Name: Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Öğrenin, indiyum-kalay oksit kaplı yüzeylerde elektroporasyon yöntemiyle yapışık hücrelerde gap kavşak iletişimini nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik, hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında kilit bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Uzman videografi yardımı için Lowell Cochran'a teşekkür ederiz. Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR), Kanada Meme Kanseri Vakfı (CBCF, Ontario Bölümü), Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC), Kanada Meme Kanseri Araştırma İttifakı, Ontario Mükemmeliyet Merkezleri, Meme Kanseri Eylem Kingston ve Clare Nelson miras fonunun LR'ye verilen hibeler yoluyla sağladığı mali yardım minnetle kabul edilmektedir. SG, bir NSERC öğrenciliği aldı. MG, ABD Ordusu Meme Kanseri Programı, Ontario Eyaleti Araştırma ve Yenilik Bakanlığı ve Queen's Üniversitesi Danışma Araştırma Komitesi'nden doktora sonrası bir burs ile desteklendi.

1. Elektroporasyon Chambers Hücreleri Kaplama <ol><li> Laminer akış kaputu, her zamanki gibi steril tekniği kullanarak hücreleri trypsinize. Not: Bu, camın üzerine hücrelerin yayılmasını engelleyebilir, çünkü santrifüjle adherens ve boşluk bağlantıları bu nedenle oluşumunu tripsin tüm izlerini ortadan kaldırmak için çok önemlidir. </li><li> Pipet 1, 37 o C&#39;de in situ elektroporatörü içine (Şekil 1) ve yerine, CO2 inkübatör ile donatılmış steril elektroporasyon odalarında ml hücre süspansiyonu. Not: Hücre yapışması, fibronektin, kolajen, poli-lisin ya da hücre ve doku yapıştırıcı (Malzemeler Tabloya bakınız) üzerine kaplanarak artırılabilir. </li><li> Hücreler konfluent tabakası oluşturdular onlar GJIC inceleme için hazırdır. </li></ol> 2. Elektroporasyon Prosedürü GJIC muayene için elektroporasyon, bir laminer akış kaputu dışında yapılabiliralır bu yana sadece bir kaç dakika. Daha uzun inkubasyon süreleri belirli bir deney için gerekli olduğu durumda, o zaman bir laminer akış başlığı içinde tamamen yapılabilir. Tüm durumlarda, hücrelerin büyüdüğü odacıklar steril olması gerekmektedir. <ol><li> 5 mg / ml, Lucifer sarı bir çözelti hazırlayın: 2 mi Kalsiyum içermeyen büyüme ortamında (elektroporatörü ile birlikte verilme), 10 mg LY eritin. 4 o C&#39;deki solüsyonu ve mağaza filtre-sterilize, uzun inkübasyon sürelerine ihtiyaç duyar deneyler için </li><li> Büyüme ortamı aspire ve tek tabaka ya da sıfırdan hücreleri kurutmak için dikkatli olmak, kalsiyum-barındırmayan ortam maddesi ile hücreleri yıkayın. Hücreler kurutulur varsa genellikle koyu çekirdekleri ve elektroporasyon olmadan LY al. Etkisi daha hava akımı (Şekil 4F) maruz slayt ortasında daha belirgindir. </li><li> Bir Eppendorf pipet ile, bölme, B kenarında, hücreler (bütün odası için 400 ul), boya çözeltisinin pipetleDikkatli eing hücre tabakasını dokunmamaya. </li><li> Elektroporatörü ile birlikte tutucu odasına yerleştirin ve uygun kuvvette (Tartışma) bir