doldurun. Emin hava dışlamak olunkabarcıklar. </li><li> &quot;Z-ekseni butonuna&quot; basarak Z-ekseni kaldırın. </li><li> Makinenin içine sarf değirmen biraz yükleyin. Makinenin üst kısmına sarf değirmen biraz kaydırarak bunu böylece sarf değirmen bit siyah çizgi ile alet hatları üzerinde beyaz çizgi. Dalgıç doğru pozisyona indirdi izin vermek için basın &quot;aspirasyon reset&quot; düğmesine basın. NOT: Bu sarf değirmen biraz slayt kolay olmalıdır. Değilse, çentikler doğru hizada olduğundan emin olun. </li><li> Tekrar &quot;Z-ekseni&quot; düğmesine basarak alt Z-ekseni. </li></ol> 6.. Doku teşrih (Şekil 4) <ol><li> &quot;Teşrih&quot; sekmesini açın. </li><li> 1 motor ve aspirasyon hızları çevirin. </li><li> &quot;Show izleme&quot; kutusunu işaretleyin. Not: Bu, kullanıcının diseksiyon işlemi sırasında kesilmiş alan görselleştirmek için izin verir. </li><li> Teşrih etmeye hazır olduktan sonra, butonuna &quot;meşgul&quot; yanı sıra &quot;aspire &amp; # tutmaya devam8221; düğmesine doku incelemek için bir saat yönünün tersine joystick&#39;i hareket ederken. </li><li> Aspirat &quot;tam&quot; sekmesi kırmızıya döner kadar bir saatin tersi yönde incelemek için devam ediyor. </li></ol> 7. Sarf Değirmen biraz boş ve kaldır <ol><li> Sarf değirmen bitinin ucu altında bir 0.5 ul mikrofuge&#39;de tüp yerleştirin. </li><li> Basın &quot;aspirasyon&quot; kontrol çubuğu hızla mikrofuj tüpüne örnek çıkartmak için. </li><li> Kullanılmış sarf değirmen biraz çıkarmak için artan bir güçle basın. </li><li> Pistonu geri çekerek doku fragmanı durulayın. Sarf değirmen biraz içine kalan numuneyi ifade ileri pistonu itin. Doku parçası artık mikrofüj tüpü içinde ihtiva edilecektir. </li></ol> Isıl İşlem Ardından proteinaz K Sindirim 8. Lizleyin Örnek <ol><li> Doku örneği geri için proteinaz K içinde 5 ug ihtiva eden 70 ul TE pH 8.5 ekleyin. </li><li> Programlanabilir ısıtıcı-karıştırıcısı içine örneği yerleştir. </li><li> Aşağıdaki ayara göre programlanabilir ısıtıcı-çalkalayıcı kullanılarak tam sindirim: 1500 rpm&#39;de 30 dakika boyunca 60 ˚ ° C; 1500 rpm&#39;de, 15 dakika boyunca 82 ˚ ° C; ve 450 rpm&#39;de 1 dakika için 25 C ˚. Numune artık alt uygulamaları için hazır. </li></ol>

