Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Bu prosedürün genel amacı, tanımlanmış hipokampal parvalbumin pozitif inter nöronlarda GABA B reseptör aracılı etkileri karakterize etmektir. Bu, öncelikle yüksek kaliteli akut hipokampal dilimler üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, venöz YFP ekspresyonuna ve parvalbumin pozitif nöronların bilinen özelliklerine dayanarak nöronları seçmek için bir video mikroskobu kullanmaktır.

Ardından, tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) kayıtları alınır ve GABA B reseptör aracılı etkileri incelemek için hücre dışı stimülasyon veya eşleşmiş kayıtlar kullanılır. Son adım, nöronları görselleştirmek ve kaydedilen nöronların gerçekten par albumin pozitif olduğunu ve parasomatik veya dendritik inhibitör nöronlar olduğunu doğrulamaktır. Nihayetinde bu yöntem, GABA B reseptör aracılı inhibitör etkilerin karakterize edilmesini sağlar ve kaydedilen inter nöronların kesin bir şekilde sınıflandırılmasına olanak tanır.

Bu yöntem, internöron alanıyla ilgili temel sorulara yanıt verebilir. Örneğin, internöronların birbirleriyle nasıl iletişim kurduğu, eksitabilitelerinin ve sinaptik çıktılarının nöromodülatör sistemler tarafından nasıl kontrol edildiği gibi. Bu yöntem, hipokampal internöronların GABAerjik kontrolü hakkında içgörü sağlasa da, diğer beyin bölgelerine, nöromodülatör sistemlere veya hücre tiplerine de uygulanabilir.

Yarı donmuş karbogen sükroz, A CSF içinde tutulan, floresan venöz YFP ekspres eden 17 ila 24 günlük transgenik bir sıçanın beynini alın; bir bistüri yardımıyla korteksin ön üçte birlik kısmını ve serebellumu çıkarın ve hemisferleri ayırın. Kesitleme işlemi için beyni yapıştıracak düz bir yüzey sağlamak amacıyla korteksin dorsal yüzeyini kaldırın. Hemisferleri, viome banyosu donmuş karbogen doğal sükroz ile doldurulmuş haldeyken viome tablasına yapıştırın.

Hipokampal formasyonun 300 µm kalınlığında transvers kesitlerini A CSF ile kesin. Her bir kesiti, 35 °C'de karbogen sakroz A CSF içeren daldırılmış bir bekleme haznesine aktarın. Son kesit ısıtılmış sakroz A CSF içine yerleştirildikten 30 dakika sonra, kesitleri saklama amacıyla oda sıcaklığına aktarın.

İki ila dört mega ohm'luk bir pipet direnci elde edilecek şekilde patch pipetlerini cam kapillerlerden çekin. Pipetler doldurulduğunda, tekli ipek liflerle tutturulmuş bir platin halka yardımıyla hipokampal dilimi kayıt odasına aktarın. Odayı kayıt düzeneğine yerleştirin ve karbogen ile ısıtılmış kayıt A CSF'si ile dakikada beş ila 10 mililitre akış hızında perfüzyona başlayın.

Kesiyleme kalitesini, 40 x objektif büyütmesinde I-R-D-I-C optikleri altında bir video kamera kullanarak değerlendirin. Kesimin kaliteli olduğunu varsayalım. Pürüzsüz ve hafif çukurlu bir yüzeyin 20 ila 30 mikrometre altındaki derinliklerde, stratum parameter tabakasında çok sayıda yuvarlak, orta kontrastlı ca one parametal hücre görülebiliyorsa.

Epi floresan aydınlatma kullanarak, stratum pyramidale içinde veya yakınında büyük multipolar somalara sahip olan ve venöz YFP eksprese eden hücreleri, muhtemel hızlı ateşleme yapan internöronlar olarak tanımlayın. Ardından, post-sinaptik akımların tanımlanması için düşük ve fizyolojik olarak uygun klorür konsantrasyonu içeren bir çözeltiyle patch pipetlerini doldurun ve bunları kafa düzeneğindeki pipet tutucuya yerleştirin. Daha sonra, tüp hattı aracılığıyla düşük bir pozitif basınç uygulayın.

