Name: Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Öğrenin biyolojik örnekler için dondurma-kırma ve dondurma-asitleme tekniklerini kullanarak iletim elektron mikroskobisinde ultra yapısal detayları görüntülemeyi. Bu yöntem membran yapılarını ve nanomalzemeleri üç boyutlu olarak incelemeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu sunum, Uçuş Görevlisi Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nden JLC'ye ve Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı'na verilen Klinik Yenilikçi Ödülü ile desteklenmiştir. Bu makalede açıklanan araştırma, Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi'ndeki Çevre Tıbbı, Astım ve Akciğer Biyolojisi Merkezi ile CR83346301 İşbirliği Anlaşması yoluyla tamamen veya kısmen Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı tarafından finanse edilmiş olsa da, Ajansın gerekli akran ve politika incelemesine tabi tutulmamıştır. ve bu nedenle Ajansın görüşlerini yansıtmak zorunda değildir ve herhangi bir resmi onay çıkarımında bulunulmamalıdır. Ticari isimlerin veya ticari ürünlerin belirtilmesi, kullanım için onay veya tavsiye teşkil etmez.

Freeze-kırık / Freeze-rölyefler için Biyolojik Örneklerinin 1. Hazırlık <ol><li> 1 saat süre ile 0.1 M fosfat tampon maddesi içinde bir geleneksel sabitleyici EM formülasyon örneğin% 2 glutaraldehid +% 2 paraformaldehid kullanın. Biyolojik dokuların primer fiksasyonu gerçekleştirmek için. NOT: önceden tespit edilmeden örneklerinin bazı türleri dondurmak için istenebilir bir husussa da, genel kan kökenli patojen önlemler numune insan dokusu oluşur uygun tespit mecburi kılmaktadır. </li><li> Birincil tespit sonra, en fazla 1 saat süre ile 0.2 M sukroz ile takviye edilmiş aynı tampon maddesi içinde örnek yıkayın. </li><li> 1 saat daha fazla bilgi için, 0.1 M fosfat tamponu içinde% 25 gliserol içeren bir dondurarak saklama çözeltisi için numune aktarın. </li></ol> Freeze-kırık Advance 2. Donma ve Örneklerinin Depolama <ol><li> Uygun boyutu ve numune için şekil seçin altın veya bakır numune taslakları işleniyor (Şekil 4 </stRong&gt;). </li><li> Iyi dereceli forseps ve / veya bir metal örnek, çubuk üzerine numunenin küçük ebatlı şırınga iğneleri konumun küçük fragmanların kullanılması. <ol><li> , Bir yapışkan için numunenin sıvı içeriğini azaltmak hafifçe filtre kağıdı ile saplama kenarından sıvı alımı ile tutkal karışımı gibi. </li><li> Tek kopyaları için, saplama üzerinde doku bir höyük oluşturmak için küçük ebatlı şırınga iğneleri kullanın. Çift kopyaları için, tam olarak saplama üzerinden başka bir taslaktır ve konumu ters ve bir sandviç (Şekil 5A) oluşturarak örnek yüzeyine hafifçe yerleştirin. İki taslakları arasından dışarı örneği basmayın. </li></ol></li><li> Sıvı nitrojen ile iki izole edilmiş bir Dewar kabı doldurmak. NOT: İlk kap, bir ticari olarak temin edilebilir bir silindir (Şekil 5B) &#39;den gelen propan gazı küçük bir hacim sıvılaştırılması için kullanılan küçük bir kuyu metal içeren bir yazı barındırmaktadır. İkinci gemi için kısa gemi tutma / bölümlenmiş bir depolamaly sıvı azot altında donmuş numuneler sürdürmek. <ol><li> Propan kuyuda yer alan silindir sıkma enjektörü kullanılarak, silindir valfini açmak ve gazın sıvılaştırılması olan ilk kabın kuyunun içine akmasına izin verir. NOT: DİKKAT !! PROPAN İLETİŞİM AÇIK YARALANMA DONMA VEREBİLİR, PATLAYICI OLDUĞU VE BİR boğucudur. Sadece bu tür kullanımı, düşük sıcaklıklara karşı koruyucu giysiler kullanarak, aynı zamanda yabancı tutuĢmayı önlemek için özen ve yeterli havalandırma korumak için sertifikalı bir kimyasal kaputu propan kullanın. </li><li> Mümkün olduğu kadar çabuk, örnek, iyi derecedeki forseps ile bağlayın ve sonra hızlı bir şekilde sıvı azot içinde ikinci tutma aracına (Şekil 5B) aktarmak için bir kaç saniye için birinci kap içinde likid gazın içine dalma al. </li><li> Numuneler dondurulmuş sonra, hazır olana kadar, sıvı azot altında saklamak dondurularak kırılmış bitki aktarmak için kullanılır. Genişletilmiş için daha geniş bir depolama sıvı azot Dewar kabına aktarın taslaklarıistenirse, ancak bakım depolama taslakları