<ol><li>Fend, F., Raffeld, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+in+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection in pathology.</a> J Clin Pathol. 53 (9), 666-672 (2000).</li>
<li>Esposito, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+techniques%3A+laser+capture+microdissection--increasing+specificity+of+gene+expression+profiling+of+cancer+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Complementary techniques: laser capture microdissection--increasing specificity of gene expression profiling of cancer specimens.</a> Adv Exp Med Biol. 593, 54-65 (2007).</li>
<li>Adey, N., Bosh, D., Emery, D., Birch, L., Parry, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+Paraffin+Embedded+Slide+Mounted+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of Paraffin Embedded Slide Mounted Tissue Sections.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (6), (2012).</li>
<li>Fleischmann, R. D., Alland, D., Eisen, J. A., Carpenter, L., White, O., Peterson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+comparison+of+Mycobacterium+tuberculosis+clinical+and+laboratory+strains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains.</a> J Bacteriol. 184 (19), 5479-5490 (2002).</li>
<li>Russell, D. G., Barry 3rd, C. E., Flynn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuberculosis%3A+what+we+don%27t+know+can%2C+and+does%2C+hurt+us%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tuberculosis: what we don't know can, and does, hurt us.</a> Science. 328 (5980), 852-856 (2010).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesodissection+of+fibrous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22AvanSciBio%22%5BJournal%5D)">Mesodissection of fibrous tissue.</a> AvanSciBio. , (2013).</li>
<li>Paige, C., Bishai, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Penitentiary+or+penthouse+condo%3A+the+tuberculous+granuloma+from+the+microbe%27s+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Penitentiary or penthouse condo: the tuberculous granuloma from the microbe's point of view.</a> Cell Microbiol. 12 (3), 301-309 (2010).</li>
<li>Mehra, S., Alvarez, X., Didier, P. J., Doyle, L. A., Blanchard, J. L., Lackner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granuloma+correlates+of+protection+against+tuberculosis+and+mechanisms+of+immune+modulation+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Granuloma correlates of protection against tuberculosis and mechanisms of immune modulation by Mycobacterium tuberculosis.</a> J Infect Dis. 207 (7), 1115-1127 (2013).</li>
<li>Kaushal, D., Schroeder, B. G., Tyagi, S., Yoshimatsu, T., Scott, C., Ko, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+immunopathology+and+mortality+despite+tissue+persistence+in+a+Mycobacterium+tuberculosis+mutant+lacking+alternative+sigma+factor%2C+SigH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reduced immunopathology and mortality despite tissue persistence in a Mycobacterium tuberculosis mutant lacking alternative sigma factor, SigH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. (12), 8330-8335 (2002).</li>
<li>Mehra, S., Kaushal, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+reveals+extended+roles+of+the+Mycobacterium+tuberculosis+stress+response+factor+sigmaH%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics reveals extended roles of the Mycobacterium tuberculosis stress response factor sigmaH.</a> J Bacteriol. 191 (12), 3965-3980 (2009).</li>
<li>Rohde, K. H., Veiga, D. F., Caldwell, S., Balazsi, G., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+the+transcriptional+profiles+and+the+physiological+states+of+Mycobacterium+tuberculosis+during+an+extended+intracellular+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Linking the transcriptional profiles and the physiological states of Mycobacterium tuberculosis during an extended intracellular infection.</a> PLoS Pathog. 8 (6), (2012).</li>
<li>Fontan, P. A., Voskuil, M. I., Gomez, M., Tan, D., Pardini, M., Manganelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mycobacterium+tuberculosis+sigma+factor+sigmaB+is+required+for+full+response+to+cell+envelope+stress+and+hypoxia+in+vitro%2C+but+it+is+dispensable+for+in+vivo+growth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The Mycobacterium tuberculosis sigma factor sigmaB is required for full response to cell envelope stress and hypoxia in vitro, but it is dispensable for in vivo growth.</a> J Bacteriol. 191 (18), 5628-5633 (2009).</li>
<li>Rustad, T. R., Harrell, M. I., Liao, R., Sherman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enduring+hypoxic+response+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS One. 3 (1), (2008).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarları olduğunu ifşa.

Mesodissection patojenlerin geniş bir dizi neden olduğu patolojik lezyon slaytlardan RNA ekstre uygulanabilir bir tekniktir. Bu kullanıcı görüntü izler ve doğru olarak görüntü hizalayan bir zorunluluktur. Bunu gerçekleştirmek için, alet görüntüleme yazılımı yönleri aşağıdaki kalibre edilmelidir. Diseksiyon disseke ilgi slayt ve alan uyum yoksa, kullanıcı tekrar kalibrasyon gerekir. Diseksiyon sürecinde bir diğer kritik adım, diseksiyon önce (5.1 Adım) kabarcıklar yoksun böyle bir şekilde sarf değirmen biraz yüklemektir....

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal

The corresponding author was changed for the article, <a href="http://www.jove.com/video/51693">A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas</a>.

Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Numuneler geleneksel elle bütün doku veya bir iğne ve neşter kullanılarak slaytlar birinden microdissected edilmiştir. Bu ilgi doku bölümünde ve çevre dokular bölümleri 2 arasında net bir ayrım gerektirir. Moleküler profil teknolojideki gelişmeler sayesinde, hücresel düzeyde doku değerlendirmek için artan bir ihtiyaç söz konusudur. Nedeniyle manuel mikrodisseksiyon sınırlamaları, LCM dahil teknikler daha fazla izolasyon hassasiyet sağlamak için kuruldu. Bu teknik, bir araştırmacı daha sonra, gen ekspresyonu profillemesi gibi alt-deneyleri için kullanılan çeşitli hücre tipleri ve slayt belirli hücre popülasyonlarının, izole sağlar. Alt deneyleri için çok etkili olsa da, LCM sınırlama olmadan değildir. Birincisi, LCM pahalı ve zaman alıcı bir süreçtir. Ayrıca nedeniyle RNA kararsız doğası, genellikle LCM örneklerinden 2 yüksek kalitede RNA elde etmek zordur. Nedeniyle diLCM sadvantages mikrodisseksiyon teknolojisindeki yeni gelişmeler hala bir ekonomik ve zaman hassas bir şekilde araştırmacıların daha fazla sayıda daha erişilebilir hale getirmek için gereklidir. Şu anda mevcut mikrodiseksiyon teknolojide Böyle bir gelişme mesodissection olarak bilinen bir tekniktir. Bu teknikte bir makine değirmen ilgi açıklamalı doku kesiti için kullanılan ve bir tüketim değirmen parça 3 içine emer. Daha sonra, bu numune bir toplama tüpüne aspire edilir ve alt uygulamaları için de kullanılabilir. Bu sistemin avantajı, belirgin olarak daha az pahalı ve zaman duyarlı olmasıdır. Bizim tecrübelerimize göre, sistem on dakika içinde bir akciğer granülom dokusu bölümünün diseksiyon sağlar. Öte yandan, geleneksel LCM olasılıkla işlemini tamamlamak için saat gerektirir. Sistem operatörü açıklama için bir karşılaştırma yanı sıra aracı olarak kullanmak için bir referans slayt yüklemenizi sağlar. Ayrıca bir rapor özetleyen inci oluşturulurdisseke slayt e alanı. Mesodissection iki ana dezavantajı vardır. Birden fazla hücre ayıklanması etkili olmasına rağmen, tek bir hücreyi izole etmek zordur. Buna ek olarak, oluşturulan görüntünün hassas diğer görüntüleme mikroskop kullanıyorsanız kadar net değildir. Tüberküloz (TB) önemli bir enfeksiyon hastalığı tüm dünyada insanlığın katil ve Mtb ile enfeksiyondan sonuçlanır. Mtb aerosollerle maruz kalan bireylerin çoğunda, latent enfeksiyon sınırlıdır. Yılda en az 10 milyon kişi, aktif verem hastalığı 4. sonuçlanır. Latent enfeksiyon esnasında, Mtb granülomlar olarak bilinen patolojik lezyonların içinde bulunur. Dolayısıyla Mtb enfeksiyon sonucu granülom 5 seviyesinde karar olduğu ileri sürülmüştür. Burada mesodissection Mtb neden granülomlarını microdissect için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Kullanılan slaytlarEnfekte rhesus makakların FFPE akciğer dokusundan bulunmaktadır. Bu gösteri amaçla, kendi bütünlükleri içinde granülomlar teşrih edecek. Ayrıca RNA geri dokusundan elde edilebilir olduğunu göstermektedir. Bu teknik, çeşitli örneklerden doku örnekleri uygulanır ve daha sonra aşağı doğru bir çok analizde kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>MeSectr</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Mesodissector</td></tr><tr><td>400 nm xScisors</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Mevcut diğer boyutlar</td></tr><tr><td>THOR</td><td>AvanSci Bio</td><td></td><td>Programlanabilir Isıtıcı-Çalkalayıcı</td></tr><tr><td>NanoDrop2000</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy FFPE ekstraksiyon kiti ve nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>73504</td><td></td></tr><tr><td>Ovation RNA-Seq FFPE Sistemi&nbsp;</td><td>Nugen</td><td>7150</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

kurtarma bir roman mikrodiseksiyon yaklaşımı<em&gt; mycobacterium tuberculosis</emakciğer granülomlara gömülü formalinle sabit parafin dan&gt; Özel transkript

