Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Bu prosedürün genel amacı, tanımlanmış hipokampal parvalbümin pozitif inter nöronlarda GABA B reseptörü aracılı etkileri karakterize etmektir. Bu, önce yüksek kaliteli akut hipokampal dilimler üreterek gerçekleştirilir. İkinci adım, venöz YFP ekspresyonuna ve paral albümin pozitif nöronların bilinen özelliklerine dayalı olarak nöronları seçmek için bir video mikroskobu kullanmaktır.

Daha sonra tüm hücre yaması klemp kayıtları elde edilir ve GABA B reseptörü aracılı etkileri incelemek için hücre dışı stimülasyon veya eşleştirilmiş kayıtlar kullanılır. Son adım, nöronları görselleştirmek ve kaydedilen nöronların aslında par albümin pozitif olduğunu ve para somatik veya dendritik inhibitör nöronlar olduğunu doğrulamaktır. Sonuç olarak, bu yöntem GABA B reseptörü aracılı inhibitör etkilerin karakterizasyonunu sağlar ve kaydedilen inter nöronların kesin olarak sınıflandırılmasına izin verir.

Bu yöntem, nöronlar arası alandaki temel soruları cevaplayabilir. Örneğin, inter nöronların birbirleriyle nasıl iletişim kurduğu, uyarılabilirlikleri, sinaptik çıktıları nöromodülatör sistemler tarafından kontrol edilir. Bu yöntem GABAerjik, hipokampalın nöronlara kontrolü hakkında bilgi sağlasa da, diğer beyin bölgelerine, nöromodülatör sistemlere veya hücre tiplerine de uygulanabilir.

Beyni, yarı donmuş karbojen sükroz, bir neşter kullanarak bir BOS içinde tutulan floresan venöz YFP'yi eksprese eden 17 ila 24 günlük bir transgenik sıçandan alın, korteksin ön üçte birlik kısmını, beyinciği çıkarın ve hemisferleri ayırın. Beyni bölümlere ayırmak için yapıştırmak üzere düz bir yüzey sağlamak için korteksin sırt yüzeyini çıkarın. Rozen karbojen doğal sükroz ile doldurulmuş viome banyosu ile yarım küreleri viome aşamasına yapıştırın.

Bir BOS, hipokampal oluşumun 300 mikrometre enine dilimlerini kesti. Her dilimi, 35 santigrat derecede bir CSF olan karbojen sükroz içeren batık bir tutma odasına aktarın. 30 dakika Son dilimi ısıtılmış sakarozun içine yerleştirdikten sonra, A BOS dilimleri saklamak için oda sıcaklığına aktarın.

Yama pipetlerini cam kılcal damarlardan çekin, böylece iki ila dört mega ohm'luk bir pipet direnci elde edilir. Doldurulduğunda, hipokampal bir dilimi kayıt odasına aktarın ve tek ipek lifleriyle gerilmiş bir platin halka ile yerinde tutun. Odayı kayıt kurulumuna yerleştirin ve dakikada beş ila 10 mililitre akış hızında karbojen ısıtmalı kayıt A CSF ile perfüzyona başlayın.

40 x objektif büyütmede I-R-D-I-C optikler altında dilim kalitesini değerlendirmek için bir video kamera kullanın. Dilimin iyi kalitede olduğunu varsayalım. Tabaka parametresinde çok sayıda yuvarlak, orta derecede kontrastlı ca bir parametal hücresi varsa, pürüzsüz ve hafif kraterli bir yüzeyin altında 20 ila 30 mikrometre derinliklerde görülebilir.

Epi floresan aydınlatma kullanarak, stratum parama içinde veya yakınında büyük çok kutuplu somatik ile venöz YFP eksprese edenler olarak varsayılan hızlı sivrilen inter nöronları tanımlayın. Daha sonra, sinaptik sonrası akımların tanımlanması için yama pipetlerini düşük ve fizyolojik olarak uygun klorür konsantrasyonu içeren bir çözelti ile doldurun ve kafa aşamasındaki pipet tutucusuna yerleştirin. Ardından boru hattı boyunca düşük bir pozitif basınç uygulayın.