çözülme izin vermemek için alınmalıdır. </li></ol></li></ol> Freeze-kırık 3. Operasyon Çalgı ve Numune İşleme <ol><li> Pirinç tutucu ve yükleme odasına numuneleri <ol><li> Bir kitapçık tipi çift çoğaltma numune tutucu içine altın örnek taslakları yükleyin veya sıvı azot altında cihazı kelepçe ve numune odasının (Şekil 6) Pozisyona hazır kadar orada korumak. </li><li> Odası, yüksek vakum (yaklaşık 2 x 10 -6 mbar) elde etti ve kademeli sıvı azot sıcaklığına soğutulmuş edildiğinde, pompa kapatmak odasına havalandırma ve mümkün olduğunca çabuk numune masanın üzerine monte edilmiş numune taslakları konumlandırmak . </li><li> , Pompa açın yüksek vakum yeniden ve mikrotom kol ve bri için örnek tablo -100 ° C sıcaklık ve doğrudan sıvı azot ayarlamak için elektronik sahne ve kol sıcaklık denetimlerini kullanınSıvı azot sıcaklığa ng. </li></ol></li><li> Kırılma sürecidir <ol><li> Sıvı azot sıcaklığında yüksek vakum, -100 ° C &#39;bir sıcaklıkta ve mikrotom kolu sağlanması üzerine, uzaktan böylece numune üzerindeki bağlar örnekleri kırılma çift kopya numune tutucuyu açmak için (dondurularak fracture_movie1.mov). </li><li> Dağlama aşağıdaki kırık yönelik örneklerin durumunda, tıraş mikrotom kolunda bir kelepçede muhafaza edilen bir jilet kullanın (yani, kırılma) aşama 3.2.1 yerine numunelerin yüzeyi (dondurularak etch_movie2.mov). </li><li> Ilave dondurularak gravür adım yapılacak ise, bir kaç dakika için bir yayın çatlak yüzeyler üzerinde soğutuldu mikrotom kolu yerleştirin. NOT: kırık yüzeyinden Bu manevra süblime (yani, aşındırma) su. Bu manevranın etkisi fra ek olarak, su, süblimleştirme yolu ile gerçek hücre yüzeyleri, hücre dışı matris ve / veya molekül yığınları ortaya çıkarmaktırcture zarların lipit ikili tabakasına geçen yüzleri. </li></ol></li><li> Metal gölgeleme ve çoğaltma desteği buharlaşma elektron tabancaları kullanılarak <ol><li> Platin / karbon veya elektron tabancası direnç etkinleştirme ve 30º&#39;lik bir açıdan çatlak yüzeyi üzerinde platin / karbon ince bir tabaka halinde (yaklaşık 2 nm) buharlaşmasına izin verin - 45 °. 20 saniye - Bu, tipik olarak yaklaşık 15 gerektirir. </li><li> Adım 3.3.1 olarak karbon elektron ya da direnç silah etkinleştirin ve yineleme destek vermek için tepeme (90 °) den kırık numune yüzeyine karbon ince bir tabaka buharlaşır. 20 saniye - Bu, tipik olarak yaklaşık 15 gerektirir. </li></ol></li><li> Kopyalarından Alma <ol><li> Çoğaltma gölgelenmesi ve karbon stabilizasyon işleminin tamamlanmasından sonra, vakum pompası devre dışı bölmesinin havalandırılması ve numune aletten sökün. </li><li> Iyi dereceli bir çift forseps kullanarak çift her altın örnek saplama kaldırmakçoğaltma kitapçık / kelepçe ve yavaşça bir nokta plaka (Şekil 7) bir su yüzeyine saplama indirmeden önce birkaç saniye çözülme sağlar. Not: su yüzeyinin üzerine yüzer yapışkan numune materyali içeren karbon / çoğaltma platin. </li><li> Ince tel bir halka ya da ince forseps dereceli ve bir kaç saat için bir% 50 sülfürik asit içinde,% 5 sodyum dikromat ihtiva eden bir başka nokta plakasına transferi ile yapılan geleneksel bir bakır ızgara elektron mikroskobu kullanılarak kopyaları manevra. NOT: Bu banyo kopyadan gerçek biyolojik örnek malzeme sindirir. Tam mukavemeti maddeleri ağartma dikromat / sülfürik asit çözeltisi için ikame edilebilir. </li><li> Sindirim tamamlandığında, temiz su yüzeyine geri çoğaltma aktarmak ve standart bir bakır elektron mikroskobu ızgara üzerine almak. (NOT: Replikasyonlar sindirim esnasında daha küçük parçalara bölünmesini olabilir ama daha çok küçük maketler önemli bilgiler içerebilir ve retr olmalıuygulaması hedeflenmektedir ve muayene.) onlar nazik kullanımla yıllarca stabil kalır piyasada mevcut ızgara kutular ızgaraları destekleyen saklayın çoğaltma. </li></ol></li></ol> Freeze-kırık / aşındırma Replicas 4. ultrastrüktürel incelenmesi <ol><li> 80 kV -, tipik olarak 50 &#39;den itibaren artan bir voltajı bir transmisyon elektron mikroskobunda göster kopyaları. </li><li> Standart TEM film ya da yüksek çözünürlüklü bir dijital kamera ile ilgili görüntüleri kaydedin. </li></ol>