darbe uygulamak. </li><li> Dikkatle LY çözümün bazı aspire. Bu deneyler için daha az önemli bir ikinci kez tekrar edilebilir. </li><li> ,% 10 serum ihtiva eden diyaliz kalsiyum içermeyen DMEM ekleyin. </li><li> Boşluk bağlantıları ile boya transferini sağlamak için inkübatör 3-5 dakika için kuluçkalayın. Not: Bu noktada, diyaliz serum dahil açıklıklarının kapanmasına yardımcı olur. </li><li> Canlı hücre gözlem için Kalsiyum içermeyen DMEM ile tüzel kişiliği olmayan boya yıkayın. Seçenek olarak ise, hücreler çukuruna% 4 formaldehit ilave edilmek suretiyle bu aşamada tespit edilebilir, daha sonra PBS (fosfat-tamponlu tuzlu su) ile yıkanmıştır. Tüm durumlarda yıkama tüm arka planı kaldırmak gerekir. NOT: Ön deneyler gerilimi çok düşükse, uygun koşulları belirlemek amacıyla, o hücrelerin incubato kurtarmak izin mümkündürBir kaç dakika boyunca r ve slaytlar maliyeti kurtarmak için, aynı Sürgü ikinci kez electroporate. </li></ol> 3. Mikroskobik İnceleme <ol><li> Kullanılan boya için uygun bir filtre ile donatılmış bir ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak, floresan aydınlatma altında hücreleri dikkate alınmalıdır. Sarı Lucifer, uyarma 423nm, emisyon 555nm, Nikon IX70 mikroskop için WBV filtre. </li><li> Faz kontrast altında hücre morfolojisini incelemek için, sıvı ile üst doldurduktan sonra, iyi plastik üstüne bir cam kapak-slip koyarak menisküs etkilerini ortadan kaldırmak. Daha iyi fotoğraflar için, iyi slayt ayrılabilir, ve lamel çerçeveye yerleştirilir. Canlı hücreler için bu büyüme ortamı ile doldurulması gerekir ise sabit hücreler için de, mikroskopik gözlem için gliserol ile doldurulabilir. NOT: Hücreler bir boya (yukarıdaki aşama 2.7) transferi aşağıdaki formaldehitle sabitlendi, eğer yıkama ve görüntüleme daha kolaydır. Hücreler ise hiçbirT floresan sabit hücrelerin floresans birkaç saat boyunca muhafaza edilir getirirken LY hücre tipi, gerilim ve miktarına bağlı olarak, yaklaşık 60 dakika içinde hücrelerden elimine edilir, sabit. Bununla birlikte, floresan kaybolur ya da sabit hücrelerde, O / N inkübasyondan sonra dağılır. Bu nedenle, fotoğraf elektroporasyon (Şekil 2) kısa bir süre sonra alınmalıdır. </li></ol> Hücreler arası İletişimin 4. Kantifikasyonu <ol><li> Floresans ve faz kontrast (Şekil 3) altında, bir 20x objektif ile hücrelerin fotoğraf. </li><li> Olmayan elektroporasyona alanı (Şekil 2, ok, elektroporasyon kenar) ile sınırında elektropore hücreleri belirlemek ve bir yıldız ile işaretleyin. </li><li> Boya boşluk bağlantıları aracılığıyla transfer olan-olmayan elektroporasyona tarafında, floresanlama hücreleri belirlemek ve bir işaret ile (Şekil 3A ve 3B). </li><li> Toplam sayısına bölünkenar (Şekil 3A ve 3B) boyunca elektroporate edilmiş hücrelerde sayısına göre olmayan elektroporasyona alanda hücreleri fluoresan. NOT: en az 200 bitişik Elektroporasyona çevresindeki hücrelerden Transfer, her bir deney için hesaplanır. Elde edilen sayı GJIC değerdir. </li></ol>

