Name: Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Öğrenin, tükürükten yüksek kaliteli genomik DNA izolasyonu için hücre lizi, RNA ve protein safsızlıklarının giderilmesi, çöktürme ve saflaştırma adımlarını. Bu maliyet etkin yöntem, PCR ve dizileme için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 (CWB'ye DC009453 destek) tarafından finanse edilmiştir.

NOT: Önceki tükürük örnekleri sağlayarak tüm konular Nationwide Çocuk Hastanesi, insan deneklerin tedavisi için yönergelere uygun bilgilendirilmiş onam formu. 1. Tükürük Toplama ve Saklama <ol><li> Tükürük toplama önce, öznenin ağız konu su ile ağzınızı çalkalayın sahip ve yeme kaçınarak veya numune toplama önce 30 dakika boyunca içerek gıda veya diğer yabancı maddelerden arındırılmış olduğundan emin olun. </li><li> Başlığın veya borunun iç dokunmamak için emin bir DNA sabitleme tamponu 2, 2.5 ml bir 15 ml santrifüj tüpü açın ve söz konusu tampon çözeltisi içine, tükürük 2,5 mi tükürük vardır. Not: tükürük fazla 2,5 ml Toplama DNA sabitleştirme tamponu, numune oranı yetersiz bir ikinci örnek bozulmasına yol açabilir. Çok az tükürük Toplama protokol beklenen verimi azaltacaktır. Toplama hacimleri değerlendirmek için, t tarafında sayılı geçişlerini kullanmakdiye tüp. </li><li> Kapağı yerine yerleştirin ve bu karışım homojen hale getirene kadar inversiyon yolu ile karıştırılır. Çalkalama gerekli değildir. Kısa süreli depolama veya uzun süreli depolama boyunca 4 ° C (&gt; 3 ay), oda sıcaklığında örnekleri saklayın. </li></ol> 2. İlk Hazırlıklar ve Hücre Lizis <ol><li> Önceki ekstraksiyon başlangıç, 37 ° C bir su banyosu ısı ve bir buz kovası hazırlar. Üç 15 ml konik santrifüj tüpleri her numune için ekstre edilmiştir gerekli olacaktır. Üç tüp, hücre ve protein topağı, son ekstre gDNA ve izopropanol ve etanol süpernatantlar tutmak için kullanılacaktır. </li><li> 15 saniye sonra orta hızda vorteks depolama örnekleri ve ters örnekleri birkaç kez almak. </li><li> Temiz bir 15 ml&#39;lik santrifüj tüpüne numune 2.5 ml koyun ve Celi Lysis Çözüm 5 ml ilave ediniz. Ters, numune 50 kez karıştırılır ve 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol> 3. RNA Kaldırma <ol><li> Rnaz A Sol 40 ul ekleyin100 mg / ml Katkı ve 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 3 dakika boyunca buz üzerinde 37 ° C su banyosu numuneyi çıkarın ve soğuk. <ol><li> RNaz bir inkübasyondan sonra, protokol DNA rehidrasyon aşama boyunca 65 ° C&#39;ye kadar su banyosu sıcaklığını arttırabilir. </li></ol></li></ol> 4. Protein ve Lipid Kaldırma <ol><li> Ml / 20 mg Proteinaz K çözeltisi 50 ul ters çevirme ile birkaç kez karıştırın ve 30 dakika en az oda sıcaklığında inkübe edilir. Not: Bu protokolü için olası bir duraklama noktasıdır. Ekstraksiyon tamamlanabilir kadar Proteinaz K solüsyonu ilave edildikten sonra, numune, 4 ° C&#39;de saklanabilir. En fazla 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de depolama, ekstraksiyon verimi veya DNA kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu gösterilmemiştir. Bu aşamada uzun süreli depolama henüz değerlendirilmemiştir. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde yüksek hızda 20 saniye, ve yeri boyunca kuvvetli bir şekilde, girdap protein çökeltme çözeltisinin 1.7 ml ilave edilir. </li&gt; <li> Örnekler 3000 x g&#39;de 10 dakika ve 4 ° C&#39;de 10 dakika santrifüj boyunca buz üzerinde soğutuldu sonra. Çöken proteinler, sıkı bir topak oluşturmak devam etmek gerekir. Topak sıkı değildir ya da çözelti hala puslu olması halinde, numuneler daha 5 dakika boyunca buz üzerinde soğutulabilir ve santrifüj işlemi tekrarlanır. Numuneler, bir sıkı bir pelet sağlamak için buz üzerinde tutulmalıdır. </li></ol> 5. izolasyonu ve saflaştırılması gDNA <ol><li> Temiz bir 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü içine, bir pipet 5 ml izopropanol ve 20 mg / ml saf Glikojen Çözüm 8 ul. </li><li> Çöken protein, pelet geride bırakarak, izopropanol ve glikojen çözeltisi içeren bir tüp içine adım 4,3 gDNA ihtiva eden üst sıvıyı dökün. Üst fazı ilave edildikten sonra yavaşça 3.000 x g ve 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca ters Numune ve santrifüj ile 50 kez karıştırılır. </li><li> Temiz bir 15 ml tüp içine yavaşça süpernatant dökün. Üstte yüzen maddenin çıkarılmasından sonra,% 70 etanol, 1 ml eklebirkaç kez yavaşça sallanarak hafifçe çökelen pelet üzerine etanol taşıyarak pelet yıkayın. Tüp içinde etanol saklayın. </li><li> İlk yıkama, 2,000 xg&#39;de 1 dakika ve 20 ° C için örnek santrifüj. Bu santrifüj işlemi, 4 ° C ya da 20 ° C &#39;de yapılabilir. Sıcaklıkta hiçbir belirgin etkisi, bu aşama için gösterilmiştir. </li><li> Pelet İlk yıkama ve santrifüj ardından yavaş yavaş tüpten etanol yıkama dökün ve atın, sonra adımları 5.3 ve 5.4 tekrarlayarak bir ikinci yıkama yapar. </li><li> İkinci yıkamadan gelen süpernatan ayrılmasından sonra, 15 dakika boyunca hava ile kuruması için pelet sağlar. <ol><li> Numune tamamen kurumuş olduğunda, başka bir 15 dakika boyunca hava ile kurumaya. </li></ol></li></ol> GDNA&#39;sından 6. Rehidrasyon <ol><li> Örnek kuruduktan sonra, kurutulan gDNA pelet yeniden sulanması Tris-EDTA içinde 300 ul ilave edin. </li><li> Bir orta hızda ve yerde 5 saniye vorteks örnek1 saat boyunca 65 ° C sıcak su banyosu. </li><li> Su banyosundan çıkarın ve numune, oda sıcaklığında O / N inkübe edin. Not: Tüm ürünler ve reaktifler Malzeme, Tablo l&#39;de listelenen ikinci, hem de Tablo 4. </li></ol>