<ol><li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophysic+and+BiochemCytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li>
<li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li>
<li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li>
<li>Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBranton%2C+D+%22ProcNatlAcadSci+USA%22">ProcNatlAcadSci USA</a>. 55, 1048-1056 (1966).</li>
<li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li>
<li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+inner+dynein+arms%2C+radial+spokes%2C+and+the+central+pair%2Fprojection+complex+of+cilia+and+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li>
<li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substructure+of+the+outer+dynein+arm%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li>
<li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick-freeze%2C+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+freeze%2C+deep+etch+of+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li>
<li>Chandler, D. E., Sharp, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy%3A+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. Kuo, J. ohn 1117, 95-132 (2014).</li>
<li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li>
<li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li>
<li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22CurrOpin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li>
<li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium%3A+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastr+Res%22%5BJournal%5D)">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+organization%2C+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Rev+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li>
<li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastr+Res%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium%3A+A+freeze-fracture+study%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li>
<li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li>
<li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2%2B+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li>
<li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+teratogen+on+%5B3H%5Duridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li>
<li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+%26+Molec+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+%26+Immun%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li>
<li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute%2C+low+level+sulfur+dioxide+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li>
<li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li>
<li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22InhalToxicol%22%5BJournal%5D)">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li>
<li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy%2C+surface+replication%2C+freeze-etching+and+label+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li>
<li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li>
<li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li>
</ol>

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Onun tanıtımı ve ticari kullanılabilirliği takip yıllarda, donma-kırık / aşındırma prosedürleri yaygın biyolojik membran yapısının araştırmalar için kullanılmıştır. Aslında, membran yapısal özellikleri, bazı en iyi ve en bakış donma-fraktür / aşındırma preparasyonlarda elde edilmiştir. Bu çalışmalar sadece membranların yapısal organizasyonu anlaşılmasına katkıda ama aynı zamanda yapısı ve fonksiyonu ile ilgili nasıl içgörüler sağladı. Rutin biyolojik elektron mikroskobu gelişi biyolojik örne...