<ol><li>Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRaptis%2C+L+%22Electroporation+protocols%22">Electroporation protocols</a>. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).</li>
<li>Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+phosphotyrosine-binding+domain+inhibitors+on+insulin+receptor+signalling+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of phosphotyrosine-binding domain inhibitors on insulin receptor signalling and trafficking.</a> Mol Cell Biol. 17, 1180-1188 (1997).</li>
<li>Boccaccio, C., Ando, M., Tamagnone, L., Bardelli, A., Michielli, P., Battistini, C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+epithelial+tubules+by+growth+factor+HGF+depends+on+the+STAT+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of epithelial tubules by growth factor HGF depends on the STAT pathway.</a> Nature. 391, 285-288 (1998).</li>
<li>Bardelli, A., Longati, P., Gramaglia, D., Basilico, C., Tamagnone, L., Giordano, S., Ballinari, D., Michieli, P., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+signal+transducers+from+oncogenic+MET+mutants+abrogates+cell+transformation+and+inhibits+invasive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Uncoupling signal transducers from oncogenic MET mutants abrogates cell transformation and inhibits invasive growth.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 95, 14379-14383 (1998).</li>
<li>Gambarotta, G., Boccaccio, C., Giordano, S., Ando, M., Stella, M. C., Comoglio, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ets+up-regulates+met+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ets up-regulates met transcription.</a> Oncogene. 13, 1911-1917 (1996).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+techniques+affecting+Stat3+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Transfection techniques affecting Stat3 activity levels.</a> Anal Biochem. 338 (1), 83-89 (2005).</li>
<li>Boussiotis, V. A., Freeman, G. J., Berezovskaya, A., Barber, D. L., Nadler, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+human+T+cell+anergy%3A+blocking+of+IL-2+gene+transcription+by+activated+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Maintenance of human T cell anergy: blocking of IL-2 gene transcription by activated Rap1.</a> Science. 278 (5335), 124-128 (1997).</li>
<li>Brownell, H. L., Firth, K. L., Kawauchi, K., Delovitch, T. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+Ras+activation%3B+electroporation+of+%5Balpha-32%5DGTP%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of Ras activation; electroporation of [alpha-32]GTP.</a> DNA Cell Biol. 16, 103-110 (1997).</li>
<li>Tomai, E., Vultur, A., Balboa, V., Hsu, T., Brownell, H. L., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+compounds+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive compounds into adherent cells.</a> DNA Cell Biol. 22, 339-346 (2003).</li>
<li>Raptis, L., Vultur, A., Tomai, E., Brownell, H. L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+radioactive+nucleotides%3A+assessment+of+Ras+activity+and+32P-labelling+of+cellular+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+A+Laboratory+Handbook%2C+Celis%2C+Ed%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of radioactive nucleotides: assessment of Ras activity and 32P-labelling of cellular proteins.</a> Cell Biology A Laboratory Handbook, Celis, Ed. 43, 329-339 (2006).</li>
<li>Nakashima, N., Rose, D., Xiao, S., Egawa, K., Martin, S., Haruta, T., Saltiel, A. R., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+crk+II+in+actin+cytoskeleton+organization+and+mitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The functional role of crk II in actin cytoskeleton organization and mitogenesis.</a> J Biol Chem. 274, 3001-3008 (1999).</li>
<li>Raptis, L., Firth, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+adherent+cells+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of adherent cells in situ.</a> DNA Cell Biol. 9, 615-621 (1990).</li>
<li>Marais, R., Spooner, R. A., Stribbling, S. M., Light, Y., Martin, J., Springer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+tethered+enzyme+improves+efficiency+in+gene-directed+enzyme+prodrug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A cell surface tethered enzyme improves efficiency in gene-directed enzyme prodrug therapy.</a> Nat Biotechnol. 15, 1373-1377 (1997).</li>
<li>Nielsen, M. S., Nygaard, A. L., Sorgen, P. L., Verma, V., Delmar, M., Holstein-Rathlou, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Geletu, M., Trotman-Grant, A., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+regulation+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+the+SRC+oncogene+product+and+its+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; regulation of gap junctional, intercellular communication by the SRC oncogene product and its effectors.</a> Anticancer Res. 32 (10), 4245-4250 (2012).</li>
<li>Vinken, M., Vanhaecke, T., Papeleu, P., Snykers, S., Henkens, T., Rogiers, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer%3A+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer: A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp Cell Res. 168, 430-442 (1987).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Firth, K. L., MacKenzie, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+technique+for+the+study+of+intercellular%2C+junctional+communication%3B+electroporation+of+adherent+cells+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel technique for the study of intercellular, junctional communication; electroporation of adherent cells on a partly conductive slide.</a> DNA & Cell Biol. 13, 963-975 (1994).</li>
<li>Anagnostopoulou, A., Cao, J., Vultur, A., Firth, K. L., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+gap+junctional%2C+intercellular+communication+by+in+situ+electroporation+on+two+co-planar+indium-tin+oxide+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Examination of gap junctional, intercellular communication by in situ electroporation on two co-planar indium-tin oxide electrodes.</a> Mol Oncol. 1, 226-231 (2007).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, S., Campling, B. G., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+assay+for+intercellular%2C+junctional+communication+in+cultured+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A functional assay for intercellular, junctional communication in cultured human lung carcinoma cells.</a> Lab Invest. 78, 639-640 (1998).</li>