<ol><li>Quinque, D., Kittler, R., Kayser, M., Stoneking, M., Nasidze, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saliva+as+a+source+of+human+DNA+for+population+and+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saliva as a source of human DNA for population and association studies.</a> Analytical Biochemistry. 353, 272-277 (2006).</li>
<li>Min, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mircosatellite+and+SNP+genotyping+success+rates+established+in+a+large+number+of+genomic+DNA+samples+extracted+from+mouth+swabs+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Twin+Research+and+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">High mircosatellite and SNP genotyping success rates established in a large number of genomic DNA samples extracted from mouth swabs and genotypes.</a> Twin Research and Human Genetics. 9, 501-506 (2006).</li>
<li>Dlugos, D. J., Scattergood, T. M., Ferraro, T. N., Berrettinni, W. H., Buono, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+rates+and+fear+of+phlebotomy+in+pediatric+patients+in+a+genetic+study+of+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Recruitment rates and fear of phlebotomy in pediatric patients in a genetic study of epilepsy.</a> Epilepsy & Behavior. 6, 444-446 (2005).</li>
<li>Etter, J. F., Neidhart, E., Bertand, S., Malafosse, A., Bertrand, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+saliva+by+mail+for+genetic+and+cotinine+analyses+in+participants+recruited+through+the+internet%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Collecting saliva by mail for genetic and cotinine analyses in participants recruited through the internet.</a> European Journal of Epidemiology. 20, 833-838 (2005).</li>
<li>Hansen, T. V., Simonsen, M. K., Nielsen, F. C., Hundrup, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+blood%2C+saliva%2C+and+buccal+cell+samples+in+a+pilot+study+on+the+danish+nurse+cohort%3A+Comparison+of+the+response+rate+and+quality+of+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Collection of blood, saliva, and buccal cell samples in a pilot study on the danish nurse cohort: Comparison of the response rate and quality of genomic DNA.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 16, 2072-2076 (2007).</li>
<li>Van Schie, R. C. A. A., Wilson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+A+convenient+source+of+DNA+for+analysis+of+bi-allelic+polymorphisms+of+fc%CE%B3+receptor+iia+%28cd32%29+and+fc%CE%B3+receptor+iiib+%28cd16%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Saliva: A convenient source of DNA for analysis of bi-allelic polymorphisms of fcγ receptor iia (cd32) and fcγ receptor iiib (cd16).</a> Journal of Immunological Methods. 208, 91-101 (1997).</li>
<li>Dawes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimates%2C+from+salivary+analyses%2C+of+the+turnover+time+of+oral+mucosal+epithelium+in+humans+and+the+number+of+bacteria+in+an+edentulous+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Estimates, from salivary analyses, of the turnover time of oral mucosal epithelium in humans and the number of bacteria in an edentulous mouth.</a> Archives of Oral Biology. 48, 329-336 (2003).</li>
<li>Bahlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva-derived+DNA+performs+well+in+large-scale%2C+high-density+single-nucleotide+polymorphism+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Saliva-derived DNA performs well in large-scale, high-density single-nucleotide polymorphism microarray studies.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19, 794-798 (2010).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotyping+performance+between+saliva+and+blood-derived+genomic+dnas+on+the+dmet+array%3A+A+comparison%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genotyping performance between saliva and blood-derived genomic dnas on the dmet array: A comparison.</a> PLoS ONE. 7 (3), e33968(2012).</li>
<li>Simmons, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+genotype-phenotype+model+determinism%3A+Application+to+bivariate+reading%2Flanguage+traits+and+epistatic+interactions+in+language-impaired+families%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Increasing genotype-phenotype model determinism: Application to bivariate reading/language traits and epistatic interactions in language-impaired families.</a> Human Heredity. 70, 232-244 (2010).</li>
<li>Zeugin, J. A., Hartley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+precipitation+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Focus%22%5BJournal%5D)">Ethanol precipitation of DNA.</a> Focus. 7, 1-2 (1985).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+Transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler Transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>DePristo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+variation+discovery+and+genotyping+using+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.</a> Nature Genetics. 43, 491-498 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu prosedür, büyük ölçüde DNA, kaliteden ödün vermeden, standart yöntemlere göre daha yüksek molekül ağırlıklı DNA verimini geliştirilmiş bir optimize edilmiş DNA ekstraksiyon protokolüdür. Verim çoğunda büyük etkisi ile kritik adım, yaygın olarak 11 dağıtılan değildi biri hariç, burada gözden yayınlanmış herhangi bir protokol daha etanol yağış sırasında uzun bir santrifüj aşamasını kapsamaktadır adım 5.2 oldu. Bu daha santrifüj ile bağlantılı DNA kalitesinde bir değişiklik bütün tükürük koleksiyon mevcut DNA...