Pipeti, seçilen nöronun merkezinden hafifçe kaydırılmış şekilde dilimin yüzeyine indirin. Basıncı 70 ila 80 milibara yükseltin ve pipeti hızla dilim boyunca seçilen hücrenin somasının hemen üzerine kadar indirin. Hücre membranında bir çukur oluşturmak için pipeti hücre membranına doğru bastırın.

Bu adımı hızlıca gerçekleştirin. Komşu hücrelerin biotinle etiketlenmesini önlemek için, basıncı serbest bırakarak ve aynı anda pipete negatif 20 millivolt voltaj komutu uygulayarak giga ohm mühür oluşturun. Mühürleme başladığında, voltaj komutunu tipik olarak negatif 70 ile negatif 60 millivolt arasında olan beklenen dinlenme membran potansiyeline düşürün.

Şimdi, membran yamasını yırtmak ve böylece tüm hücre konfigürasyonunu sağlamak için kısa süreli bir negatif basınç darbesi uygulayın. Akım kenetleme (current clamp) modunu kullanarak, hiperpolarize edici ile depolarize edici akım darbesi serisine verdikleri yanıtlara göre hızlı spike atan internöronları tanımlayın. Sinaptik olarak uyarılan yanıtları gözlemlemek için, ekstrasellüler bir stimülasyon elektrodunu kesit içindeki stratum radiatum ve stratum lacunosum moleculare kayıt sınırına yerleştirin.

Voltaj klembi modunda, pre-sinaptik aksonlara her 20 saniyede bir, beşer adet 50 voltluk elektriksel stimülastan oluşan tekli veya 200 hertz'lik trenler uygulamak için izole bir sabit voltaj stimülatörü kullanın. Ardından, izole monosinaptik IPSC'leri ortaya çıkarmak için banyoya ionotropik glutamat reseptör antagonistleri uygulayın.

Bir GABA a reseptör antagonisti uygulayarak GABA B reseptörü aracılı IPSC'yi daha fazla izole edin. Paired kayıtlarına başlamak için; öncelikle, daha önce yapıldığı gibi bir pre-sinaptik internöronun whole-cell kaydını gerçekleştirin ve hızlı spiking fenotipini doğrulayın.

Ardından, presinaptik internöronu tutan pipetin 20 ila 100 mikrometre mesafesine bir CA1 piramidal hücresi yaması yapın. Akım kenetleme (current clamp) modunda, internörona aksiyon potansiyellerini tetiklemek için kısa SRA eşik depolarizasyon akım darbeleri uygulayın.

Eğer bir sinaptik bağlantı mevcutsa, ara nörondaki aksiyon potansiyelleri, voltaj klempli ca bir parametral hücrede IPC'lere yol açar. Bir bağlantı kurulduğunda, 50 milisaniyelik aralıklı iki depolarizasyon uyaranından oluşan tipik bir çiftli darbe protokolü ile presinaptik hızlı ateşleyen ara nöronda aksiyon potansiyeli çiftleri oluşturun. Kontrol izleri toplandıktan sonra, perifüzyon yapan A CSF'ye seçici GABA B reseptör agonisti baklofen uygulayarak GABA B reseptörlerini aktive edin.

Ardından, reseptör aracılı etkileri tamamen bloke etmek için antagonist CGP 55 8 45 uygulayın. Kayıt tamamlandığında, pipeti voltaj klembi modunda hücre gövdesinden yavaşça geri çekin. Seri ölçülen direnç arttıkça, dışa açık (outside-out) bir yama oluşturarak somatik membranı mühürlemek için membran voltajını negatif 40 milivolta düşürün.

