Name: Bulaştırmak için bir protokol Caenorhabditis elegans Ile Salmonella typhimurium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Öğrenin C. elegans ile Salmonella typhimurium enfeksiyon protokolünü ve RNAi kullanarak konak savunma genlerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir çerçeve sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yazının eleştirel okuma Dr Diane Baronas-Lowell teşekkür ederim. Bu çalışma, Fen Tohum Grant bir FAU Charles E. Schmidt Koleji ve KJ için Ellison Tıp Vakfı bir Yaşlanma Bursu tarafından desteklenen

1.. XLD (ksiloz Lizin desoksikolat) Agar Tabaklar XLD agar XLD agar plakaları üzerinde siyah koloniler görünür Salmonella, bir seçimli büyüme ortamı kullanılarak bir. Kontaminasyon endişeler vardır, ancak normal bir LB plakası ikame edilebilir. <ol><li> 5 ml iyonu giderilmiş su içinde 5.5 g XLD agar ve tekrar süspansiyon tartıldı. </li><li> Tüm ağar ıslak kadar iyice karıştırın. Topaklar gitti ve ortam tamamen yeniden süspansiyon haline gelinceye kadar deiyonize su 95 ml ilave edilir. </li><li> Tamamen (otoklavlamayın yok) eritmek için orta kaynatın. </li><li> 50 ° C oda sıcaklığında, ortam soğutun </li><li> Her biri 95 x 15 mm (çap x yükseklik) plaka (Parafilm ile sızdırmaz plakalar, 1 ay boyunca 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir) 25 ml agar dökün. </li></ol> 2.. Nematodu Büyüme Orta (NGM) RNAi Tabaklar Besleme C. hazırlanması elegans NGM plakalar, daha önce tarif edilmiştir 19. Burada bir prosedür kısaca RNAi besleme plakaları yapmak için NGM ortamı içine antibiyotik ampisilin ve RNAi kimyasal indüktör izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin tarif edilir. <ol><li> 3 g NaCl ve 1 L iyonu giderilmiş su içinde 2.5 g Bacto pepton çözülür. </li><li> Ortam içine 17 gr Bacto ağar ekleyin. </li><li> 45 dakika boyunca ortam otoklav ve bir su banyosu içerisinde 50 ° C&#39;ye kadar ortam soğutun. </li><li> 1 ml kolesterol (% 95 etanol içinde 5 mg / ml), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO 4 ve 25 ml 1 M potasyum fosfat tamponu (pH 6.0): aşağıdaki çözümleri ekleyin. İyice karıştırın. </li><li> 1 ml 1 M IPTG ve 500 ul ampisilin (steril su içinde 100 mg / ml) eklenir. </li><li> Iyi çözüm karıştırın ve Pipet yardımcısı kullanarak ve steril prosedürleri takip 25 mi serolojik pipet 60 x 15 mm (çap x yükseklik) petri tabak içine dökün. 12 ml agar ile her bir plak doldurun. Plakalar kadar 1 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol> Temel autophagy geni bec-1 Salmonella enfeksiyonuna karşı savunma bir konak genin işlevini incelemek için bir örnek olarak kullanılmıştır. Deney prosedürleri, Şekil 1 ve Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. Bulaşmasına RNAi ile muamele edilmiş hayvanların hazırlanması için protokol, parantez içinde verilmektedir, her deney aşamasının gün izler. <ol><li> Bec-1 RNAi besleme inoküle ve 100 mg / ml ampisilin (Gün 1) ile desteklenmiş 2 ml LB ortam içine -80 ° C donmuş bakteri pul yerleştirilerek boş vektör L4440 RNAi bakteri besleme kontrolü. Taze RNAi bakteri olması tüm deney boyunca haftada bir kez bu adımı tekrarlayın. Kullanılmadığı zaman, 4 ° C buzdolabı içinde kültür saklayın. </li><li> RNAi tabakalarına RNAi bakteri kültürü gece boyunca 100 ml tohum. Üç bec-1 RNAi ve üç kontrol boş v hazırlayınRNAi plakaları ector. 