<li>Tomai, E., Brownell, H. L., Tufescu, T., Reid, K., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+communication+in+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Gap junctional communication in lung carcinoma cells.</a> Lung Cancer. 23, 223-231 (1999).</li>
<li>Geletu, M., Chaize, C., Arulanandam, R., Vultur, A., Kowolik, C., Anagnostopoulou, A., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+activity+is+required+for+gap+junctional+permeability+in+normal+epithelial+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stat3 activity is required for gap junctional permeability in normal epithelial cells and fibroblasts.</a> DNA Cell Biol. 28, 319-327 (2009).</li>
<li>Geletu, M., Arulanandam, R., Greer, S., Trotman-Grant, A., Tomai, E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+a+positive+regulator+of+gap+junctional+intercellular+communication+in+cultured%2C+human+lung+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Stat3 is a positive regulator of gap junctional intercellular communication in cultured, human lung carcinoma cells.</a> BMC Cancer. 12, 605(2012).</li>
<li>Brownell, H. L., Narsimhan, R., Corbley, M. J., Mann, V. M., Whitfield, J. F., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+is+involved+in+gap+junction+closure+in+mouse+fibroblasts+or+preadipocytes+but+not+in+differentiated+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+%26+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ras is involved in gap junction closure in mouse fibroblasts or preadipocytes but not in differentiated adipocytes.</a> DNA & Cell Biol. 15, 443-451 (1996).</li>
<li>Weber, P. A., Chang, H. C., Spaeth, K. E., Nitsche, J. M., Nicholson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+permeability+of+gap+junction+channels+to+probes+of+different+size+is+dependent+on+connexin+composition+and+permeant-pore+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The permeability of gap junction channels to probes of different size is dependent on connexin composition and permeant-pore affinities.</a> Biophys J. 87 (2), 958-973 (2004).</li>
<li>Graham, F. L., vander Eb, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+assay+of+infectivity+of+human+Adenovirus+5+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">A new technique for the assay of infectivity of human Adenovirus 5 DNA.</a> Virology. 52, 456-467 (1973).</li>
<li>Arulanandam, R., Vultur, A., Cao, J., Carefoot, E., Truesdell, P., Elliott, B., Larue, L., Feracci, H., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadherin-cadherin+engagement+promotes+survival+via+Rac%2FCdc42+and+Stat3%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res+7%22%5BJournal%5D)">Cadherin-cadherin engagement promotes survival via Rac/Cdc42 and Stat3.</a> Mol Cancer Res 7. , 1310-1327 (2009).</li>
<li>Williams, E. J., Dunican, D. J., Green, P. J., Howell, F. V., Derossi, D., Walsh, F. S., Doherty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+growth+factor-stimulated+mitogenesis+by+a+cell-permeable+Grb2-binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of growth factor-stimulated mitogenesis by a cell-permeable Grb2-binding peptide.</a> J. Biol. Chem. 272, 22349-22354 (1997).</li>
<li>Raptis, L., Brownell, H. L., Vultur, A. M., Ross, G., Tremblay, E., Elliott, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+Growth+Factor-stimulated+ERK1%2F2+activation+in+intact+cells+by+electroporation+of+a+Grb2-SH2+binding+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of Growth Factor-stimulated ERK1/2 activation in intact cells by electroporation of a Grb2-SH2 binding peptide.</a> Cell Growth Differ. 11, 293-303 (2000).</li>
<li>Meda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+the+molecular+permeability+of+connexin+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assaying the molecular permeability of connexin channels.</a> Methods Mol Biol. 154, 201-224 (2001).</li>
<li>Hofgaard, J. P., Mollerup, S., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+gap+junctional+intercellular+communication+based+on+digital+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of gap junctional intercellular communication based on digital image analysis.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 297 (2), R243-R247 (2009).</li>
<li>Raptis, L., Lamfrom, H., Benjamin, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+phenotype+and+expression+of+polyomavirus+middle+T+antigen+in+rat+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular phenotype and expression of polyomavirus middle T antigen in rat fibroblasts.</a> Mol Cell Biol. 5, 2476-2486 (1985).</li>
<li>Raptis, L., Marcellus, R. C., Whitfield, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+membrane-associated+protein+kinase+C+activity+correlates+to+tumorigenicity+but+not+anchorage-independence+in+a+clone+of+mouse+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">High membrane-associated protein kinase C activity correlates to tumorigenicity but not anchorage-independence in a clone of mouse NIH 3T3 cells.</a> Exp Cell Res. 207, 152-154 (1993).</li>
<li>Vultur, A., Cao, J., Arulanandam, R., Turkson, J., Jove, R., Greer, P., Craig, A., Elliott, B. E., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+to+cell+adhesion+modulates+Stat3+activity+in+normal+and+breast+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Cell to cell adhesion modulates Stat3 activity in normal and breast carcinoma cells.</a> Oncogene. 23, 2600-2616 (2004).</li>
<li>Vultur, A., Arulanandam, R., Turkson, J., Niu, G., Jove, R., Raptis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+is+required+for+full+neoplastic+transformation+by+the+Simian+Virus+40+Large+Tumor+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stat3 is required for full neoplastic transformation by the Simian Virus 40 Large Tumor antigen.</a> Mol Biol Cell. 16, 3832-3846 (2005).</li>
</ol>

