Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

Elektroporasyon, hücre zarı üzerindeki geçici gözenekleri açmak için canlı hücrelere bir elektrik akımının uygulandığı bir tekniktir. Bu gözenekler sayesinde, normalde hücre zarını geçmeyen boyalar ve diğer moleküller hücreye girebilir, gözenekler hücreye zarar vermeden hızlı bir şekilde yeniden kapanır. Yapışan hücrelerin, kısmen elektriksel olarak iletken ve şeffaf malzeme ile kaplanmış bir slayt üzerinde büyüdükleri için nasıl elektroporasyona tabi tutulabileceğini açıklayacağız.

Malzeme indiyum kalay oksittir ve elektrik akımını ilettiği için bir boyanın hücreye girmesine izin veren gözenekleri açar. Daha sonra hücrelerin boşluk bağlantılarına sahip olup olmadığını ve kaç tane boşluk bağlantısının komşu hücrelerin iç kısımlarını birbirine bağlayan ve küçük moleküllerin geçişine izin veren küçük kanallar olduğunu incelemek mümkündür. Boşluk bağlantı iletişiminin hücrede neoplastik dönüşüm ve metastaz dahil olmak üzere çeşitli önemli işlevlere sahip olduğu uzun zamandır bilinmektedir.

Insitu kullanarak yapışık hücre elektroporasyonunun nasıl gerçekleştirileceği hakkındaki bu hücre projeleri sunumuna hoş geldiniz. Bu görüntü, ki bunu yapabileceğimiz, sarı için gevşek olan floresan boyanın, şeffaf ve iletken bir cam üzerinde büyüyen hücrelere sokulduğunu gösteriyor. Bu çizgiye kadar, çizgiyi faz kontrastı altında görmek daha kolaydır.

İşte burada. Boyanın, soldaki hücrelerden gelen ve sağdaki hücrelere elektroporasyon yoluyla boya yüklenmiş olan boşluk bağlantılarından yayıldığını görebilirsiniz. Bu floresan hücrelerin gradyanı ile sonuçlanan triplerdir.

İnize edildikten sonra santrifüjde bir Tüpe aktarılır. Hücrelerin hazne içinde büyüdükçe iyi dağılmaları çok önemlidir. Bu nedenle, tripsin izlerini gidermek için hücreleri santrifüjlemek en iyisidir.

Tripsin izleri olan ortam emilir, hücreler yaklaşık bir mililitre Büyüme ortamında yeniden süspanse edilir ve daha sonra hazneye kaplanır. Pipet, hücre süspansiyonunu içerir, kapağı Hazneden çıkarın ve taşımayı kolaylaştırmak için hücreleri hazneye damla damla pipetleyin. Oda, altı santimetrelik bir Petri kabına yerleştirilir.

Oda, hücrelerin büyümesi için inkübatöre geri döner. Kaplanmış hücreler iyi yayılacak ve birbirlerine dokunacak ve boşluk bağlantıları oluşturacak şekilde büyüyeceklerdir. Hücreler elektro geçit törenine hazır olduğunda, insitu puls üretecini istenen koşullara ayarlayın.

Basit kurulum işleminin açıklaması için kılavuza bakın. Cihazınızdaki voltaj ayarlandığında, tuş takımındaki kırmızı ışık yanacaktır. Kalsiyumsuz ısıtılmış iki DMEM şişesini su banyosundan çıkarın, biri kalsiyumsuz DMEM, ancak diyaliz serumu ve biri DMEM'dir.

Kalsiyum olmadan, pipetleri pipetleyiciye sarı renkte daha gevşek bir şekilde yüklemeye hazır bulundurun. İç çekmek yerine, hücreleri inkübatörden çıkarın. Ortamı önce yıkama kabında ters çevirerek çıkarın.

Daha sonra doku üzerine hafifçe vurun, kalsiyumsuz DMEM ile bir kez yıkayın, hücreler kuruyabileceğinden DMEM'in tamamını kesinlikle çıkarmaya çalışmayın. Hücreleri rahatsız etmeyecek şekilde Lucifer sarısını dikkatlice Bariyerin üzerine ekleyin, ancak hücrelerin kurumaması için yeterince hızlı bir şekilde ekleyin. Odanın her yarısı için 200 mikrolitre kullanın.

Kapağı insitu haznesine yerleştirin, ardından kaydırıcıya yükleyin. Kaydırıcıyı iterek haznenin uç tırnaklarının kaydırıcının yuvalarına oturduğundan emin olun. Hazneyi hazne tutucusuna yerleştirin.

Nabız üreteci tuş takımındaki nabız düğmesine basın. Darbe üreteci ve hazne tutucusu üzerindeki LED, elektroporasyon işlemi sırasında kırmızı renkte yanıp sönecek ve ardından başlatma döngüsünün tamamlandığını belirtmek için yeşil renkte yanıp sönecektir. Kaydırıcıyı hazne tutucusunun altına geri çekin ve hazneyi çıkarın.

Lucifer sarısının çoğunu tekrar kullanmak için aspire edin, ancak hücreleri kurutmamaya dikkat edin. Kalsiyum olmadan DMEM ekleyin. Diyaliz serumu ile serum, gözenekli haznenin kapanmasına yardımcı olur, Lucifer sarısının boşluk bağlantılarından aktarılması için inkübatöre geri döner.