37 ° C gece boyunca (Gün 2) de inkübe edin. </li><li> 37 ° C inkübatör RNAi plakaları kaldırmak ve onları bankta oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Besili L4 vahşi tip N2 Hermafroditler Pick up ve onları RNAi-1 bec ve boş vektör RNAi plakaları kontrol transfer. , Üçlü plakalar üzerinde, plaka başına üç solucanlar yerleştirin. Aşama 3.2 (Gün 3) &#39;de anlatılan ile aynı günde, RNAi plakaları hazırlar. </li><li> Adım 3.3 &#39;de hazırlanan taze gelen RNAi plakaları 36-40 saat ve transfer solucanlar için 20 ° C inkübatör solucanlar ile RNAi inkübe edin. Solucanlar aktarılır sonra 64 saat (Gün 4) için 20 ° C inkübatör içinde inkübe edin. </li></ol> 4. Enfeksiyon için Salmonella hazırlayın <ol><li> Streak Salmonella -80 ° C dondurulmuş 1 XLD agar plaka üzerinde stok ve gece (5 Gün 37 ° C plaka inkübe </stRong&gt;). </li><li> Bir iyi izole edilmiş siyah Salmonella koloni almak ve (Gün 6) bir karışımı çalkalanarak 37 ° C&#39;de 2 ml LB ortamı içinde inoküle. </li><li> 1 C. Tohum 80 ml ​​Salmonella gecede kültür elegans 60 x 15 mm (çap x yükseklik) NGM agar plaka ve toplam 6 plakaları hazırlamak. 6 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bakteri kültürü plakasının (Gün 7) üzerine, bir çim kuru ve oluşturmalıdır. </li></ol> Salmonella, 5. Infect RNAi ile muamele Worms <ol><li> Transferi bec-1 RNAi tedavi ve Salmonella plakalarına boş vektör RNAi tedavi L4 N2 çift cinsiyetli (Adım 3 kurmak solucanlar döl) kontrol eder. Her bir grup için 3 levhaları üzerinde plaka başına 40 solucanlar yerleştirin. 48 saat (Gün 7) 20 ° C&#39;de sonsuz inkübe edin. </li><li> Adım 3.1 ve 3.2 (Gün 7&#39;de tarif edildiği gibi, taze RNAi plakaları bir takım hazırlanması ve <strong&gt; Gün 8). </li><li> 48 saatlik enfeksiyondan sonra, aşama 5.2 &#39;de hazırlanan karşılık gelen RNAi plakalara Salmonella ile enfekte olmuş solucan aktarın ve 20 ° C (gün 9) de inkübe edilir. </li></ol> 6.. Kurtuluş Testi <ol><li> Günlük solucanlar hayatta Puan ve yumurtlama zamanında taze gelen RNAi plakaları solucanlar transfer. Adım 3.1 ve 3.2 &#39;de tarif edildiği gibi önceki her sarmal transfer taze RNAi plakaları bir dizi hazırlayın. Yavaşça bir uçtan basık platin tel ile solucan vücudu (baş, orta kısım ve kuyruk) dokunun. Solucan gövdesinin hiçbir hareket görülmediği takdirde bir solucan ölü olarak puanlanır. </li><li> Günlük solucan veya her gün hayatta kalma Puan ve solucanlar yumurta döşeme durdurmak sonra iki kez bir hafta taze gelen RNAi plakaları solucanlar transfer. </li><li> Tüm solucanlar Öldükten sonra, bir veri kümesi olarak üçlü plakaları sağkalım verileri havuzu. GraphPad P olarak uygun istatistiksel yazılım içine her grubun girdi sağkalım verilerisağkalım eğrileri oluşturmak ve Kaplan-Meier sağkalım analizi yapmak Rism. Tüm deney sonucu teyit etmek için en az bir kez tekrarlanır. </li></ol>