İnsan genetik çalışmalar için yüksek kalitede DNA temininde hastalık geni bulma işlemi esastır. Kan, tükürük toplama daha pahalı olması da invaziv işlemler gerektiren ve rağmen, fonksiyonel çalışmalar için sonsuz bir DNA kaynağı veya iPSCs olarak ölümsüzleşti hücre hatları oluşturmak için tercih edilir ve hücre hatları mevcut olmadığında bazen kan DNA kullanılır. Bununla birlikte, kan elde eğitimli bir flebotomist gerektirir ve kan tükürük 1 daha kısa bir yarı-ömrü vardır. O toplanan ve böylece iyi hastane ve laboratuvarlardan 2 su toplama alanı dışında potansiyel denek havuzu artan flebotomist için gerek kalmadan posta yoluyla gönderilen olabilir beri tükürük DNA elde etmek daha az pahalı ve daha kolaydır. Konular yerine kan 3, 4 bir tükürük örneği vererek seçeneği varken Çalışması okullaşma gelişmiş olabilir. Miktar ve tükürük DNA kalitesi ile ilgili endişeler bizi yaygın sınırlı olabilirtükürük 2, 3, 4, 5 önemli miktarda elde etmedi eski yanak bezlerden yöntemleri üzerinde DNA testi için mililitre başına 4.3 x 10 5 hücre ortalama ile, bütün tükürük uygunluğunu gösteren çok sayıda çalışma son çalışmalarda rağmen e, 6. mütevazı bir edebiyat microarray tabanlı yöntemler 8, dahil genotiplendirme uygulamalar için bütün tükürük edilen DNA uygunluğunu gösteren var iken 9, 10, herhangi bir çalışma inceleyen gelecek nesil dizileme (NGS). Bütün bu tükürük DNA ekstraksiyon protokolü optimize etmek için hedefe kolaylıkla ortak reaktifler ve sarf malzemeleri ile laboratuarlarda uygulanan maliyet etkin bir şekilde genetik uygulamalar için miktar ve kalitesini en üst düzeye çıkarmak oldu. Tükürük DNA ekstraksiyon çeşitli prosedürler gerektirir: 1) toplama ve depolama, 2) hücre parçalama, 3) RNaz tedavisi, 4) protein çökelmesi, 5) etanol yağış, 6) DNA rehidrasyon. Tarif edilen DNA sabitleştirme Tampon çözelti,Daha önce 2, yeterince değişiklik olmadan fonksiyonları. RNaz tedavi ve DNA rehidrasyon adımları optimize için hiçbir girişimde bulunuldu. Kalan her adım için, verimi etkileyebilecek çeşitli değişkenler tespit edilmiştir. Her bir değişken ayrı ayrı manipüle edilmiş ve verim ve kalitesinde iyileşme istatistiksel olarak değerlendirildi. Veriminin ve / veya DNA kalitesini geliştirdiği gösterildi değişkenler için, en uygun değerleri final protokolüne dahil edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>15 ml Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher</td><td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Lizis Çözeltisi</td><td>Qiagen</td><td>158908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K Sigma</td><td></td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>Protein Çökeltme Çözeltisi</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Fisher</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>EZ-BioResearch</td><td>S1003</td><td></td></tr><tr><td>% 70 Etanol</td><td>Fisher</td><td>04-355-305</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE)</td> <td>Fisher</td><td>BP2473-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>AC194090010</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Fisher</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0.5 M) Çözelti</td><td>Fisher</td><td>03-500-506</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Fisher</td><td>BP166-100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analog Vorteks Karıştırıcı</td><td>Fisher</td><td>02-215-365</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5810R</td><td>Eppendorf</td><td>5811 000.010</td><td></td></tr></tbody></table>