Zamanlama, Deneyden Deneye tutarlı olmalıdır. Standart üç dakikadır. Ortamı atık kabın içine dökün.

Bir macun veya pipet ile% 4 formaldehit sabitleme solüsyonu ekleyin, oda sıcaklığında en az iki dakika bekleyin. Formaldehiti dökün ve birkaç kez durulayın. PBS ile hücreler cama sabitlenir, bu nedenle yıkama sırasında ayrılma tehlikesi çok azdır.

Faz kontrastı altındaki hücreleri görebilmek için, haznenin üstüne bir örtü fişi yerleştirmek önemlidir. Odayı PBS ile doldurun ve gururlu bir menisküs oluşturun. Hava kabarcıklarından kaçınarak kapak fişini yerleştirin.

PBS taşarsa endişelenmeyin, sadece fazla PBS'yi dokuya emdirin. Tercihen faz kontrastlı ve Lucifer sarısı için bir filtre bloğu olan ters çevrilmiş bir floresan mikroskobuna ihtiyacınız var. Aşamalı kontrast altında, elektroporasyonlu alanın kenarını arayın.

Floresan hücrelerin altında iki çizgi göreceksiniz. Slaytın yarısında yoğun bir şekilde floresan olacak. Parlayan hücrelere en yakın çizgi, elektroporasyonlu alanın kenarıdır.

Bunun ötesindeki herhangi bir floresan, lucer sarısının boşluk bağlantılarından aktarılmasından kaynaklanır. Örneğin, epitel hücrelerinin bu görüntüsü, görüntünün sol tarafında elektro olan hücreleri gösterir, Lucifer sarısını komşu elektroporasyonlu olmayan hücrelere aktarır ve iletken kaplamanın kenarından sağa doğru parlayan hücrelerden oluşan bir gradyan oluşturur. Bu görüntü, faz kontrastı altında aynı hücre çerçevesini göstermektedir.

X çizgisini çok net bir şekilde görebileceğinizi unutmayın. Ne kadar boşluk bağlantı transferinin meydana geldiğinin kantitatif bir ölçümü, elektroporasyonlu hücrelerin floresan ve faz kontrast görüntüleri ile çalışılarak manuel olarak yapılabilir. İletken alanın kenarındaki yıldızlar donör hücreler olarak kabul edilir.

Elektroporasyona tabi tutuldular ve sarı için serbest bırakıldılar. Sarı için luc'u sağdaki komşu hücrelere geçirirler, bu da onu iletir. Azalan miktarlarda daha da ileri.

Bu durumda noktaların 41'e sekiz yıldıza oranı, bu durumda boşluk bağlantı transferinin ne kadar geniş olduğunu karşılaştırmak için bir sayı üretebilir. 5.1, boşluk bağlantı indeksidir. Hücreleri manuel olarak işaretlemenin ve saymanın bir alternatifi, elektroporasyonlu bir hücre sınırının seçilmemiş Tarafı boyunca göreceli parlama miktarlarını ölçmek için görüntü analiz yazılımı kullanmaktır.

Bu hücrelerin boşluk bağlantıları yoktur. İşte elektroporasyonlu alanın sağ kenarı. Not, faz kontrastı altında boşluk bağlantılarının olmadığını gösteren floresan gradyanı yoktur.

Tüm hücreleri net bir şekilde görebilirsiniz. X çizgisinin de açıkça görülebildiğine dikkat edin. Bu örnekte.

Odadaki tüm hücreler epidermal büyüme faktörü EGF ile uyarıldı ve 10 dakika sonra fikse edildi ve fosfo ark için problandı. Sağdaki lekeli hücrelerin elektroporasyona tabi tutulmadığına ve soldaki bu çizgiye kadar olan hücrelerin elektroporasyona tabi tutulduğuna dikkat edin. Elektropore olmayan hücreler, bir fosfo irk antikoru ve immünoperoksidaz ile kahverengi lekelenme gösterir.

Elektroporasyonlu fosfo peptit, SSH iki grab iki alanını bloke ettiği ve EGF'nin irk fosforilasyonunu inhibe ettiği için elektroporasyonlu hücreler lekelenme göstermez. Çizginin sağındaki üç ila dört hücre uzunluğundaki bölgeye dikkat edin, burada hücreler elektro değildi, ancak lekelenme göstermiyor. Bunlar, boşluk bağlantıları yoluyla elektroporasyonlu komşularından bloke edici peptit edinmiş hücrelerdir.

Bu, sinyalin inhibisyonunun peptitten kaynaklanması gerektiğinin ve bir elektroporasyon eseri olamayacağının mümkün olan en güçlü göstergesidir. Bu hücreler elektroporasyonlu olmadığından, bu, faz kontrastı altında gösterilen çerçevenin aynısıdır. Elektroporasyondan sonra Morfolojide herhangi bir değişiklik olmadığına dikkat edin.

Bazı hastalarda, boşluk kavşak iletişimi tam olarak kantitatif olabilir: Çok çeşitli kültürlenmiş hücrelerde. Spesifik sinyal yolaklarını kesmek için peptitlerin tanıtılması, saflaştırılmış proteinlerle tanımlanan protein etkileşimleri olan proteinin canlı hücrelerindeki alaka düzeyini değerlendirmek için güçlü bir yaklaşımdır. Bu, peptit kubbe ilaçlarının geliştirilmesinde ilk önemli adım olabilir.