<ol><li>Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. , (1997).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+host+for+the+study+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions.</a> Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).</li>
<li>Kurz, C. L., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+an+emerging+genetic+model+for+the+study+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity.</a> Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).</li>
<li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).</li>
<li>Ford, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+descriptive+study+of+human+Salmonella+serotype+typhimurium+infections+reported+in+Ontario+from+1990+to+1997%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997.</a> Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).</li>
<li>Voetsch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoodNet+estimate+of+the+burden+of+illness+caused+by+nontyphoidal+Salmonella+infections+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States.</a> Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).</li>
<li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li>
<li>Alegado, R. A., Tan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antimicrobial+peptides+contributes+to+persistence+of+Salmonella+typhimurium+in+the+C.+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine.</a> Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).</li>
<li>Jia, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+protect+against+Salmonella+typhimurium+infection+and+mediate+insulin+signaling-regulated+pathogen+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).</li>
<li>Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans-based+screen+identifies+Salmonella+virulence+factors+required+for+conserved+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions.</a> Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).</li>
<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+by+self-digestion%3A+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li>
<li>Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+controls+Salmonella+infection+in+response+to+damage+to+the+Salmonella-containing+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole.</a> J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+C.+elegans+Sequencing+Consortium.+Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282, 2012-2018 (1998).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+specific+RNA-mediated+interference+through+ingested+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 2, 1-10 (2001).</li>
<li>Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+RNA-mediated+interference+feeding+strategy+to+screen+for+genes+involved+in+body+size+regulation+in+the+nematode+C+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans.</a> J. Vis. Exp. (72), (2013).</li>
<li>Fraser, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+C.+elegans+chromosome+I+by+systematic+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference.</a> Nature. 408, 325-330 (2000).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%3A+the+online+review+of+C+elegans+biology%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).</li>
<li>Aballay, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+mediated+by+ced-3+and+ced-4+protects+Caenorhabditis+elegans+from+Salmonella+typhimurium-mediated+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).</li>
<li>Melendez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+genes+are+essential+for+dauer+development+and+lifespan+extension+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans.</a> Science. 301, 1387-1391 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

C. elegans onun besin kaynağı olarak bakteri yiyor basit bir genetik model organizmadır. Böylece, C arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir bağırsak patojen ile normal bakteriyel gıda yerine kolaydır elegans ve seçilen patojen. Burada bir protokol Salmonella enfeksiyonu ve C birleştirmek için açıklanan elegans RNAi Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için tedavi besleme. Önceki enfeksiyon protokolleri C. maruz <...

Serbest yaşayan toprak nematod Caenorhabditis elegans birçok biyolojik soruları incelemek için kullanılan basit ve genetik uysal bir model organizmadır. C. elegans egemen kendini gübreleme çift cinsiyetli olarak var. Erkekler kendiliğinden gametogenezi 1,2 sırasında X kromozomu olmayan disjunction tarafından oluşturulur. Bol yiyecek, C varlığında elegans sürekli yetişkin Dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Sıcaklık da C etkilemektedir elegans gelişimi; Daha hızlı gelişimi, daha yüksek sıcaklıklarda görülmektedir. Laboratuvarda, C. elegans gıda 1,2 olarak tohumlanmış bakteri Escherichia coli (suş OP50) ile agar plakaları üzerinde 20 ° C&#39;lik bir sabit bir sıcaklıkta kültürlenir. Son on yıl içinde, C. elegans konak-patojen 3-5 incelemek için bir omurgasız organizma olarak ortaya çıkmıştır. Doğada, C. elegans onun nutrien olarak bakteri yiyort kaynak 1,2. Bu normal bakteri laboratuar gıda, OP50, kolayca C arasındaki etkileşimi incelemek için diğer patojenler ile ikame edilebilir elegans ve seçilen herhangi bir patojen. Bu koşullar altında, bağırsak enfeksiyonun birincil sitesidir. Gerçekten de, bakteriyel patojenlerin geniş bir yelpazede ölümcül C enfekte ettiği gösterilmiştir elegans 3-5. Gram-negatif bakteri Salmonella çapında 6,7 insan gıda kaynaklı hastalığa neden olan bir gastrointestinal patojendir. C. Bu bakteri çoğaltır ve kalıcı bağırsak enfeksiyonları 8-10 sergiler gibi elegans Salmonella typhimurium için iyi bir model ev sahipliği yapmaktadır. C. elegans roman hem tanımlamak için kullanılmıştır, ve daha önceden bilinen Salmonella hastalık oluşturma faktörleri 11. İlginç bir şekilde, C. elegans bağışıklık sistemi başarıyla Salmonella çoğaltma sınırlar. O Inhib önce rapor edilmiştirautophagy genlerin enfraruj C&#39;de artan Salmonella çoğaltma işler elegans, enfekte solucan 10 erken ölüm ile sonuçlanır. (Burada Otofaji olarak anılacaktır) Macroautophagy bozulması için 12 lizozom teslimat için sitoplazma ve ayırmak için hücre içi organellere zarlarının yeniden düzenlenmesini içeren bir dinamik bir süreçtir. Autophagy C. Salmonella çoğaltma sınırlamak için bildirilmiştir elegans ve memeliler de 10,13. C. elegans genomu ilk çok hücreli ökaryot genom olduğu; Bu RNAi tedavi 14-16 yanıt verici olmaktadır. Ayrıca, RNAi RNAi 16,17 besleme olarak bilinen hedef genin, bir iki-şeritli RNA içeren bakteri yemek için solucan tabi tutulması ile etkili bir şekilde idare edilebilir. Tüm genom RNAi besleme kütüphaneler genom RNAi 16,18 taranması için oluşturulan edilmiştir. Burada, bir Salmonella enfeksiyonu protocol RNAi test C&#39;ye izin beslenme ile birleştiğinde Salmonella enfeksiyona karşı koruma kabiliyetleri için ilgi çekici elegans genler.

