3D Grafen Elektrot dielektroforetik Cihazı Geliştirilmesi

Bu protokol; 3B lamine grafen kağıdın, elektrot mikro cihazının üretilme prosedürlerini ve cihaz içinde DI elektroforez veya DEP ile polistiren boncukların veya biyolojik hücrelerin manipüle edilmesine yönelik deneysel yöntemleri göstermektedir. Bu noktadan itibaren, dielektroforezden DEP olarak bahsedeceğiz. Cihazların üretimi, öncelikle 50 mikron grafen kağıt katmanları ile N eksi bir katman 100 mikron basınç hassasiyetli polimer bandın ardışık olarak istiflenmesiyle gerçekleştirilerek yarı sinyal ve yarı toprak elektrotları elde edilmiştir.

Katmanlar birbirine bastırılır, kırpılır ve ardından yapının içinden mikro kuyu delinir. Son olarak, gümüş epoksi kullanılarak cihazın iki ucuna iki bakır iletken bağlanır. İkinci adım, istenen iletkenliğe sahip DEP medyumunun hazırlanmasıdır.

Ardından polistiren boncuklar, belirli bir hacim oranında bu ortam çözeltisine süspanse edilir. Üçüncü ve son adım; cihazın hazırlanan boncuk süspansiyonu ile doldurulması, mikroskop tablasına yerleştirilmesi, cihazın bir fonksiyon jeneratörüne bağlanması ve nihayetinde DEP'in başlatılmasıdır. Son olarak, DEP yanıtlarını kaydetmek ve daha ileri analizlerle hücre veya partikül özelliklerini incelemek için mikroskop kullanılır.

Grafen, hem dayanıklılığı hem de termal ve elektriksel özellikleri nedeniyle kullanılan çok yönlü bir malzemedir. Bu protokol, kan gruplandırma veya hastalık hücrelerinin tıbbi teşhisi gibi uygulamalar için parçacıkları ve hücreleri ayırt edebilen üç boyutlu bir dielektroforetik mikro cihazda, iletken bir elektrot tabakası olarak düşük maliyetli bir grafen kağıdı kullanmaktadır. Bu grafen kağıdı elektrot mikro cihazın avantajları arasında daha kolay üretim, daha yüksek örnek verimliliği ve geometrik çok yönlülük yer almaktadır.

3D heterojen elektrot alanı, polarize olabilir partikülleri ve hücreleri kendi içsel kimyasal ve morfolojik özelliklerine göre ayırt edebilme yeteneğiyle benzersiz olan DP kuvvetleri aracılığıyla büyük numune hacimlerini manipüle edebilir. Laminasyonlu cihazı grafen kağıt ve bant kullanarak birleştirin. Burada, ticari bir üreticiden temin edilen 75 micron kalınlığında hidrofobik grafen kağıt ve 100 micron kalınlığında basınca duyarlı çift taraflı bant kullanıyoruz.

İlk olarak grafen kağıdını cerrahi bir bıçak ve düz kenarlı cetvel kullanarak 6,7 santimetreye 1,5 santimetrelik dikdörtgenler şeklinde kesin ve makas yardımıyla çift taraflı basınç duyarlı bandı beş adet 1,3 santimetreye yaklaşık beş santimetrelik şeritler halinde kesin. Grafen kağıdının ilk katmanını temiz bir lam üzerine yerleştirin. Herhangi iki komşu grafen kağıdı katmanı arasında yalıtım sağlamak için yaklaşık iki milimetrelik bir boşluk bırakarak, grafen kağıdının bir ucunu bir şerit bantla yavaşça kaplayın.

Grafen kağıdın ikinci katmanını bandın üzerine yerleştirin. İlk grafen kağıt katmanına göre kaydırın. Katmanlar arasında iyi bir sızdırmazlık sağlamak için üzerine orta düzeyde basınç uygulayın.

Üst ve alt katmanların her ikisinin de grafen kağıdı olduğundan emin olarak, yukarıdaki iki adımı kalan katmanlar için tekrarlayın. Grafen kağıdı katmanları arasında sızdırmaz yalıtım sağlamak için cihaz kenarlarından yaklaşık bir milimetrelik küçük bir pay bırakarak fazla bandı makasla temizleyin. Pozitif ve negatif probları cihazın karşıt taraflarındaki elektriksel iletkenlerin üzerine yerleştirerek bir multimetre ile hızlı bir yalıtım testi gerçekleştirin.