Kavramı ve biyolojik örneklerin dondurularak kırık işleme pratik uygulama bir yarım yüzyıl önce üzerinde Steere 1 tarafından tanıtıldı. Erken cihaz çalışan bir kendi kendine yeten 1 içerisinde farklı bileşenleri tahsis. Orijinal alet değiştirilmiş ve uzak manipülasyonu, yüksek vakum bakımı için kritik ihtiyacı karşılamak için, ticari olarak temin edilebilen cihazlarla rafine ve karbon ve metal buharlaşma transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 1 ve Şekil tarafından incelenmesi için uygun bir kopyasını üretmek için olan 2). Tipik örnek tablo ve alet kolu mikrotom düzenlenebilir sıvı azot throughput olan (Şekil 1) ile yüksek bir vakum odasına oluşur. Hazne aynı zamanda örnek aşamasına 90 ° bir açı ve PLATI için diğer uçta yer alan C-buharlaşma stabilize edilmesi için, iki elektron tabancası, bir ev45º (Şekil 2) - ayarlanabilir açı, tipik 15º de gölgeleme num / karbon. Ünitesine güç vakum pompayı çalıştırmak için uygulanır ve elektronik paneller sıcaklık ayarı ve elektron tabancası kontrolünü düzenlemek. Başlangıçta muayene ve hücre zarlarının analizi ve uzmanlık 2, 3 için bir teknik olarak daha popülerlik kazanmıştır-kırığı, dondurma virüslerin gelişmiş görüntüleme elde etmek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Nitekim, bu prosedür hücrelerin ve dokuların ve bu çalışmaların birçok hücre ve moleküler biyoloji 4-9 klasik katkıları olarak standı yapı / işlev ilişkileri nedenlerine açıklık ayrılmaz olmuştur. Donma-kırık tekniğinin gelişimi için ana amaç ve gerekçesi konvansiyonel biyolojik elektron mikroskobu kullanılan kimyasal sabitleme ve işleme kaynaklanan elektron mikroskobik çözünürlükte gözlemlenebilir eserler sınırlamak oldu. Burada amaç kimyasal sınırlamak içinsabitleme yeterli hızda ve genellikle buz kristal oluşumunu ve bir dondurucu eserler sınırlamak amacıyla, bir kriyokoruyucu mevcudiyetinde örnek dondurma ve. Daha yakın zamanlarda, bu teknik nanopartiküller ve nanomateryallerin incelenmesi için moleküler biyologlar ve malzeme bilimi araştırmacıları bir ilgi patlaması buldu. -Kırığı dondurma ve dondurarak-etch görüntüleri üç boyutlu bir karakter sergileyen ve bazen tarama elektron mikroskopta için yanlış vardır. Bununla birlikte, donma-fraktür preparatlar transmisyon elektron mikroskobu ile incelenir ve yüksek çözünürlüklü morfolojik çalışmalarında, önemli bir katkı, hücre zarlarının yapı / fonksiyon elemanlarının kendi benzersiz bir temsilidir. Dondurarak kırık işlenmesi ve / veya gliserol gibi dondurarak saklama maddelerin kullanımı ile buz kristalleşmesini sınırlandırmak için yeterli bir hız ile hücreler ve dokuların dondurma ile başlatılır. Numuneler daha sonra vakum ve bir temsilcisi altında kırılmıştır edilirLica çatlak yüzeyi üzerinde platin, karbon ve buharlaştırılması ile elde edilir. Orijinal numune standart EM numune