yeni nesil dizinleri için toplama ve tükrük dna çıkarımı

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

İnsan genetiği araştırmalarında tercih edilen DNA kaynağı kan veya kandan türetilen hücre dizileridir, çünkü bu kaynaklar büyük miktarlarda yüksek kaliteli DNA verir. Bununla birlikte, tükürükten DNA ekstraksiyonu, bir flebotomist masrafı olmadan çeşitli DNA tahlilleri için uygun olan ve hatta posta yoluyla elde edilebilen, çok az bozunma/parçalanma ile veya hiç bozulma / parçalanma olmadan yüksek kaliteli DNA verebilir. Bununla birlikte, şu anda, literatürde yeni nesil dizileme için herhangi bir tükürük DNA toplama/ekstraksiyon protokolü sunulmamıştır. Bu protokol, tükürük toplama/depolama ve DNA ekstraksiyonu parametrelerini, mikroarray genotipleme ve yeni nesil dizileme dahil olmak üzere en yüksek standartlara sahip DNA tahlilleri için yeterli kalite ve miktarda olacak şekilde optimize eder.

DNA, bir DNA ekstraksiyon eşleştirilmiş bir dizi gerçekleştirilmiştir ekstraksiyon için optimal parametreleri belirlemek. Tek bir tükürük örnek bölünmüş ve her bölümü belirli bir değişken için iki muhtemel değere biri ile test edilmiştir. Eşleştirilmiş her testin en az sekiz çoğaltır (örneğin, tek bir tükürük örneği ve ilk 50 ° C inkübasyon olmadan hem ekstraksiyon test etmek için bölündü) yapıldı. Toplam DNA verimi, 260/280 değeri, 260/230 değeri ve parçalanma değerlendirmek için Elektroforezlenmiş DNA görsel ...

Tükürükten DNA ekstraksiyonu, çok az bozunma/parçalanma ile veya hiç bozunma/parçalanma olmadan, kolayca bulunabilen bir yüksek moleküler ağırlıklı DNA kaynağı sağlayabilir. Bu protokol, tükürük toplama/saklama ve DNA ekstraksiyonu için yüksek kalite gereksinimlerine sahip alt DNA tahlilleri için yeterli kalite ve miktarda olacak şekilde optimize edilmiş parametreler sağlar.

Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Bu prosedürün genel amacı, tüm tükürükten yüksek kalitede genomik DNA ekstrakte etmektir. Bu işlem, önce DNA'yı serbest bırakmak için hücrelerin liziz edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, RNA ve protein safsızlıklarının uzaklaştırılmasıdır.Üçüncü adım, genomik DNA'yı çöktürmek ve kalan tüm kontaminasyonları veya safsızlıkları gidermektir. Son adım, genomik DNA'yı PCR ve sekanslama gibi alt uygulamalar için yeniden hidrate etmektir. Nihayetinde, spektrofotometri ve amplifikasyon, toplanan genomik DNA'nın yüksek kalitede olduğunu gösterebilir.Bu tekniğin toplama kitlerine göre temel avantajı, verimde herhangi bir kayıp olmadan maliyetlerin önemli ölçüde azaltılacak olmasıdır. Tükürük toplama işleminden yarım saat önce, denekler ağızlarını suyla çalkalamalı ve ardından örnek alınana kadar yiyecek veya içecek tüketmemelidir. Örneği almak için, deneğin tam olarak 2.5 mililitre tükürüğü, 2.5 mililitre DNA stabilizasyon tamponu içeren 15 mililitrelik bir tüpe tükürmesini sağlayın.Tüpün iç kısmına veya kapağın iç kısmına dokunmayın. Bu işlem sırasında tüpü kapatın ve karışımı çalkalamadan, tersyüz ederek homogenize edin. Ardından örneği kısa süreli saklama için oda sıcaklığında veya üç aya kadar dört derece Celsius'ta saklayın.Hazırlıklar arasında bir su banyosunun 37 °C'ye ısıtılması ve üç adet 15 mL'lik tüpün hazır bulundurulması yer alır. Örneği birkaç kez alt üst ederek başlayın, ardından orta hızda 15 saniye boyunca vorteksleyin. Örneğin 2,5 mL'sini tüplerden birine aktarın.Alikota beş mililitre hücre