Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Aşağıdaki deneyin amacı, transmisyon elektron mikroskobu ile inceleme yapılabilmesi için biyolojik veya diğer materyallerin karbon platin numune replikalarını oluşturmaktır. Bunu başarmak için, çift ve tek replika olarak hazırlanan numuneler, buz kristali oluşumunu sınırlamak amacıyla ultra hızlı dondurma hızlarına tabi tutulur. Ardından dondurulmuş numune, yüksek vakum altında sıvı azot sıcaklıklarında uzaktan manipülasyonla kırılarak lipid çift tabakası boyunca membran bölünür ve böylece bir hücre dışı yüzey ile sitoplazmik yönle yakın bir yüzey oluşturulur.

İsteğe bağlı ek bir adım olarak; soğutma mikrotom kolunun numune tablasının üzerine yerleştirilerek bir sıcaklık farkı oluşturulmasıyla, kırılmış numunenin yüzeyindeki suyun süblimleşmesi sağlanır ve böylece alt katmandaki özellikler ortaya çıkarılır. Ardından, kırılmış yüzey üzerine karbon ve platinyum buharlaştırması yapılarak bir replika oluşturulur.

Orijinal numune, iletim elektron mikroskobu numune ızgarası üzerine aktarılan replikadan sindirilir. Son olarak, iletim elektron mikroskobu ile inceleme yapıldığında hücre membranlarının, moleküler dizilimlerin ve nanomalzemelerin üç boyutlu yapısal detaylarını göstermek için dondurma kırılması ve dondurma aşındırması yöntemi kullanılır. Bu tekniğin, ultra ince kesitlerin incelenmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ilgilenilen nesnelerin elektron mikroskobu çözünürlüğünde üç boyutlu olarak görüntülenebilmesidir.

Bu yöntem, hücre zarlarının boyutsal ve yapısal özellikleri ile moleküler ve nanomalzeme dizilimlerinin organizasyonu gibi hücre ve moleküler biyoloji ve nanoteknoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Benzer çalışmaların önemli keşiflerle beraber ökaryotik protistler üzerinde gerçekleştirildiğini, ancak insan sağlığıyla ilgili benzer temalara sınırlı ilgi gösterildiğini fark ettiğimde bu yöntem için ilk fikri edindim. Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde, donma kırılması-donma kenarı (freeze fracture-freeze edge) için biyolojik örneklerin hazırlanması ile başlayın.

Hassas uçlu pensetler ve/veya küçük çaplı şırınga iğneleri kullanarak, işlenecek numuneye uygun boyut ve şekilde altın veya bakır numune destekleri seçin. Numunenin küçük parçalarını metal numune desteğinin üst kısmına yerleştirin. Tekil replikalar için, filtre kağıdı ile desteğin kenarındaki sıvıyı çekerek numunenin sıvı içeriğini yapışkan, hafif tutkal benzeri bir kıvama getirin.

Çift replika oluşturmak için, stub üzerindeki dokuyu küçük ayarlı şırınga iğneleri kullanarak bir tümsek haline getirin. Başka bir stub'ı ters çevirin, tam olarak ilk stub'ın üzerine konumlandırın ve numune yüzeyine hafifçe yerleştirin. Böylece bir sandviç yapısı oluşturulur.

Numuneyi iki destekten (stub) dışarı doğru bastırmayın. Ardından, iki yalıtımlı çift hazneli kabı sıvı azotla doldurun. İlk kap, ticari olarak temin edilen bir tüpten küçük bir hacimdeki propan gazını sıvılaştırmak için kullanılan küçük bir kuyucuğa sahip metal bir direği barındırır.

İkinci kap, dondurulmuş numunelerin sıvı nitrojen altında kısa süreli olarak tutulmasını sağlayan bir bölmeli saklama kabıdır. Propanı yalnızca bu kullanım için sertifikalandırılmış bir kimyasal çeker ocakta kullanın. Propan patlayıcı olduğu için dış kaynaklı ateşleme kaynaklarından kaçınmaya, düşük sıcaklıklara karşı koruyucu kıyafetler kullanmaya ve yeterli havalandırmayı sağlamaya dikkat edin.

Temas halinde donma yanıklarına neden olabilir ve boğucu bir maddedir. Nozulun propana yerleştirildiği silindir kullanılarak, silindir vanası iyice açılır ve gazın, mümkün olan en kısa sürede sıvılaşacağı ilk kabın haznesine akması sağlanır. Numune tutucu ince uçlu pensle alınır ve birkaç saniye boyunca ilk kaptaki sıvılaştırılmış gaza daldırılır.

Ardından hızlıca ikinci sıvı azot bekleme kabına aktarın. Örnekler dondurulduğunda, dondurma kırılması cihazına aktarılmaya hazır olana kadar sıvı azot altında saklayın. Altın örnek saplarını, sıvı azot altında kitapçık tipi, çift replika örnek tutucuya veya kıskaç düzeneğine yerleştirin ve örnek haznesine konumlandırılmaya hazır olana kadar burada muhafaza edin.

Hazne yüksek vakuma ulaştığında ve tabla sıvı azot sıcaklığına indiğinde, pompayı kapatın, hazneyi bükün ve monte edilmiş numune uçlarını mümkün olan en kısa sürede numune tablası üzerine yerleştirin. Ardından pompayı tekrar açarak yüksek vakumu yeniden tesis edin ve numune tablası sıcaklığını -100 °C'ye ayarlamak için elektronik tabla ve kol sıcaklık kontrollerini kullanın. Ayrıca, mikrotom kolunu sıvı azot sıcaklığına getirmek için kola sıvı azot yönlendirin.