A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas

Diseksiyon bir on yıl için DNA, RNA ve protein düzeylerinde dokuların incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM), bugün kullanılan en yaygın mikrodisseksiyon tekniktir. Bu teknikte, bir lazer fokal dehidre doku bölümü 1 üzerinde uzanan bir termoplastik zarı eritmek için kullanılır. Doku kesiti bileşik daha sonra kaldırılır ve membran ayrılır. Bu tekniği, doku inceleme için başarılı bir şekilde kullanılabilir olmasına rağmen, zaman alıcı ve pahalı. Ayrıca, bu teknik kullanılarak prosedürlerin başarıyla tamamlanması böylelikle, bunun kullanımını sınırlayan, bir lazer kullanılmasını gerektirir. Mesodissection adlandırılan yeni daha ekonomik ve pratik bir yaklaşım mikrodisseksiyonla LCM tuzaklar olası bir çözümdür. Bu teknik, değirmen, bir slayt monte edilmiş doku numunesinden arzu edilen doku MESO-1/MeSectr sistemini kullanmaktadır eşzamanlı olarak arzu edilen bir doku örneği kurtarmak için sıvı dağıtma ve aspirasyon sırasındaBir sarf değirmen biraz. Diseksiyon işlemi başlamadan önce, kullanıcı (FFPE) gömülü formalin sabit parafin (H &amp; E) referans slayt lekeli bir hematoksilen ve eozin ile slayt hizalar. Bundan sonra, operatör, arzu edilen diseksiyon alan annotates ve uygun bir bölümü incelemek için devam eder. Program diseksiyonu arşivlenmiş bir görüntü oluşturur. Mesodissection ana avantajı, bu deneyde nesil örnek kurmak on dakika ortalama alarak, bir slayt incelemek için gerekli kısa sürmesidir. Ayrıca, sistem önemli ölçüde daha düşük maliyetli ve kullanıcı dostudur. Hafif bir dezavantajı, bu lazer yakalama mikroskopisi gibi hassas olmasıdır. Bu yazıda mesodissection Mycobacterium tuberculosis (MTB) neden FFPE granülomlarında slaytları RNA ayıklamak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Anılan protokol FFPE doku slaytlar RNA ayıklamak için yeni bir mesodissection tekniği nasıl kullanılacağını gösterir. Bu protokolün etkinliği çeşitli enfeksiyon aşamalarında Mtb ile enfekte NHP&#39;ın akciğer granülomlarının FFPE slaytlar aracılığıyla gösterilir. 1-3 alet. Şekil 4. görüntüleri Rakamlar diseksiyon sürecinin nasıl oluştuğunu gösteriyor ve yazılım. Tablo 1. tarafından oluşturulan çıkan görüntü Her durum, iltihaplı bir NHP bir gran...

Diseksiyon yaygın doku içindeki DNA, RNA ve protein incelenmesi için kullanılmıştır. Lazer yakalama mikroskobu (LCM) en sık kullanılan yöntem, ancak, yeni bir freze tekniği, mesodissection, son zamanlarda kullanılabilir. Biz mesodissected formalin sabit parafin Mycobacterium tuberculosis granülomlarının gömülü doku slaytlar RNA çıkarma göstermektedir.

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emAkciğer granülomlara Gömülü Formalinle Sabit Parafin dan&gt; Özel Transkript

Microdissection has been used for the examination of tissues at DNA, RNA, and protein levels for over a decade. Laser capture microscopy (LCM) is the most ...