liziz solüsyonu ekleyin ve tüpü 50 kez ters çevirerek liziz solüsyonunu numuneyle karıştırın. Numune karıştırıldıktan sonra 30 dakika boyunca inkübe edin. Yarım saat sonra, oda sıcaklığında, lizize edilmiş hücre solüsyonuna 100 mg/mL konsantrasyonunda 40 µL RNA A ekleyin.Ardından tüpü hızlıca beş kez altüst edin. RNA reaksiyonunu 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. Sonrasında tüpü üç dakika boyunca buz üzerinde soğutun.Bu aşamada, su banyosu sıcaklığını 65 °C'ye yükseltin. Ardından, tüpü buzdan çıkarın. 50 µL proteinaz K ekleyin ve karıştırın; ardından reaksiyonu oda sıcaklığında 30 dakika veya 4 °C'de 16 ila 24 saat boyunca inkübe edin.Daha sonra 1,7 milliliters protein çöktürme çözeltisi ekleyin ve tüpü 20 saniye boyunca yüksek hızda vorteksleyin. Ardından numuneyi 10 dakika boyunca buz üzerinde soğumaya bırakın. Soğuma tamamlandığında, numuneyi 3000 Gs hızında ve dört degrees Celsius sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Pellet sıkı değilse, örneği beş dakika daha soğutun ve beş dakika boyunca yeniden santrifüjleyin. Sıkı bir pellet elde edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. Örneği daima soğuk tutun.Beş mililitre izopropanol ve 20 mg/mL konsantrasyonunda sekiz mikrolitre glikojen çözeltisi ile temiz bir 15 mililitrelik tüp hazırlayarak DNA izolasyonuna başlayın. Ardından, santrifüj edilmiş örneğin süpernatantını bu tüpe aktarın. Peleti atın ve örneği 50 kez altüst ederek karıştırın.Ardından, örneği 3000 Gs'de ve dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı, peletten ayırarak başka bir temiz 15 mililitrelik tüpe aktarın. Bir mililitre %70 etanol ekleyin ve tüpü yan çevirerek 30 saniye boyunca elle sallayın.Ardından etanol çözeltisini bir dakika boyunca 2000 Gs hızında ve ya 4 °C ya da 20 °C'de santrifüj edin. Süpernatantı yavaşça dökerek uzaklaştırın, ardından pelete daha fazla etanol ekleyin. Tüpü elinizle sallayarak karıştırın ve santrifüj işlemini tekrarlayın.Ardından etanolü tekrar yavaşça dökün. Yıkama sırasında pelet gevşeyebilir. Eğer ayrılırsa, etanol çözeltisi içinde kaldığından ve tüpün kenarlarına veya kapağına yapışmadığından emin olun.Bu yıkama sırasında tüpü ters çevirmeyin. Etanol yıkamalarının ardından, tüpü 15 ila 30 dakika boyunca havada kurumaya bırakın. Daha sonra, önce 300 µL tris EDTA ekleyerek genomik DNA peletini rehidrate edin.Ardından bir örneği orta hızda beş saniye boyunca vorteksleyin ve örneği bir saat boyunca 65 °C'lik bir su banyosuna aktarın; banyoda ısıtıldıktan sonra örneği oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün DNA, tükürükten DNA ekstraksiyonu örneklerinin jel elektroforezi için kullanıma hazır olacaktır. Örnekler, degrade olmuş DNA'ya işaret eden yayılmalar olmaksızın uygun yüksek moleküler ağırlıklı bantlar göstermektedir. RNA uzaklaştırma adımı gereklidir ve oldukça etkilidir.RNA sindiriminden sonra, 260 nanometre ile 280 nanometre oranı ortalama 1,74'tür. Önemli olan, DNA'nın yüksek kapasiteli dizileme (high throughput sequencing) için uygun olmasıdır. 2,6 megabas DNA'yı hedefleyen bir hedef zenginleştirme kiti 24 örneğe uygulanmış ve her şerit başına 12 barkodlu örnek dizilenmiştir.24 örneğin tamamı yüksek kaliteli NGS verilerine sahipti ve nadir tek nükleotid polimorfizmleri tanımlanabildi. Bu videoyu izledikten sonra, tüm tükürükten yüksek kaliteli genomik DNA'nın nasıl ekstre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