<table><tbody><tr><td>LB Et Suyu</td><td>Fisher</td><td>BP9723-500</td><td></td></tr><tr><td>XLD agar</td><td>EMD Kimyasalları</td><td>1.05287.0500</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Fisher</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Fisher</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat</td><td>Fisher</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>12481C50</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td> Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı 95 x 15 mm</td><td>Fisher</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kabı 60 x 15 mm&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>08-757-13A</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Serolojik pipet</td><td>Fisher</td><td>13-668-2</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Express Pipet Yardımı</td><td>Fisher</td><td>13-675-42</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ6000 çalkalama inkübatör&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Percival</td><td>I-36DL</td><td></td></tr></tbody></table>

bulaştırmak için bir protokol<em&gt; caenorhabditis elegans</em&gt; ile<em&gt; salmonella typhimurium</em

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Son on yıl içinde, C. elegans gram-negatif bakteri Salmonella typhimurium karşı ev sahibi savunma da dahil olmak üzere, ana ve patojen arasındaki etkileşimleri incelemek için bir omurgasız organizma olarak ortaya çıkmıştır. Salmonella C bağırsakta inatçı enfeksiyon oluşturur elegans ve enfekte olmuş hayvanlar arasında erken ölüm ile sonuçlanır. Bağışıklık bir takım mekanizmalar C de tespit edilmiştir Salmonella enfeksiyonlarına karşı savunmak için elegans. Autophagy, evrimsel olarak muhafaza edilmiş lizozomal bozunma yolağı, C. Salmonella çoğaltma sınırlamak için gösterilmiştir elegans ve memelilerde. Burada, protokol C bulaştırmak için açıklanan Solucanlar Salmonella, insanlarda enfeksiyona benzer bir süre için, Salmonella maruz edildiği Salmonella typhimurium ile elegans. Salmonella enfeksiyonu önemli C ömrü kısaltır elegans &lt;/ Em&gt;. Bir örnek olarak temel autophagy geni bec-1 kullanarak, C ile bu enfeksiyon yöntemi Birleştirilen elegans RNAi yaklaşım besleme ve bu protokol C işlevini incelemek için kullanılabilir gösterdi Salmonella enfeksiyonu karşı savunmada elegans konak genler. Yana C. elegans tüm genom RNAi kütüphaneler kullanılabilir, bu protokol kapsamlı C taranması için mümkün kılan genom RNAi kütüphaneleri kullanılarak Salmonella ve diğer bağırsak patojenlere karşı korumak elegans genler.