Bu prosedürün genel amacı, formaldehit ile tespit edilmiş ve parafine gömülmüş lamlardan doku mikrodiseksiyonu yapmaktır. Bu işlem, öncelikle temsilci bir Hematoksilin ve Eozin boyama lamından referans görüntü oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adım, karşılık gelen boyanmamış formaldehit tespitli ve parafine gömülmüş lamın cihaz tablasına yerleştirilmesi ve istenen diseksiyon alanının referans görüntü ile hizalanmasıdır.Ardından, diseksiyon alanı işaretlenir ve tek kullanımlık bir erkek uç tampon çözelti ile doldurularak cihaza yerleştirilir. Son adım, işaretlenen dokunun diseksiyonunun yapılmasıdır. Son olarak, diseksiyonla elde edilen dokunun, enfekte Rhesus macacaların akciğer granülomları içindeki mycobacterium tuberculosis'in küresel gen ekspresyon analizi için nasıl kullanılabileceğini göstermek amacıyla RNA ekstraksiyon amplifikasyonu ve R-T-P-C-R kombinasyonu kullanılır.Bu yöntem, mycobacterium tuberculosis'in tüberkülozun farklı enfeksiyon durumları sırasında insan benzeri in vivo nişlerde hangi genleri eksprese ettiği gibi, tüberküloz araştırma alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca bu veriler, patojenlerin düzenlenmesini, bu farklı hastalık durumlarındaki metabolik ve fizyolojik farklılıkları açıklamaya yardımcı olacaktır. Böylece spesifik ilaç hedefleri oluşturulacaktır.Mezo diseksiyon cihazı, iki ID görüntüleme yazılımıyla entegre edilmiş dijital mikroskoba ve XY sahne konumlarını kontrol etmek için bir joystick'e sahiptir. Bu prosedüre başlamadan önce, bir referans görüntü oluşturmak için cihazı beraberindeki makalede açıklanan şekilde görüntüleme yazılımıyla kalibre edin. Öncelikle, hematoksilin ve eozin boyalı veya h ve e lamını sahneye yerleştirin ve lamın üzerine opak bir kapak kapatın.Ardından, joystick'i h ve d lamının istenen bölgesine hareket ettirerek cihazı yönlendirin. Diseke edilecek dokuyu hizalamak için yakalama referans sekmesini kullanarak oluşturulan görüntüyü kaydedin. Ana ekrandaki dokuyu diseke et seçeneğine tıklayın.Kurulum sekmesinde; operatör diseksiyon kayıt numarasını, referans kayıt numarasını veya barkod numarasını, diseksiyon sıvısını, lot numarasını, exci boyutunu ve açıklamasını doldurun. Doku bul sekmesine tıklayın. Daha önce kaydedilmiş olan referans görüntüsünü içe aktarın.Boyanmamış, formalinele sabitlenmiş ve parafine gömülmüş veya FFPE beş mikron kalınlığındaki bir lamı sahneye yerleştirin. Sahneyi, referans görüntüde gösterilen alanla aynı bölgeye getirin.Hizalama sekmesine tıklayın. Referans görüntüyü boyanmamış görüntüyle hizalamak için fareyi ve ilgili okları kullanın. Son olarak, açıklama sekmesine tıklayarak lamı etiketleyin.Mikro diseksiyon yapılacak lamın istenen alanı etrafına fareyi kullanarak bir daire çizin. Bu prosedüre, pistonu birkaç kez akışkan bir hareketle yukarı ve aşağı çekerek, sarf malzeme ucunu istenen tamponla (bu örnekte PKD Buffer) doldurarak başlayın. Hava kabarcıklarını dışarıda bıraktığınızdan emin olun.Z ekseni düğmesine basarak Z eksenini yükseltin. Sarf