Pipeti, seçilen nöronun merkezine hafifçe kaydırarak dilimin yüzeyine indirin. Basıncı 70 ila 80 milibara yükseltin ve pipeti dilimden hızla seçilen hücrenin soma'sının hemen üzerine indirin. Üzerinde bir çukur oluşturmak için pipeti hücre zarına doğru bastırın.

Bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Komşu hücrelerin biyotin etiketlemesini önlemek için, basıncı serbest bırakarak ve aynı anda pipete negatif 20 milivolt voltaj komutu uygulayarak bir giga ohm contası oluşturun. Sızdırmazlık başladıktan sonra, voltaj komutunu tipik olarak negatif 70 ile negatif 60 milivolt arasında beklenen dinlenme membranı potansiyeline düşürün.

Şimdi zar yamasını yırtmak için kısa bir negatif basınç darbesi uygulayın, böylece tüm hücre konfigürasyonunu elde edin. Akım kelepçesi modunu kullanarak, hızlı yükselen inter nöronları, depolarize edici akım darbelerine karşı bir hiperpolarizan aileye verdikleri tepkilere göre tanımlayın. Sinaptik olarak uyarılmış yanıtları gözlemlemek için, stratum radyumun ve stratum laun oum moleküler kaydının sınırındaki dilime hücre dışı bir stimülasyon elektrodu yerleştirin.

Voltaj kelepçesi modunda, her 20 saniyede bir pre-sinaptik aksonlara beş adet 50 voltluk elektrik uyaranından oluşan tek veya 200 hertz treni iletmek için izole edilmiş bir sabit voltaj stimülatörü kullanın. Daha sonra, izole edilmiş monosları ortaya çıkarmak için banyoya iyonotropik glutamat reseptör antagonistleri uygulayın. Sinaptik IPSC.

GABA B reseptörü aracılı IPSC'yi, bir reseptör antagonisti olan GABA'nın uygulanmasıyla daha fazla izole edin. Eşleştirilmiş kayıtlara başlamak için. İlk olarak, daha önce olduğu gibi bir pre-sinaptik inter nöronun tam hücre kaydını oluşturun ve hızlı sivri fenotipi onaylayın.

Daha sonra, presinaptik inter nöronu tutan inter nöronun 20 ila 100 mikrometre mesafesindeki bir CA bir parametal hücresini yamalayın. Akım kelepçesi modunda. İnter-nörondaki aksiyon potansiyellerini ortaya çıkarmak için kısa SRA eşiği depolarize edici akım darbeleri uygulayın.

Sinaptik bir bağlantı varsa, inter nörondaki aksiyon potansiyelleri, bir parametal hücrenin kenetlenmiş voltajında IPC'lere neden olur. Bir bağlantı kurulduktan sonra, 50 milisaniyelik bir aralıkla iki depolarize edici uyaranın tipik bir eşleştirilmiş nabız protokolü ile pre-sinaptik hızlı sivrilen inter nöronda aksiyon potansiyeli çiftleri ortaya çıkarır. Kontrol izlerini topladıktan sonra, seçici GABA B reseptörü agonisti baklofen'i perfüze eden A BOS'a uygulayın, böylece GABA B reseptörlerini aktive edin.

Daha sonra, reseptör aracılı etkileri tamamen bloke etmek için antagonist CGP 55 8 45'i uygulayın. Kayıt tamamlandıktan sonra, pipeti voltaj kelepçesindeki hücre gövdesinden yavaşça çekin. Seri ölçülen direnç arttıkça, dıştan dışa doğru bir yama oluşturarak somatik membranı kapatmak için membran voltajını eksi 40 milivolta düşürün.