20 ° C&#39;de, vahşi tip N2 solucanlar medyan ömrü. Salmonella enfeksiyonu belirgin 10.5 gün N2 solucanlar medyan ömrünü azaltır 17 gün (Şekil 2A ve Tablo 2) (p = 0.0002, log-rank testi) (Şekil 2A .) Bir C. elegans geninin Salmonella hastalıklara karşı önemli bir rol oynar, kendi inhibisyon Salmonella enfeksiyona karşı yatkınlığın vermek olacağı tahmin edilmektedir. Aslında, Salmonella ile enfekte...

C. elegans konak-patojen etkileşimleri çalışmak için yeni bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada C bulaştırmak için bir protokol açıklar Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için çift iplikli RNAi girişim tekniği ile birleştiğinde Salmonella typhimurium ile elegans.

Bulaştırmak için bir protokol<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ile<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Bu prosedürün genel amacı, konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için C. elegans'ı salmonella ile enfekte etmektir. Bu işlem, öncelikle bir konakçı geninin ekspresyonunun RNAi ile inhibe edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise RNAi uygulanmış solucanları salmonella ile enfekte etmektir.Enfekte solucanların patojenik olmayan rna göz besleme plakalarına aktarılmasıyla enfeksiyon durdurulur. Son adımlar, enfekte solucanların sağkalım oranlarını kaydetmektir. Bu verilerden sağkalım oranını hesaplayın ve nihayetinde salmonella'ya karşı koruma için temel olan genleri belirleyin.Prosedürü, bir laboratuvardan teknisyen Julie John gösterecek. Gerekli kültür plakalarını hazırlayarak başlayın. İlk olarak, XLD agar plakaları hazırlayın.Bu plaklarda siyah koloniler şeklinde görünen salmonella için seçicidirler. Tam su hacmiyle karıştırmadan önce XLD agarını mililitre başına bir gram olacak şekilde suda yeniden süspanse ettiğinizden emin olun. Otoklavlamayın.Bu agar, bir ısıtıcı tabla ile ısıtılmıştır. Plaka başına 25 mililitre agar ekleyerek 95 milimetre çapında XLD plakalarının hazırlanmasına geçiniz. RNAi plakaları olarak adlandırılan RNAi içeren NGM besleme plakalarını hazırlamak için standart yöntemleri kullanın; kısaca, medya otoklavlandıktan sonra besiyerine ampicillin ve RNAi kimyasal indükleyici olan IPTG ekleyin.Soğuduktan sonra 60 mm'lik plakaları 12 mL agar ile doldurun; plakalar, kullanımdan önce 4 °C'de saklandığında bir aya kadar kullanılabilir. Plakalar önce bakterilerle inkübe edilir. Bu örnekte, Salmonella'ya karşı savunma için gerekli olduğundan Beck 1 hedef gendir.RNAi ve kontrol kültürlerinin hazırlanmasıyla başlayın. -80 °C depolama alanından alınan dondurulmuş bakteri örneğini, ampicillin içeren 2 mL LB besiyerine ekleyin. Bakteriler ya RNAi eksprese etmeli ya da RNAi eksprese etmeyip boş bir vektör içermelidir.Bu iki kültürü bir inkübatöre aktarın ve gece boyunca büyütün. Bakterilerin ertesi gün her zaman hazır bulunması için bu işlem haftalık olarak yapılmalıdır. RNA göz plaklarına kültürden 100 µL ekleyin.Her bir plaka tipinden en az üç adet deney ve üç adet kontrol grubu hazırlayın. Bu plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plakaları oda sıcaklığına getirin.Ardından, iyi beslenmiş L4 evresindeki yaban tipi N2 hermafroditleri plakalara aktarın. Plaka başına üç solucan yeterli olacaktır. Bu plakaları aynı gün 20 °C'de inkübe edin.Kültürlenmiş bakterilerle daha fazla RNAi plakası hazırlayın. 