Yaklaşık yüzlerce kilo ohm düzeyindeki yüksek direnç, katmanlar arasında iyi bir yalıtım olduğunu gösterir. Artık lamine yapı, mikro kuyu delme işlemi için hazırdır. Lamine yapıda bir mikro kuyu delmek için mikro freze kullanırız.

Burada, 700 mikron çapında ve 2,1 milimetreye yakın kanal boyuna sahip bir mikro uç kullanıyoruz. Mikro ucun seçimi, mikro kuyucuğun çapına ve cihaz kalınlığına göredir. Laminat yapıyı mikro delme tablasına kıskaçlarla sabitleyin; bilgisayarlı kontrollerle uç frezeyi yapının hemen üzerine konumlandırın, ardından cihaz üzerine basınçlı hava püskürtmeye başlayın. Uç frezeyi döndürmeye başlayın ve ardından uç frezeyi yavaşça laminat yapının merkezine ve içinden geçecek şekilde aşağı indirin.

Yeni delikten kalıntıların tamamen temizlendiğinden emin olmak için, laminat yapı derinliğinden biraz daha fazla bir mesafede durun. İç duvarı pürüzsüzleştirmek için uç frezeyi mikro kuyu boyunca birkaç kez yukarı ve aşağı hareket ettirin.

Mikro kuyucuğun iç yüzeyi mümkün olduğunca dikey ve temiz olmalıdır. Optimal elektrik alanı gradyanları ve mikro kuyucuktan ışık geçişi için standart 32 gauge bakır telleri iki adet üç santimetre uzunluğunda parçaya kesin ve iki santimetrede iki dik açı oluşturacak şekilde katlayın. Gümüş iletken epoksinin yaklaşık 0.75 mm A kısmını ve yaklaşık 0.75 mm B kısmını manuel olarak karıştırın.

Küçük bir kap içerisinde, katmanlar arasında iyi bir temas sağlamak amacıyla tüm üç grafen kağıdı katmanının uçlarına ve aralarına dikkatlice gümüş epoksi uygulayarak telleri sabitleyin. Ardından, bir santimetrelik teli herhangi iki katman arasına yerleştirin; fazla epoksiyi gidermek ve iyi bir elektriksel temas sağlamak için katmanları hafifçe sıkıştırın. Laminasyonlu yapının diğer tarafı için de aynı işlemi tekrarlayın.

Cihazın tamamını bir rafa yerleştirin ve 70 °C sıcaklık ile bir atmosferik basınç altında gece boyunca kuruması için fırına koyun. Cihazı fırından çıkarın ve elektrot uçları arasındaki elektriksel yalıtımı doğrulayın. Burada, önceden hazırlanmış 290 mOsm/L mannitol çözeltisi ile PBS'yi farklı oranlarda karıştırarak çeşitli iletkenlik değerlerine sahip çözelti ortamları hazırlarız.

Bunlar, hücre kültürü tamponunu kaba bir şekilde taklit etmek için seçilmiş basit çözeltilerdir. Bu iki çözeltinin hacim oranı ile ortaya çıkan çözelti iletkenliği arasında doğrusal bir korelasyon vardır; pipetleme yoluyla 10 µL polistiren boncuk ile 1 mL medya çözeltisini bir örnek tüpüne aktararak, polistiren boncukları veya biyolojik hücreleri 1:100 hacim oranında iletkenlik medyası ile karıştırın.

Numuneyi vorteksleyerek iyice karıştırın. Cihazı, modifiye edilmiş kağıt klempler veya benzeri bir araç kullanarak orta şiddette bir basınçla cam lam üzerine sabitleyin. Laminasyonlu yapının cam lama sızdırmaz şekilde yapışmasını ve numune sızıntısını önlemek için destek kısmı mikro kuyucuğa yeterince yakın olmalıdır.