ızgara üzerine alınır kopyadan sindirilir. Donma-kırık görüntülerin başka bir yaygın yanlış yorumlanması onlar hücre yüzeylerine tasvir olmasıdır. Donma-kırık temel dayanak biyolojik membranlar kırılma süreci (Şekil 3) ile çift katlı lipid yoluyla bölünmüş olmasıdır Ancak. Biyolojik membranların Bu işlem, iki kırılma yüzü, hücre dışı bitişik membranın biyomoleküler broşürün yarısını ortaya sitoplazmadaki PF yüze bitişik membranın yarısının organizasyonunu göstermektedir bir ve bir verir ortam, EF-yüz. Gerçek hücre yüzeyleri donma kırık görüntüleri temsil ama kırık prosedür takip donma-gravür sonraki adımı eklendi kullanıldığında, yalnızca görünür değildir. Etkin yüzey detai ortaya çıkarmak için daha önce kırık örnekleri etch içinl numuneler bir hızla ve unetchablecryoprotectant olmadan donmuş olması gerekir. Yatan özellikleri ortaya kırık numunenin yüzeyinden suyun Gravür numune tutma aşaması arasında bir ısı farkı oluşturarak numune sahne üzerinde soğutma mikrotom kol ve yüzeyden süblime suyun neden soğutma mikrotom kolu konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Su donma-etching manevrasında kırılan numune yüzeyinden süblime olduğu zaman, gerçek hücre yüzeylerinde, hücre dışı matrisin, sito-skeletal yapıları ve moleküler düzeneklerinin gereksinimleri yüksek çözünürlükte açığa çıkarılabilir. Böylece-donma kırık ve-etch dondurma değiştirilebilir terimler değil, aksine son hangi belirli çalışmanın ihtiyaçlarına bağlı olarak gerekli veya arzu olmayabilir adım adım sürecini yansıtmaktadır. Donma-kırığı sonrası / donma-etch prosedürleri, kırılan yüzeyler yönettiği evapora tabi tutulurlaryineleme destek ve görüntüleme kontrast sağlamak amacıyla karbon ve platin kat tive. Platin / karbon görüntüleme buharlaştırma tek yönlü ya da döner olabilir ve direnç veya elektron tabancası ya da gerçekleştirilir. Bilinen bir açı, tipik 30º tek yönlü gölgeleme - 45º, bazı morfometrik performans hesaplamaları yararlıdır. Derin dağlama maruz kalmış örnekler, normalde gölgeli döner ve bu örneklerin sonuçta görüntüleri fotografik değerlendirme için tersine çevrilir. Tarihi hem de donma-fraktür / donma etch tekniğin mevcut bir amacı daha geleneksel bir transmisyon elektron mikroskobu prosedürler ile ilişkilidir eşya örneği, kimyasal tespiti ve işleme sınırlamaktır. Ancak, bu teknik ve n, üç boyutlu detay görüşmek ve dolayısıyla biyolojik, malzeme bilimi morfometrik verilere edinimini kolaylaştırmak için yeteneği bir maddi avantaj sağlaranotechnology örnekler. Kırık-Freeze ve donma-etch işlemleri karmaşık ve çok boyutludur ve uygulamanın bazı yönleri özelleştirilmiş. Bu sunum sürecinin önemli özelliklerinden bir anket görünüm sunuyor ve okuyucu özel araştırma ihtiyaçları için süreci ayrıntıları ele almak ve özelleştirmek amacıyla kapsamlı yayınlanan protokolleri 10, 11 anılır.