Sorumlu yazar, Queen's Üniversitesi'nin sahip olduğu ve Cell Projects Inc.'e lisanslanmış bir patentin mucididir. Şirketin veya Üniversitenin makalenin içeriği üzerinde hiçbir etkisi yoktu.

Protokolünde kritik adımlar Elektroporasyona malzeme Elektropore edilecekse Malzemenin saflığı çok önemlidir. Hücreler, çok düz ise, izleme boyanın daha yüksek konsantrasyonlarda (20 mg LY / ml kadar) ve bu gibi durumlarda kullanılmalıdır, saflık: daha da önemlisi, daha küresel bir şekle sahip 1 hücrelerinde daha uzundur. LY Bunun yanı sıra, diğer boyalar ya da nonpermeant moleküllerin büyük bir çeşitlilik, örneğin başka bir connexins 25 oluşan kan...

Bir hücre için elektrik akımının uygulanması işlemi olarak adlandırılan bir elektroporasyon ile, hücre zarı üzerindeki gözeneklerin oluşmasına neden olur. Gözenekler zardan nonpermeant çeşitli moleküllerin geçişine izin verir. Elektrik alanı meydana getirilen gözenekler, çok küçük ve hücre fizyolojisinin çok az rahatsızlık ile, hızlı bir şekilde yeniden kapatmak böylece, hassas bir şekilde kontrol edilebilir. İlginç bir şekilde, yapışkan hücreler, süspansiyon içinde elektropore edilecekse koparılmadan, büyümek yüzeyi üzerinde iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit (İTO) ile kaplanmış ve in situ elektroporasyona bir cam slayt üzerinde büyütülebilir. Hücreler, bu yüzeyde çok iyi büyüyebilir, ve bağlı ve uzatıldıkça detaylı mikroskobik gözlem mümkündür. Bu tekniği kullanarak, küçük moleküller nonpermeant anında sunulan ve comp aktivasyonu üzerinde çalışmalar için özellikle uygun hale getirir, bu teknik, hücrelerin esas olarak% 100, içine edilebilir(1 gözden) bir reseptörünün ligand stimülasyon sonra yolun onents. Elektroporasyon DNA&#39;nın katılımı (buna electrotransfection) çoğunlukla kullanılmaktadır. Bununla birlikte, in situ elektroporasyon transkripsiyon faktörü bağlanma, veya siRNA 3,5 inhibe etmek için örneğin antisens RNA gibi çift iplikli DNA Decoy-Oligonükleotidleri gibi peptidler 2-4, oligonükleotidler gibi moleküller, büyük bir çeşitlilik sokulması için değerli olabilir, 6, radyoaktif nükleotidleri, 7-10, proteinler 11 12 ya da ön-ilaçları 13. Elektroporasyondan sonra hücreler, biyokimyasal analizler için lize veya sabit ve antikorlar ile boyanmış olabilir. Hücreler, iletken kaplamanın kenarı boyunca büyüdükçe hücre büyümesi, iki yüzeyin yükseklik farkından rahatsız etmeyecek şekilde iletken İTO kaplama, 800-1,000Å çok incedir. Bu durum şu avantaja sahiptir olmayan electropbu metne dahil edilmiştir hücreler kontrol olarak hizmet etmek üzere, elektroporasyona olanlar ile yan yana yetiştirilebilir. Video tarif edildiği gibi aynı yaklaşım, boşluk junctional, hücreler arası iletişim (GJIC) &#39;nin incelenmesi için de kullanılabilir. Gap kavşaklar komşu hücrelerin 14 iç bağlayan kanallardır. Src gibi onkogenler GJIC 15,16 bastırırken boşluk birleşim, hücreler arası iletişim, tümör oluşumu ve metastaz bakımından önemli bir rol oynar. Lucifer sarının (LY) çoğu