20 °C'de 36 ila 40 saat bekledikten sonra, solucanları ilk RNAi plakalarından yeni RNAi plakalarına aktarın. Ardından, solucanları 64 saat daha 20 °C'ye geri koyun.-80 °C dondurucudaki salmonella stokunun bir XLD plakasına ekilmesiyle başlayın. Plakayı 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plaktan izole bir siyah koloni seçin ve iki mL LB'ye inoküle edin.Ertesi sabaha kadar 37 °C'de gece boyunca çalkalanacak şekilde ayarlayın. İnoküle edilmiş LB'yi altı NGM plağını ekmek için kullanın. Oda sıcaklığında altı saat bekledikten sonra her plağa 80 µL uygulayın; bakteri kültürü kurumuş olmalı ve NGM plakları üzerinde bir bakteri çimlenmesi (lawn) oluşturacaktır.Ardından, RNAi uygulanmış solucanları ve kontrol uygulanmış solucanları altı plakaya aktarın. Her plakaya 40 solucan yerleştirin ve 20 °C'de 48 saat boyunca inkübe edin. Bu aşamadan itibaren her gün yeni RNAi plakaları hazırlamaya başlayın.Bu işlem, solucanların iki gün sonra ve takip eden her gün sağkalım analizi için hazır olmalarını sağlamak içindir. 48 saat sonra, enfekte solucanları yeniden hazırlanmış RNAi plakalarına veya boş vektör kontrol plakalarına aktarın. Bu plakaları daha sonra, her gün yumurtlama saatleri civarında 20 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin.Solucan sağkalım oranını belirleyin ve sağ kalanları, sağkalımı değerlendirmek üzere taze RNA göz plaklarına aktarın. Solucanları düzleştirilmiş bir platin tel ile nazikçe dürterek kontrol edin. Yanıt alınamıyorsa solucan ölmüştür.Yumurta dökme süreci boyunca, solucanlar tespit edilmeli ve ardından iç hijyen amacıyla itlaf edilmelidir. Bu solucanlar zamanında uzaklaştırılmalıdır.Bu protein solucanları deneysel solucanlar olarak belirgin şekilde sayılırsa, veriler anlamlı derecede düzenli olacaktır. Solucanlar yumurtlamayı bıraktığında, onları haftada iki kez taze RNAi plaklarına aktarmak yeterlidir. Popülasyonlar öldüğünde, verilerini birleştirin ve sağkalımlarını Kaplan-Meier eğrileri üzerinde grafiğe dökün.Sonuç ne olursa olsun, emin olmak için deneyi en az iki kez tekrarlayın. 20 °C'de, vahşi tip N two solucanlarının medyan yaşam süresi 17 gündür. Salmonella enfeksiyonu, Bek one RNAi tedavisiyle beklendiği üzere N two solucanlarının medyan yaşam süresini önemli ölçüde azaltarak 10,5 güne düşürür.Salmonella enfeksiyonu sonrası sağkalım oranında azalma. Ortalama yaşam süresi 10.5 günden dokuz güne düşmüş ve maksimum yaşam süresi de anlamlı derecede kısalmıştır. Bu durum, Beck one'ın deniz zarafetini enfeksiyona karşı korumadaki rolünü desteklemektedir.Beck one RNAi ile işlem gören ancak salmonella ile enfekte edilmeyen hayvanlar. Ömürlerinde belirgin bir değişiklik gözlenmedi. Bu videoyu izledikten sonra, konak geninin salmonella enfeksiyonuna karşı savunmadaki rolünü incelemek için RNA yaklaşımının ve enfeksiyon protokolünün nasıl uygulanacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-protocol-to-infect-caenorhabditis-elegans-with-salmonella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Chen, Y. ve diğerleri. Caenorhabditis elegans modelinde Aeromonas enfeksiyonunun virülansı ve patogenezi değerlendirilmesi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, C. elegans kullanılarak Aeromonas patogenezini modellemek için bir hayatta kalma testini gösteriyor; burada bakterilerin ağızdan yutulması bağırsak enfeksiyonu ve ölüme yol açarak canlı bir konak sisteminde bakteriyel virülansın nicel olarak değerlendirilmesini sağlıyor.