<table><tbody><tr><td>Balzers Dondurarak kırma/dondurarak aşındırma tesisi</td><td>Balzers</td><td>BAF400T</td><td></td></tr><tr><td>Standart tamponlar</td><td>çeşitli tedarikçiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Standart aldehit fiksatifler</td><td>çeşitli tedarikçiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dikromat</td><td>çeşitli tedarikçiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit</td><td>çeşitli tedarikçiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık malzemeler Platin/Karbon Buharlaşması için</td><td>Technotrade International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td>çeşitli tedarikçiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propan</td><td>çeşitli tedarikçiler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektron mikroskobu için tek kullanımlık malzemeler</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transmisyon elektron mikroskobu</td><td>Carl Zeiss Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biyolojik elektron mikroskopi freeze-kırık / freeze etche temel teknik elemanları

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Doğada numuneler, genellikle biyolojik veya nano malzeme, kırık, dondurulmuş ve bir karbon / platin &quot;cast&quot; transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için tasarlanan oluşturmak için çoğaltılır sayede Freeze-kırık / donma-etch bir süreci anlatmaktadır. Örnekler sıvı azot, yüksek vakum altında sıcaklıklara soğutulan numune daha sonra kırılma ile, çoğu kez buz kristal oluşumunu sınırlamak için kriyo-koruyucu maddelerin mevcudiyetinde, ultra hızlı dondurma oranlarına tabi tutulurlar. Elde edilen kırık yüzey çoğaltılır ve döküm yüzeyi için üç boyutlu detay kazandıran bir açıdan karbon ve platinyum buharlaştırma ile stabilize edilir. Bu teknik, hücre zarlarında ve uzmanlık soruşturma için özellikle aydınlatıcı kanıtlamıştır ve ilgili hücre fonksiyonu hücresel form anlayışı önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bu raporda, biz gerçekleştirmek için alet gereksinimleri ve teknik protokolünü anketdondurularak kırılmış hali olduğundan, ilgili isimlendirme ve kırılma düzlemlerinin özellikleri, donma-fraktür görüntülerin yorumlanması için geleneksel prosedür içinde yapılacak değişikliklerin ve kriterleri. Bu teknik yaygın hücre biyolojisi birçok alanda ultrastrüktürel inceleme için kullanılan ve moleküler, nanoteknoloji için gelişmekte olan bir görüntüleme tekniği olarak sözünü tutar ve malzeme bilimi çalışmaları olmuştur.

Donma-fraktür görüntü yorumlama anahtar öncül kırılma düzlemi esası PF-yüzü (plazma kırıklı-yüzü) ve EF-yüzü (hücre dışı kırıklı-yüz) (Şekil denilen iki kırılma yüzü kazandıran zarların lipit ikili tabakasına geçer, yani 3). PF-yüz hücre ve EF yüze sitoplazmasına bitişik membran lipid tabakasının yarısına bitişik hücre dışı ortamı membran lipid tabakasının yarısına eşittir. Donma-fraktür tekniği membran yapısının araştırılması için özellikle yararlı olduğu ve bu iki yüzü tipik olarak, P...

Temel teknikler ve transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için biyolojik örneklerin ve nanomateryallerin dondurularak kırık işleme iyileştirmeler açıklanmıştır. Bu teknik ultrastrüktürel özellikleri ve biyolojik membranların uzmanlık ifşa ve malzeme bilimleri ve nanoteknoloji ürünleri ultrastrüktürel düzeyde boyutlu ve konumsal verilerin elde edilmesi için tercih edilen bir yöntemdir.

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

Aşağıdaki deneyin amacı, transmisyon elektron mikroskobu ile inceleme yapılabilmesi için biyolojik veya diğer materyallerin karbon platin numune replikalarını oluşturmaktır. Bunu başarmak için, çift ve tek replika olarak hazırlanan numuneler, buz kristali oluşumunu sınırlamak amacıyla ultra hızlı dondurma hızlarına tabi tutulur. Ardından dondurulmuş numune, yüksek vakum altında sıvı azot sıcaklıklarında uzaktan manipülasyonla kırılarak lipid çift tabakası boyunca membran bölünür ve böylece bir hücre dışı yüzey ile sitoplazmik yönle yakın bir yüzey oluşturulur.İsteğe bağlı ek bir adım olarak; soğutma mikrotom kolunun numune tablasının üzerine yerleştirilerek bir sıcaklık farkı oluşturulmasıyla, kırılmış numunenin yüzeyindeki suyun süblimleşmesi sağlanır ve böylece alt katmandaki özellikler ortaya çıkarılır. Ardından, kırılmış yüzey üzerine karbon ve platinyum buharlaştırması yapılarak bir replika oluşturulur.Orijinal numune, iletim elektron mikroskobu numune ızgarası üzerine aktarılan replikadan sindirilir. Son olarak, iletim elektron mikroskobu ile inceleme yapıldığında hücre membranlarının, moleküler dizilimlerin ve nanomalzemelerin üç boyutlu yapısal detaylarını göstermek için do

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaynak: Schönherr, S., et. al. Fare Amigdalasındaki Glutamat Reseptörlerinin Girişe Özgü Düzenlemesini İncelemek için Kombine Optogenetik ve Donma Kırığı Replika İmmün Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, elektron mikroskobu için fare beyin dokusunun donarak kırılmış kopyalarının immüno-etiketlemesini göstermektedir. Kırılmış ve kaplanmış kopyalar, reseptörleri açığa çıkarmak için sindirilir. Primer ve altın etiketli sekonder antikorlar, spesifik nöronal membran reseptörlerini etiketlemek...