malzeme erkek ucu cihazın içine yerleştirin. Sarf malzeme erkek ucunu, cihaz üzerindeki beyaz çizgi ile sarf malzeme erkek ucu üzerindeki siyah çizgi üst üste gelecek şekilde makinenin üst kısmına kaydırın.Pistonun doğru konuma indirilmesine izin vermek için aspirasyon sıfırlama düğmesine basın. Önce doku diseksiyonuna başlamak için Z ekseni düğmesine tekrar basarak Z eksenini indirin ve diseksiyon sekmesini açın. Ardından, motor ve aspirasyon hızlarını bire ayarlayın.İzlemeyi göster (show tracking) kutucuğunu işaretleyin. Bu, kullanıcının diseksiyon işlemi sırasında diseksiyon yapacağı alanı görselleştirmesine olanak tanır. Joystick'i saat yönünün tersine hareket ettirirken aynı zamanda etkileşim (engage) düğmesini ve aspirasyon düğmesini basılı tutun.Aspirat dolana ve sekme kırmızıya dönene kadar saat yönünün tersine doğru diseksiyon işlemine devam edin. Öncelikle diseksiyon örneğini toplamak için, ekseni yükseltmek amacıyla Z ekseni düğmesine basın, ardından 0,5 µL mikro santrifüj tüpünü sarf malzemesi erkek uç kısmının altına yerleştirin ve örneği mikro santrifüj tüpüne boşaltmak için aspirasyon kontrol çubuğuna hızla basın. Doku parçası artık mikro santrifüj tüpünün içinde olacaktır.Kullanılmış sarf mal ucunu çıkarmak için aspirasyon kontrol çubuğuna artırılmış bir kuvvetle basın. Bu videoda gösterilen protokol, mycobacterium tuberculosis veya MTB ile enfekte olmuş, çeşitli enfeksiyon aşamalarındaki Resus Maca'lardan akciğer granülomlarını mikrodiseke etmek için kullanılmıştır. Referans görüntü, aktif enfekte bir reus Maca'dan alınan H ve E boyalı bir granülomu ve diseke edilecek ilgi alanının yeşil ile işaretlenmiş halini göstermektedir.Ortadaki görüntü, diseksiyon öncesindeki beş mikron kalınlığındaki ilgili boyanmamış FFPE lamını göstermektedir. Alanlar yazılım kullanılarak hizalanmış ve ilişkili ilgi alanı yeşil ile çerçevelenmiştir. Sağdaki görüntü ise aynı boyanmamış FFPE lamının diseksiyon sonrası halini betimlemekte olup, diseksiyon yapılan alan mavi ile temsil edilmiştir.Ardından, her enfeksiyon durumundaki mezo-disekte granülomlardan RNA ekstrakte edilmiş olup, bu tablo sonuçları göstermektedir. RNA konsantrasyonu NanoDrop kullanılarak belirlenmiştir. Daha sonra RNA amplifiye edilmiş, saflaştırılmış ve ters transkribe edilerek CD N-A-R-T-P-C-R sonuçları elde edilmiştir; 16 s ribozomal alt birim ile ilgili sonuçlar, MTB ribozomal alt birim 16 s'in ve dolayısıyla MTB'nin varlığını doğrulamaktadır.Bu prosedür takip edilerek, mikrodiseksiyon örneklerinde standart olarak CDC 1551 suşundan elde edilen MTB genomik DNA'sı kullanılmıştır. Genomik, transkriptomik ve proteomik hakkında ek soruları yanıtlamak amacıyla DNA, RNA ve protein ekstraksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, akciğer granülomlarındaki FFPE örneklerinin nasıl mikrodiseke edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Bu prosedür yalnızca MTB ile enfekte akciğer granülomları ile sınırlı değildir, diğer patojenlerin neden olduğu lezyonlara da uygulanabilir.