collection-and-extraction-of-saliva-dna-for-next-generation-sequencing

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Gelecekteki klinik uygulama için tükürük örnekleme göz önüne alındığında, bir lolipop gibi ultrafiltrasyon (LLUF) prob insan oral kavite sığacak şekilde imal edilmiştir. NanoLC-LTQ kütle spektrometresi tarafından sindirilmemiş tükürük Direkt analizi büyük proteinler ve yüksek bolluk proteinler kaldırmak ve düşük bol peptidler daha tespit yapmak LLUF probların yeteneğini göstermiştir.

Bir Lollipop-Like Ultrafiltrasyon Probe Kullanımı İnsan Yerli Tükürük Peptidome Örnekleme: Klinik Kütle Spektrometresi için Peptid Algılama basitleştirin ve geliştirin

Bisülfit amplikon dizilemesi (BSAS), hedeflenen genomik ilgi bölgelerinde sitozin metilasyonunu ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, baza özgü bir seviyede DNA metilasyonunun mutlak kantitasyonunu üretmek için yeni nesil dizilemeden önce hedef bölgelerin PCR amplifikasyonu ile eşleştirilmiş bisülfit dönüşümünü kullanır.

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Bu el yazması, yeni nesil dizileme için DNA parçalarını saflaştırmak için otomatik bir jel boyutu seçim yaklaşımını açıklamaktadır. Ranger Teknolojisi, agaroz jel yükleme, elektroforetik analiz ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılması sürecinin tamamının tam otomasyonunu sağlayarak yüksek verimli ve yüksek kaliteli yeni nesil dizileme kitaplıklarına olanak tanır.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Biz 16S rRNA gen sıralama amplikon kullanarak bakteri topluluklarının karakterizasyonu için sürüntü nükleik asidin çıkarmak için etkili, sağlam ve uygun maliyetli bir yöntem açıklanmaktadır. yöntem birden fazla örnek türleri için ortak bir işleme yaklaşımı sağlar ve alt analitik süreçlerin bir dizi barındırmaktadır.

Bakteriyel Topluluk Karakterizasyonu Verimli Nükleik Asit Ekstraksiyonu ve 16S rRNA gen Sıralama

Silajlık sığır yemlerinin mikrobiyomunu araştırmak için Metagenomik kullanılmıştır. Analiz, av tüfeği dizilimi ile gerçekleştirildi. Bu yaklaşım, sığır yemi içindeki mikrobiyal topluluğun bileşimini karakterize etmek için kullanılmıştır.

Yemlerin metagenomic Analizi

İki bitki organelleri DNA zenginleştirme yönteminin karşılaştırılması ve optimizasyonu sunulmaktadır: geleneksel diferansiyel santrifüjleme ve metilasyon durumuna dayalı toplam gDNA'nın fraksiyonlanması. Ortaya çıkan DNA miktarını ve kalitesini değerlendirir, kısa okunmuş yeni nesil dizilemede performans gösteririz ve uzun okunan tek moleküllü dizilemede kullanım potansiyelini tartışırız.

Yeni nesil Sıralama için Uygun Bitki Organelleri DNA Zenginleştirme Yöntemlerinin Optimizasyonu ve Karşılaştırmalı Analizi

Burada VNTR locus D1S80'i epitel hücre DNA'sından yükselterek DNA parmak izi profilleri oluşturmak için basit bir protokol açıklıyoruz.

Laboratuvar Sınıflarında D1S80 Locus Kullanılarak DNA Parmak İzi Uygulaması

Burada, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları üretmek için manyetik boncuklar kullanan bir DNA ekstraksiyon protokolü açıklanmıştır. Bu ekstraksiyonlar, aşağı akış yeni nesil sıralama yaklaşımı için uygundur.

Yeni Nesil Sıralama için Manyetik Boncuk Bazlı Sivrisinek DNA Ekstraksiyon Protokolü

Bu protokol, üriner bakterilerin kültleme, dizileme ve de novo hibrid genom montajı için kapsamlı bir yaklaşımı detaylandırmak. İdrar kolonizasyonuna, patogeneze ve antimikrobiyal direncin yayılmasına katkıda bulunan kromozomal ve ekstrakrozomal genetik elementlerin incelenmesinde yararlı olan tam, dairesel genom dizilerinin üretimi için tekrarlanabilir bir prosedür sağlar.

Kısa ve Uzun Süredir Okunan Dizileme Teknolojilerini Kullanarak İdrar Bakterilerinin Tam Genomlarının Üretilmesi için Hibrit De Novo Genom Montajı

Mycobacterium tuberculosis'in aşağı akış hedefli yeni nesil dizilemesi için manyetik boncuk saflaştırması ile birleştirilmiş matris tabanlı bir ekstraksiyon yöntemi kullanarak dekontamine balgamdan DNA ekstraksiyonu için optimize edilmiş bir yöntem sunuyoruz.

Dekontamine Balgam Örneklerinde Hedeflenen Yeni Nesil Dizileme için Matris Tabanlı DNA Ekstraksiyonu

Öğrenin, tükürükten yüksek kaliteli genomik DNA izolasyonu için hücre lizi, RNA ve protein safsızlıklarının giderilmesi, çöktürme ve saflaştırma adımlarını. Bu maliyet etkin yöntem, PCR ve dizileme için uygundur.

Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

Daha fazla video keşfet