Fare Beyin Dokusunun Donarak Kırılmış Bir Örneğinde Nöronal Membran Proteinlerinin İmmünoetiketlenmesi

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Cryo elektron mikroskopları, Tarama (SEM) veya İletim (TEM), ya çok yüksek su içeriği ile 1 biyolojik örneklerin veya diğer malzemelerin karakterizasyonu için kullanılır. A SEM / Odaklı İyon Işın (FİB) örneklerinde ilgi özelliklerini belirlemek ve cryo-TEM transfer için ince, elektron-saydam tabakalara ayıklamak için kullanılır.

Odaklanmış iyon demeti Of Cryo-elektron Mikroskopi Numune Hazırlama By Means

Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.

Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Biz msn zamansal çözünürlüğe sahip membran dinamiklerinin görüntülenmesini sağlayarak elektron mikroskobu, "flaş-and-donması" içinde yeni bir teknik geliştirdi. Bu teknik, yüksek basınçlı dondurma nöron Optogenetic uyarılmasını birleştirir. Burada, prosedürleri göstermek ve ayrıntılı protokolleri açıklar.

Flaş-ve-Freeze: Elektron Mikroskobu ile Membran Dinamikler Yakalama Yeni Bir Tekniği

Burada iki örnek işleme teknikleri, buz gibi yüksek basınç birleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut ve mikrodalga destekli örnek işleme, veri odaklı iyon demeti Taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM) ile edinme için gömme en az reçine izledi. Bu bir fare tibial sinir örnek ve Caenorhabditis eleganskullanarak gösterilmiştir.

Yüksek basınç dondurucu, mikrodalga destekli kontrast geliştirme ve en az reçine birim görüntüleme için katıştırma tarafından biyolojik örnek hazırlama

Kriyo-elektron tomografisi için dalma dondurulmuş biyolojik örneklerden vitreus ızgara üzerinde lamel üretmek için odaklanmış iyon ışını frezeleme kullanımı.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Çift Işınlı Taramalı Elektron Mikroskobu Kullanarak Vitreus Biyolojik Numunelerinden Lamel Hazırlanması

Burada bakteri, maya, kültürlü hücreler, izole hücreler, hayvan ve insan dokuları ve virüsler de dahil olmak üzere biyolojik örneklerin hızlı donması için sandviç dondurma cihazının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz. Ayrıca, hızlı donma işleminden sonra ultra ince kesitler için numunelerin nasıl hazırlanacağını da gösteriyoruz.

Elektron Mikroskopisinde Biyolojik Örneklerin İyi Ultrayapısal Korunması için Sandviç Dondurma Cihazı Kullanılarak Hızlı Dondurma

Bu makale, tek parçacıklı kriyojenik elektron mikroskopisi için biyolojik örnekleri manuel olarak dondurmak için leke ve dalma yöntemini özetlemektedir.

Tek Parçacıklı Kriyojenik Elektron Mikroskopisi için Biyolojik Örneklerin Manuel Blot ve Dalma Dondurması

Bu yazıda, kanserli ürotelyal hücrelerden kaynaklanan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonu ve donma-kırılması için bir protokol sunulmaktadır. Dondurarak kırılma tekniği, EV'lerin çapını ve şeklini ve benzersiz bir özellik olarak EV membranlarının iç organizasyonunu ortaya çıkardı. Bunlar, EV'lerin alıcı membranlarla nasıl etkileşime girdiğini anlamada büyük önem taşımaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Analizi için Donma-Kırık Elektron Mikroskobu

Öğrenin biyolojik örnekler için dondurma-kırma ve dondurma-asitleme tekniklerini kullanarak iletim elektron mikroskobisinde ultra yapısal detayları görüntülemeyi. Bu yöntem membran yapılarını ve nanomalzemeleri üç boyutlu olarak incelemeye olanak tanır.

Biyolojik Elektron Mikroskopi Freeze-kırık / Freeze etche Temel Teknik Elemanları

Daha fazla video keşfet