Kayıtları takiben, dilimleri gece boyunca dört santigrat derecede 0.1 molar fosfat tamponlu %4 para formaldehit içine daldırarak sabitleyin, ardından fosfat tamponlu salin içinde sabitleyin ve %10 normal keçi serumu %0.03 TRITTON X 100 ve %0.05 Sodyum azid ile oda sıcaklığında bir saat boyunca par albümin ekspresyonu için etiketlemek için, PBS'de %5 normal keçi serumu, %0.3 TRITTON X 100 ve %0.05 Sodyum azid içeren bir çözelti içinde seyreltilmiş bir anti parvalbümin monoklonal fare antikoru kullanın, birincil antikorları dört santigrat derecede iki ila üç gün inkübe edin. İnkübasyondan sonra, dilimleri PBS'de iyice durulayın, bir florokrom ile konjuge edilmiş bir biyotin bağlayıcı protein strippin ile birlikte floresan anti-US ikincil antikorları uygulayın ve %3 normal keçi serumu, %0.1 tritton X 100 ve %0.05 Sodyum içeren bir çözelti içinde inkübe edin. PBS inkübe edilmiş gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, dilimleri PBS ile iki ila üç kez bolca durulayın, ardından fosfat tamponunda iki ila üç durulayın.

Dilimleri cam slaytlara monte edin ve dilimin çökmesini önlemek için 300 mikrometrelik bir agar ara parçası kullanın. Ardından, dilimleri flüoresan bir montaj ortamı ile örtün, kaydırın ve oje ile kapatın. Yüksek büyütme ve sayısal açıklık ile inter nöronun par albümin immünoreaktivitesini değerlendirin.

Objektif lens hücreleri par albümin için immünoreaktif kabul edilir. İmmüno etiketlemenin biyotin etiketli yapılarla uyumlu olduğu görülürse, lazer taramalı konfokal mikroskop, morfolojik tanımlama ve üç boyutlu rekonstrüksiyon için floresan Aden görüntüleme ile Z ekseni bir dizi görüntü alın. Daha sonra görüntüyü, dendritik ve aksonal arborizasyonu içeren üç boyutlu olarak nöron halinde yeniden oluşturun.

Tek bir hücre dışı uyarana yanıt olarak hızlı sivrilen bir inter nöronun bileşik sinaptik tepkisi burada gösterilmiştir. İyonotropik glutamat reseptör antagonistlerinin, DNQX ve A PV izolatlarının, monos sinaptik inhibitör post-sinaptik akımın veya gabaa reseptör antagonistinin IPSC uygulamasının uygulanması. Gazin, IPSC'nin hızlı bileşenini kaldırdı.

Beş uyarandan oluşan bir tren, daha sonra CGP'nin uygulanmasıyla bloke edilen yavaş bir GABA B reseptörü aracılı IPSC'yi ortaya çıkardı. Bu izler, banyo, baklofen uygulaması ve ardından CGP uygulaması sonrası kontrol koşulları altında CA one parametal hücrelerinde pre-sinaptik, hızlı sivrilen inter nöron ve kısa gecikmeli üniter I PSC'lerde aksiyon potansiyellerini göstermektedir. Baklofen'in IPSC genliğini yaklaşık% 50 oranında azalttığını, GABA B reseptör antagonistinin ise IPSC genliğinin neredeyse tamamen geri kazanılmasına neden olduğunu unutmayın.

IPSC genliğinin bir zaman rotası grafiği, 20 x büyütmede gösterilen baklofen ve CGPA hızlı sivrilen inter nöronun etkisini gösterir, stratum radyumun sınırında bulunan bir somat ve ca'nın parama bebeği, dendritlerin dikey olarak çalıştığı ve tüm katmanları kapsadığı bir alana sahiptir. Aksonun çoğunluğu, sepet hücreleri için tipik olarak hücre gövdesi katmanının içinde ve çevresinde bulunurken, 60 x büyütme görüntüsü, turuncu yıldızla işaretlenmiş, varsayılan bir parametal salata etrafında oluşan tipik akson sepetlerini gösterir. Aynı inter nöronun üç boyutlu bir rekonstrüksiyonu burada soma ve dendritler siyah ve akson kırmızı olarak gösterilmiştir.

Ca'nın katmanları, ustalaştıktan sonra mavi renkle tasvir edilmiştir. Bu teknik, geliştirildikten sonra aynı anda birkaç dilim üzerinde yapılan doktora sonrası morfolojik analiz ile bir günde gerçekleştirilebilir. Bu birleşik yaklaşım, hipokampal ve kortikal mikro devreler araştırmacılarının, morfolojik fizyolojik çeşitliliğin yanı sıra nöron tipleri arası yapı fonksiyon karşılıklı ilişkisini keşfetmelerinin yolunu açtı.