a-novel-microdissection-approach-to-recovering-mycobacterium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu protokol, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü biyopsi dokusunda sitomegalovirüsün qPCR tespitini tanımlar, bu da hızlı, hassas, spesifik ve belirsiz hematoksilen ve eozin veya immünohistokimyasal boyama paternlerini yorumlamak için yararlıdır.

QPCR Formalinle sabit, Parafin-gömülü Biyopsi Doku sitomegaloviral DNA tespiti için bir Hassas ve Hızlı Yöntem mi

İnsan tüberkülozu enfeksiyonu, in vitro olarak modellenmesi zor olan karmaşık bir süreçtir. Burada, bağışıklık hücrelerinin göçü ve fizyolojik bir ortamda erken granülom oluşumu da dahil olmak üzere enfeksiyon sırasında meydana gelen dinamikleri özetleyen yeni bir 3D insan akciğer dokusu modelini açıklıyoruz.

Fonksiyonel Araştırmaları 3D İnsan Akciğer Doku Modeli<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Enfeksiyon

Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Burada, LC/MS analizi ile birleştiğinde lazer yakalama mikrodiseksiyon dağınık şekilde ölçmek-akciğer tüberkülozu granülomlar içinde uyuşturucu dağıtımı için bir iletişim kuralı'nı açıklar. Yaklaşım ilaç konsantrasyonları yüksek uzaysal detay dokularda miktarının için geniş uygulanabilirliği vardır.

Akciğer tüberkülozu lezyonlar lazer ilaçların kayma miktar yakalamak mikrodiseksiyon sıvı Kromatografi Kütle spektrometresi (LCM-LC/MS)

Balgamın ısı inaktivasyonundan sonra yapılan tüberküloz moleküler bakteriyel yük testini tanımladık. Isı inaktivasyonu balgam örneklerini enfeksiyöz olmayan hale getirir ve tüberküloz moleküler testleri için 3 laboratuvarları kapsama ihtiyacını ortadan kılmaktadır.

Tüberküloz Moleküler Bakteriyel Yük Analizi (TB-MBLA)

Akciğer kesitleri oluşturmak için vibratom ve agaroza gömülü akciğer dokusu kullanan bir doku işleme tekniği geliştirdik, böylece akciğer mimarisinin yüksek çözünürlüklü görüntülerinin elde edilmesine izin verdik. Spesifik akciğer yapısal belirteçleri kullanarak uzamsal protein ekspresyonunu gözlemlemek için immünofloresan boyama kullandık.

Multipleks Floresan Görüntüleme için Agaroz Gömülü Akciğer Dokusunun Otomatik Vibratom Kesiti

Floresan mikroskobu ile analiz için akciğer hava yollarındaki mantar sporlarının doğal yerleşimini koruyan bir mantar patogenez modeli için bir yöntem sunuyoruz.

Hava Yollarındaki Mantar Sporlarının Mekansal Dinamiklerini Koruyan Murin Akciğerlerini Görüntülemek için Etkili Yöntem

Manuel IBEX yöntemi ile düşük maliyetli, çok yönlü bir foto ışınlama tekniğinin uygulanması, önemli doğal otofloresan ile insan dokusunun en iyi şekilde görüntülenmesini sağlar. Bu protokol, ters çevrilmiş bir mikroskop, yaygın olarak bulunan reaktifler ve görüntü hizalama ve işleme için açık kaynaklı yazılım kullanılarak arşivlenmiş klinik örneklerden çoğullanmış, tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini ayrıntılarıyla açıklar.

Yinelemeli Beyazlatma için Optimize Edilmiş İş Akışı, Yüksek Otofloresan Klinik Numunelerin Çok Yönlü Görüntülemesini Genişletir

Bu protokol, in vitro/in vivo fonksiyonel tahliller, transkriptomik ve hesaplamalı analiz dahil olmak üzere murin CAF'lerini kültürleme, manipüle etme ve analiz etme yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir. Ayrıca, insan meme kanseri tümörlerinden oluşan bir koleksiyondan lazer yakalama mikro diseke stromal ve epitel bileşenlerinin halka açık transkriptomlarını analiz etmek için geliştirilen web tabanlı bir platformu tanımlar.

Moleküler ve Hesaplamalı Çalışmalar için Araçlar Olarak Fare Meme Tümörlerinden Kanserle İlişkili Fibroblastlar

Bu protokol, paraformaldehit sabitlenmiş, Optimal Kesme Sıcaklığı bileşen gömülü fare karaciğer dokusunun tanımlı histolojik bölgelerinden RNA'yı lazer yakalama mikrodiseksiyonu kullanarak izole etme yöntemini tanımlar; böylece hedefe yönelik aşağı akım gen ekspresyonu analizi mümkün olur.

RNA analizi için paraformaldehit sabitli fare karaciğer dokusunun lazer yakalama mikrodiseksiyonu

Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.

Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda

Öğrenin, mesodiseksiyon tekniğiyle formalin sabitlenmiş parafin gömülü dokulardan RNA izolasyonunu. Mycobacterium tuberculosis granülomlarında gen ekspresyon analizi için bu yöntem, enfeksiyon araştırmalarında yeni bilgiler sunar.

Kurtarma Bir Roman Mikrodiseksiyon Yaklaşımı

Daha fazla video keşfet