Kayıtlardan sonra, dilimleri %4 paraformaldehit içeren 0,1 molar fosfat tamponunda dört derece Celsius'ta gece boyunca dökerek sabitleyin; ardından fosfat tamponu ve sonra fosfat tamponlu salin ile yıkayın; parvalbumin ekspresyonunu işaretlemek için %10 normal keçi serumu, %0,03 TRITTON X 100 ve %0,05 sodyum azid içeren çözelti ile oda sıcaklığında bir saat boyunca bloklayın. PBS içinde %5 normal keçi serumu, %0,3 TRITTON X 100 ve %0,05 sodyum azid içeren bir çözeltide seyreltilmiş anti-parvalbumin monoklonal fare antikoru kullanın ve primer antikorları dört derece Celsius'ta iki ila üç gün boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından dilimleri PBS ile iyice durulayın; florokroma konjuge edilmiş biotin bağlayıcı streptavidin ile birlikte floresan anti-US sekonder antikorlarını uygulayın ve %3 normal keçi serumu, %0,1 tritton X 100 ve %0,05 sodyum azid içeren PBS çözeltisinde dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün dilimleri iki ila üç kez bol PBS ile durulayın ve ardından iki ila üç kez fosfat tamponunda yıkayın.

Kesitleri lam üzerine yerleştirin ve kesitin çökmesini önlemek için 300 mikrometre kalınlığında agar ara parçası kullanın. Ardından kesitleri floresan montaj ortamı ile kapatıp lamel yerleştirin ve tırnak cilası ile mühürleyin. İnter nöronun par albumin immünreaktivitesini, yüksek büyütme ve sayısal açıklık ile değerlendirin.

Objektif lens hücreleri, par albümin için immünoreaktif kabul edilir. İmmün etiketlemenin biotin etiketli yapılarla uyumlu olduğu görülürse, morfolojik tanımlama ve üç boyutlu yeniden yapılandırma için floresan Aden görüntülemesi yaparak lazer taramalı konfokal mikroskop ile Z ekseni görüntü serisi alın. Ardından, dendritik ve aksonal dallanmaları dahil ederek görüntüyü üç boyutlu bir nörona dönüştürün.

Hızlı spike yapan bir internöronun tek bir hücre dışı uyarana verdiği bileşik sinaptik yanıt burada gösterilmektedir. İyonotropik glutamat reseptör antagonistleri olan DNQX ve APV uygulaması, monosinaptik inhibitör postsinaptik akımı veya IPSC'yi izole eder; GABAa reseptör antagonisti olan gazin uygulaması ise IPSC'nin hızlı bileşenini ortadan kaldırır.

Beşli bir stimülasyon serisi, sonrasında CGP uygulanmasıyla bloke edilen, yavaş GABA B reseptörü aracılı bir IPSC ortaya çıkarmıştır. Bu izler; kontrol koşulları altında, banyo uygulamasıyla baclofen ve ardından CGP uygulandıktan sonra, pre-sinaptik, hızlı spike yapan inter nöronlardaki aksiyon potansiyellerini ve CA1 piramidal hücrelerindeki kısa latanslı üniter IPSC'leri göstermektedir. Baclofen'in IPSC genliğini yaklaşık %50 oranında azalttığına, GABA B reseptör antagonistinin ise IPSC genliğinde neredeyse tam bir geri kazanım sağladığına dikkat ediniz.

IPSC amplitüdünün zaman seyri grafiği, baklofen ve CGPA etkisini göstermektedir; 20 x büyütmede gösterilen hızlı ateşleme yapan inter nöronun soması, dendritleri dikey olarak uzanan ve tüm tabakalara yayılan CA1 bölgesinin stratum radiatum ve stratum pyramidale sınırında yer almaktadır. Aksonun büyük bir kısmı, sepet hücreleri için tipik olduğu üzere hücre gövdesi tabakasında ve çevresinde bulunurken, 60 x büyütmedeki bir görüntü, turuncu yıldızla işaretlenmiş muhtemel CA1 piramidal hücreleri etrafında oluşan tipik akson sepetlerini göstermektedir. Aynı inter nöronun üç boyutlu rekonstrüksiyonu, soma ve dendritler siyah, akson ise kırmızı renkte olacak şekilde burada gösterilmiştir.

CA1 katmanları mavi ile belirlenmiştir. Bu teknik bir kez kavrandıktan sonra, gelişimi tamamlanmış birkaç kesitte postdoktora morfolojik analizi tek bir günde gerçekleştirilebilir. Bu kombine yaklaşım, hipokampal ve kortikal mikro devre araştırmacılarının, internöron tiplerinin morfolojik fizyolojik çeşitliliğinin yanı sıra yapı-fonksiyon ilişkisini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.