zaman mikro-enjeksiyon ile kültürlenmiş hücreler içine dahil edilebilmekte ya da kazıma-yükleme 17 ve komşu hücrelere boyanın difüzyonu mikroskopik floresan aydınlatma altında görülmektedir olduğu gibi GJIC bir floresan boya incelemek. Bu teknikler ancak kaçınılmaz hücre hasarına neden olur. Şimdi hücreleri kısmen İTO 18 ile kaplanmış bir cam slayt üzerinde yetiştirilen bir tekniği açıklar. Bir elektrik atma LY (ya da diğer boyalar) varlığında ca uygulanmıştırbitişik olmayan elektroporate edilmiş hücrelerde, boyanın göçü, mikroskopik floresan aydınlatma ile gözlenirken, sürgünün iletken kısmına üzerinde büyüyen hücrelerin içine nüfuziyetini kullanılmıştır. Tek tabaka ayırmak için temayül rahatsız duyarlı hücreler önlemek için, bir elektrot gerektirmeyen tasarlanmış bir montaj elektrik akımı 19 uygulamak için hücrelerin üzerine yerleştirilmesini mümkün kılar. Serum uygulandıktan 12 uygulanarak G1 fazında uzunluğuna bir etkisinin olmaması ile gösterildiği gibi bu yaklaşım fos düzeylerindeki artış, hücre metabolizması için, belirgin bir bozulma olmadan hücrelerin çok sayıda GJIC ölçmek için olanağı sunar protoonkojenden protein (Raptis, yayınlanmamış) veya hücresel stres, p38 domuz veya JNK / SAPK&#39;ın kinaz 1 ile ilişkili iki kinazlardır. Onkojen ifadesi, transformasyon ve GJ düzeyleri arasındaki bağlantının incelenmesi mümkün hale Bu yaklaşımIC 18, hem de akciğer tümör örneklerinde 20-23 taze kültürlenmiş hücreler de dahil olmak üzere hücre tiplerinin, çeşitli içinde GJIC üzerine Src ve STAT3 etkisi. Buna ek olarak, alt-tabakaya bağlanma hücresel bu aşamada 19,24 azaltılır, ancak başarılı adipositik farklılaşması üzerine boşluk bağlantı kapağın gösterilmesi için kullanılan edilmiş bir üst elektrot yoksun tarif etmiş olup in situ elektroporasyon.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro http://www.cellgro.com/</td> <td>50-013-PB</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Hidroksilon İçermeyen DMEM</td><td>(Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com)</td><td>SH30319-01</td><td></td></tr><tr><td>Donör Buzağı Serumu&nbsp;</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# B15-008</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>PAA: http://www.paa.com/</td> <td>Cat.# A15-751</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon aparatı</td><td>Cell Projects Ltd İngiltere: http://www.cellprojects.com/</td> <td>ACE-100</td><td></td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd İngiltere</td><td>ACE-04-CC</td><td>4 kuyulu</td></tr><tr><td>Chambers</td><td>Cell Projects Ltd İngiltere</td><td>ACE-08-CC</td><td>8 kuyulu</td></tr><tr><td>Lucifer Sarı Hücre</td><td>Projeleri Ltd İngiltere</td><td>ACE-25-LY</td><td>Yüksek saflıkta</td></tr><tr><td>CelTak</td><td>BD Biosciences</td><td>354240</td><td>Hücre ve doku yapıştırıcısı</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Poli-Lizin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr></tbody></table>