Yüksek vakum sağlandıktan sonra, negatif 100 °C'lik bir tabla sıcaklığı ve sıvı azot sıcaklığındaki mikrotom kolu ile çift replika numune tutucu uzaktan açılarak numune tutuculardaki numuneler kırılır. İsteğe bağlı ek bir adım olarak, kırılmanın ardından alttaki özellikleri ortaya çıkarmak için numuneler aşındırılabilir. Aşındırma işlemini gerçekleştirmek için, numunelerin yüzeyini tıraş etmek amacıyla mikrotom kolundaki bir kıskaçta tutulan jilet kullanın. Gerçek hücre yüzeylerini, hücre dışı matrisi ve/veya moleküler yapıları ortaya çıkarmak için suyu süblime etmek amacıyla soğuk mikrotom kolunu bir ila birkaç dakika boyunca kırılmış yüzeylerin üzerine konumlandırın.

Ardından, platin karbon elektron veya direnç tabancasını aktifleştirin ve kırılmış yüzey üzerine 30 ila 45 derecelik bir açıyla ince bir platin karbon tabakası buharlaştırın. Bu işlem genellikle yaklaşık 15 ila 20 saniye sürer; karbon elektron veya direnç tabancasını aynı şekilde aktifleştirin ve replikaya destek sağlamak amacıyla kırılmış numune yüzeyine doğrudan tepeden, 90 derecelik açıyla ince bir karbon tabakası buharlaştırın. Replika oluşturma, gölgelendirme ve karbon stabilizasyon işlemleri tamamlandığında bu işlem de genellikle yaklaşık 15 ila 20 saniye sürer.

Vakum pompasını ve hazneyi kapatın ve numune tutucuyu cihazdan çıkarın. İnce uçlu bir pens yardımıyla, her bir altın numune tabakasını çift replika kitapçık kelepçesinden çıkarın ve spot plaka içindeki bir su yüzeyine nazikçe indirmeden önce birkaç saniye boyunca çözülmeye bırakın. Replikaları, ya ince bir tel halka ya da ince uçlu pensle tutulan geleneksel bir bakır elektron mikroskobu ızgarası kullanarak yönlendirin ve %50 sülfürik asit içinde %5 sodyum dikromat içeren başka bir spot plakaya bir ila birkaç saat süreyle aktarın. Bu banyo, replikadaki gerçek biyolojik numune materyalini sindirir.

Sindirimi tamamlandığında, replikayı tekrar temiz bir su yüzeyine aktarın ve standart bir bakır elektron mikroskobu ızgarası üzerine geri alın. Replika destek ızgaralarını, yıllarca stabil kalacakları ticari olarak temin edilebilen ızgara kutularında saklayın. Dondurma kırılması veya aşındırma replikalarının nazikçe işlenmesi veya ultrastrüktürel incelemesi için, replikaları tipik olarak 50 ile 80 kilovolt arasındaki bir hızlandırma voltajında transmisyon elektron mikroskobunda inceleyin.

İlgili görüntüleri standart TEM filmiyle veya her bir ökaryotun tabanındaki hücre membranında bulunan yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera ile kaydedin. Silya ve kamçı, silya şaftını çevreleyen ve siliyer kolye olarak bilinen sarmal ENC zincirleri şeklinde organize olmuş membrana ilişkili partikül dizileridir. Kliyojenez geçiren epitel hücrelerin lüminal kenarında özelleşmiş membran partikül dizileri görülür.

Bu partikül dizileri, gelişmekte olan ve olgun silyaların tabanında yer alan yeni oluşmuş siliyar kolyeleri temsil eder. Çeşitli epitel dokularda yapılan dondurma kırığı çalışmaları, bazolateral sınırların apikal kısmını çevreleyen, birbirine bağlanan şerit ve oluk yapılarından oluşan karmaşık bir organizasyonu ortaya koymaktadır. Epitel hücre membranlarından yapılan kırıklar, şeritler şeklinde görünen sıkı bağlantıların plazma kırık yüzlerini açığa çıkarırken, hücre dışı kırık yüzleri ise tamamlayıcı oluklar sergiler.

Gap eklemleri (geçiş bağlantıları), çeşitli dokuların dondurma kırılması preparasyonlarında görülür ve plazma kırılma yüzeylerindeki yoğun partikül dizileri ile hücre dışı kırılmadaki tamamlayıcı çukurlar şeklinde temsil edilir. Burada, derin aşındırmalı hızlı dondurma ve rotasyonel gölgelendirme örneği gösterilmiştir. Epitel hücrenin sitoplazmasından kırılmış olduğu ve ok başlarının arkasında bir plazma kırılma yüzeyinin belirgin olduğu görülebilir.

Sonraki aşındırma işlemiyle ortaya çıkarılan gerçek bir hücre yüzeyi. Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde yaklaşık üç saat süren bir döngüde gerçekleştirilebilir ve bir ila üç numune elde edilebilir. Bu prosedürü uygularken, bireysel adımların birbirine çok bağımlı olduğu ve tek bir adımdaki hatanın, geliştirme sonrası sonucu inceleme ve değerlendirme için yetersiz kılabileceği unutulmamalıdır.

Bu teknik, hücre ve moleküler biyoloji alanındaki araştırmacıların, genetik mutasyonların hücrelerde patolojik durumları ve hastalıkları tetikleyen yapısal anomalilere nasıl yol açtığını keşfetmelerinin önünü açmıştır.