Kelepçe sıkılığı, cihazı deforme ederek kuyucuk geometrisini ve ışık yolunu olumsuz etkilemeyecek şekilde kontrol edilmelidir. 0,5 mm kalınlığındaki kapak cam lamı, mikro kuyucuğu tam olarak kapatacak genişlikte bir elmas uçlu cam kesici ile kesin; kapak camını uygun boyuta getirin ve kenara ayırın. Bu mikro şırıngayı kullanarak, polistiren boncuk süspansiyonundan yaklaşık 1 µL'yi yavaşça mikro kuyucuğa enjekte edin. Kabarcık oluşumunu önlemek için, kabarcıklar görülürse enjeksiyonu tekrarlayın ve keskin iğne ile mikro kuyucuk duvarlarına zarar vermemeye özen gösterin; mikro kuyucuğu hafifçe doldurun ve fazla sıvıyı uzaklaştırmak, buharlaşmayı önlemek ve tekrarlanabilir hacimler sağlamak için hazırlanan cam kapağı hemen mikro kuyucuğun üzerine kaydırın.

Her bir deney için, lamine edilmiş mikro cihazı tamamen mikroskop tablasına sabitleyin ve bir fonksiyon jeneratörü bağlayın. Timsah klipleriyle cihazları bakır iletkenlere bağlayın ve mikro kuyucuğu net bir şekilde görmek için mikroskop yazılımı üzerinden odağı ayarlayın. Ekranın merkezinde burada, 100 Hz ile 10 MHz arası ve 15 V görülmektedir.

Cihaza tepe noktası sinyalleri uygulandı. Boncuklar, lam yüzeyinin 1 ila 200 mikron üzerinde, 10x büyütmede mikrokuyucuk içerisinde gözlemlendi. Kamera kaydını ve veri alımını başlatmak için düğmeye tıklayın.

Kamera kaydı başladıktan iki saniye sonra fonksiyon üreteci sinyalini başlatın. Görüntüler, daha sonraki yoğunluk analizi için yaklaşık beş dakika boyunca saniyede bir ila beş kare hızında dijital olarak kaydedilir. Deney tamamlandığında, cihazı çıkarın ve klempleri sökün.

Hem lamı hem de cihazı sabunlu su ile temizleyin. Ardından iyice durulayın. Elektrik alanının yokluğunda, partiküller yerçekimi nedeniyle yalnızca cihazın tabanına çöker. Bir kilohertz civarındaki elektrik alanları, alan gradyanı boyunca grafen kağıda doğru gerçekleşen hareketle belirtilen pozitif DEP davranışını ortaya çıkarır.

100 kilohertz üzerindeki elektrik alanlarında ve megahertz aralığında, mikro kuyu kenarlarındaki elektrotlar gözlemlenmiştir. Boncukların elektrik alan gradyanı boyunca mikro kuyu merkezine doğru hareketi ile belirtilen negatif DEP gözlemlenmiştir. Bu 3B grafen kağıt elektrot mikro cihazı, hem teorik öngörülerle hem de daha önce rapor edilen deneysel sonuçlarla yakın uyum içerisinde olan deneysel sonuçlar vermiştir.

Cihaz üretimi son derece çok yönlüdür. Sağlanan protokoller, daha fazla katmana sahip cihazlar veya diğer malzemeler için kolayca uyarlanabilir. Bu video, grup bazlı bir 3D DEP mikro cihazının ayrıntılarını sunmaktadır.

Bununla birlikte, gelecekteki uygulamalarda, daha yüksek verimlilik elde etmek için partikül veya hücre süspansiyonları cihazın mikro kuyucuğundan sürekli olarak akıtılabilir. DEP ayırmanın çok yönlülüğüne bir örnek olarak, su emici grafen kağıt; partikül veya hücre konsantratörleri için aynı anda hem bir elektrot hem de filtre olarak, hatta elektrokinetik biyokimyasal sensörler olarak işlev görebilir. Bu videoyu izledikten sonra izleyicilerin, çok katmanlı bir grafen kağıt elektrot mikro cihazının nasıl üretileceği ve partikül veya hücre deneyleri yürütmek için cihazın nasıl çalıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmaları beklenmektedir.