gap kavşak sınavı fonksiyonel testi; İndiyum-kalay oksit yapışık hücrelerin elektroporasyonu

A Functional Assay for Gap Junctional Examination; Electroporation of Adherent Cells on Indium-Tin Oxide

Bu teknikte hücreler, kısmen şeffaf, elektriksel olarak iletken bir malzeme olan indiyum-kalay oksit (ITO) ile kaplanmış bir cam slayt üzerinde kültürlenir. Peptitler veya oligonükleotidler gibi çeşitli moleküller, travmatik olmayan bir şekilde hücrelerin esasen %100'üne sokulabilir. Burada, hücreler arası, boşluk kavşağı iletişimini incelemek için nasıl kullanılabileceğini açıklıyoruz. Lucifer sarısı, üzerinde büyüdükleri iletken yüzeye uygulanan bir elektrik darbesi, hücre zarı boyunca gözeneklerin oluşmasına neden olduğunda hücrelere nüfuz eder. Bu elektroporasyondur. Elektroporasyonlu bölgeye hemen bitişik iletken olmayan cam yüzeyde büyüyen hücreler, elektroporasyon yoluyla Lucifer sarısını almazlar, ancak floresan boyayı, onları elektroporasyonlu hücrelere bağlayan boşluk bağlantıları yoluyla kendilerine geçerken elde ederler. Boyanın hücreden hücreye transferinin sonuçları, floresan aydınlatması altında mikroskobik olarak gözlemlenebilir. Bu teknik, boşluk kavşağı iletişiminin kesin olarak ölçülmesine izin verir. Ek olarak, peptitlerin veya diğer kalıcı olmayan moleküllerin eklenmesi için kullanılabilir ve bitişik, elektroporasyonlu olmayan hücrelerdeki sinyali inhibe etmek için küçük elektroporasyonlu peptitlerin boşluk bağlantıları yoluyla transferi, sinyal inhibisyonunun güçlü bir göstergesidir.

Şekil 2, tespit ve yıkama sonrası floresan (Panel A ve B) kapsamında LY ile elektropore edildi ve fotoğraflandı sıçan karaciğer epitel hücreleri T51B 22, ya da faz-kontrast (C) aydınlatma göstermektedir. Panel A, electroporated alanın kenar kırmızı olarak işaretlenmiştir. Kırmızı çizginin sağında flüoresans gradyanı boşluk bağlantıları yoluyla transferini ifade eder. Boya transfer olan hücreler, bir nokta ile işaretlenmiş ise, elektroporasyona alanının kenarında Hücreler, bir yıldız ile belir...

Bu sunum, hücreler iletken ve şeffaf indiyum-kalay oksit ile kaplanmış bir slayt üzerinde büyürken, hücreler arası, kavşak iletişiminin incelenmesi için yapışık, kültürlenmiş hücrelerin elektroporasyonunun kullanıldığı bir yöntemi göstermektedir.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

In this technique, cells are cultured on a glass slide that is partly coated with indium-tin oxide (ITO), a transparent, electrically conductive material. ...

Elektroporasyon, hücre membranında geçici gözenekler açmak amacıyla canlı hücrelere elektrik akımı uygulanan bir tekniktir. Bu gözenekler aracılığıyla, normalde hücre membranını geçemeyen boyalar ve diğer moleküller hücreye girebilir; ardından gözenekler hücreye zarar vermeden hızla kapanır. Bu çalışmada, kısmen elektrik iletken ve şeffaf bir materyalle kaplanmış bir lam üzerinde büyüyen yapışkan hücrelerin nasıl elektropore edileceğini açıklayacağız.Materyal indiyum kalay oksittir ve elektrik akımını ilettiği için boyanın hücreye girmesine izin veren gözenekler açar. Böylece hücrelerin gap junction'lara (geçiş bağlantılarına) sahip olup olmadığı ve kaç tane gap junction bulunduğu incelenebilir; gap junction'lar, komşu hücrelerin iç kısımlarını birbirine bağlayan ve küçük moleküllerin geçişine izin veren küçük kanallardır. Gap junction iletişimin, neoplastik transformasyon ve metastaz dahil olmak üzere hücrede çeşitli önemli işlevleri olduğu uzun zamandır bilinmektedir.Insitu kullanılarak yapışık hücre elektroporasyonunun nasıl gerçekleştirileceğine dair bu hücre projeleri sunumuna hoş geldiniz. Bu görüntüde, şeffaf ve iletken bir cam üzerinde büyüyen hücrelere floresan boya Lucife