C. elegans'ta Aeromonas Patogenezi'nin Hayatta Kalma Testi Kullanılarak Modellenmesi

Wormsorter floresan gazetecilere ifadeye göre solucanlar sıralayarak Caenorhabditis elegans genetik ekranları kolaylaştırır. Burada, yeni bir kullanımını tanımlamak: GFP-ifade patojen tarafından kolonizasyon göre sıralama, ve biz bağışıklık tepkilerini başlatarak patojen tanıma anlaşılamamıştır rolünü incelemek için istihdam.

Otomatik Ayırma<em&gt; C. elegans</em&gt; Değişken derecelerde Bakteriyel Patojen tarafından kolonileştirildiğini

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Kültürleme Caenorhabditis elegans Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Zebra balığı (Danio rerio) yaygın olarak kullanılan omurgalı hayvan için bir model mikrobiyal kolonizasyon ve Patogenez hale gelmektedir. Bu iletişim kuralı protozoon Terliksi Hayvan caudatum gıda kaynaklı hastalık içinde zebra balığı larva için bir araç olarak açıklar. P. caudatum kolayca bakteri içselleştirmesi ve doğal preying davranış ile larva zebra balığı tarafından alınan.

Protozoon Terliksi Hayvan caudatum zebra balığı larva gıda kaynaklı enfeksiyonlar için bir araç olarak kullanma

Bu protokol, transmural inflamasyon ve fibrozis de dahil olmak üzere Crohn hastalığının önemli patolojik işaretleri benzer Salmonella tahrikli bağırsak fibrozis bir fare modeli açıklar. Bu yöntem, C57Bl/6 genetik arka planda tutulan mutant fareler kullanılarak fibrotik sonuçları değiştiren konak faktörlerinin değerlendirilmesi için kullanılabilir.

Kronik Salmonella EnfeksiyonuNa Bağlı Bağırsak Fibrozisi

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Caenorhabditis elegans'ın mikrosporidian parazit Nematocida parisii tarafından enfeksiyonu, solucanların aynı patojene karşı oldukça dirençli yavrular üretmesini sağlar. Bu, kötü anlaşılmış bir epigenetik fenomen olan kalıtsal bağışıklığın bir örneğidir. Mevcut protokol, genetik olarak izlenebilir bir solucan modelinde kalıtsal bağışıklığın incelenmesini açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Mikrosporidia Enfeksiyonu Modelinde Kalıtsal Bağışıklığın İncelenmesi

Bağırsak mikropları, konakçılarının sağlığını spesifik veya korunmuş mekanizmalar yoluyla olumlu veya olumsuz yönde etkileyebilir. Caenorhabditis elegans , bu tür mikropları taramak için uygun bir platformdur. Mevcut protokol, solucan sağlığı için bir vekil olarak kullanılan nematod stres direnci üzerindeki etki için 48 bakteri izolatının yüksek verimli taramasını açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans Health Üzerinde Etkisi Olan Mikrobiyal İzolatların Yüksek Verimli Taraması

Bu protokol, dış bakterileri uzaklaştırmak için soğuk felç ve yüzey ağartmayı takiben bireysel bakteriyel olarak kolonize Caenorhabditis elegans'ın 96 kuyucuklu bir bozulmasını tanımlar. Elde edilen süspansiyon, çok sayıda bireysel solucanda bakteri yükünün doğru, orta verimli bir şekilde ölçülmesini sağlamak için agar plakaları üzerine kaplanmıştır.

Caenorhabditis elegans-Bakteriyel Etkileşimlerde Heterojenliği Ölçmek için Tek Solucanlı Verileri Kullanma

Öğrenin C. elegans ile Salmonella typhimurium enfeksiyon protokolünü ve RNAi kullanarak konak savunma genlerini nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, konak-patojen etkileşimlerini incelemek için güvenilir bir çerçeve sunar.

Bulaştırmak için bir protokol

Daha fazla video keşfet