a-functional-assay-for-gap-junctional-examination-electroporation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Biz canlı hücrelerin boşluk bağlantıları aracılığıyla hücresel iletişim görselleştirmek için Lucifer Sarı bir tek hücreli mikroenjeksiyon gerçekleştirin ve bazı yararlı ipuçları sağlamak için nasıl burada açıklamak. Biz bu kağıt nedeniyle fonksiyonel gap junction hücresel bağlantı derecesini değerlendirmek için herkese yardımcı olacağını bekliyoruz. Burada tarif edilen her şey 1,000 Dalton altında molekül ağırlığına sahip diğer floresan boyalar için uyarlanmış, ilke olarak, olabilir.

Hücre Haberleşme Analizi İçin Tek hücreli Mikroenjeksiyon

Bu protokol Electric Cell-substrat Empedans Algılama, hücre eki, çoğalması, hareketliliği ve farmakolojik ve toksik uyaranlara hücresel yanıtların ölçümü için yapışık hücrelerin empedans spektrumu kaydetmek ve analiz etmek için bir yöntemi incelemektedir. Endotelial geçirgenliğin ve hücre-hücre ve hücre-yüzey kontaktların değerlendirilmesi tespiti vurgulanmıştır.

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Bu protokol gap junction kanalları aracılığıyla arası iletişimi ölçen bir neşter yükleme-floresan boya aktarımı teknik anlatılmaktadır. Gap Junctional hücrelerarası iletişim doku homeostazı korunur ve bu hücre sinyal bozulması olumsuz sağlık etkileri vardır edildiği önemli bir hücresel bir süreçtir.

Gap Junctional Hücreler arası iletişim: Doğal Ürünler Toksikantların ve Toksinler Yan Etkileri değerlendirmek için Fonksiyonel Biyomarker ve Sağlık Faydaları

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Burada, gap junction oransal kimyasal ilaç bulma ve toksikolojik değerlendirme için yüksek üretilen iş filtreleme için tasarlanmış bir roman gap junction hücreler arası iletişim tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Bir iyodür-Sarı floresan Protein-Gap Junction hücreler arası iletişim tahlil

Bağırsak epiteli sadece besin emilimini değil, aynı zamanda zararlı maddelere karşı koruma sağlar. Apikal-en epitelyal hücreler arası bileşke, yani sıkı bileşke, parasellüler çözünen ve iyon geçirgenliğini düzenler. Burada, mukozal tabakaların hazırlanması ve Ussing oda tekniği kullanılarak sıkı bağlantıların iyon seçiciliğinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Doğal Dokuda İntestinal Sıkı Bileşke Bariyeri ve İyon Geçirgenliğinin Ussing Oda Tekniği ile Fonksiyonel Olarak Değerlendirilmesi

Burada, Xenopus oositlerinde boşluk bağlantı proteinlerini eksprese etmek ve yüksek yan akım ölçüm modunda çift oosit voltaj-kelepçe kayıtları için tasarlanmış ticari bir amplifikatör kullanarak iki appoze oosit arasındaki bağlantı akımını kaydetmek için bir protokol sunuyoruz.

Ksenopus Oositlerinden Boşluk Bağlantı Akımının Kaydedilmesi

Gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP), tutarlı, yüksek verimli iletimi yüksek hücre canlılığı ile eşleştirir. Transepitelyal elektrik empedans (TEEI) ölçümlerinin tanıtılması, PSEP'in ara süreçleri hakkında bilgi sağlar ve etiketsiz teslimata olanak tanır. Bu makalede, PSEP dağıtım deneylerini ve TEEI ölçüm analizini aynı anda gerçekleştirmek için bir yöntem tartışılmaktadır.

Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon

Öğrenin, indiyum-kalay oksit kaplı yüzeylerde elektroporasyon yöntemiyle yapışık hücrelerde gap kavşak iletişimini nasıl inceleyeceğinizi. Bu teknik, hücre biyolojisi ve nörobilim araştırmalarında kilit bilgiler sunar.

Gap Kavşak Sınavı Fonksiyonel Testi; İndiyum-Kalay Oksit Yapışık hücrelerin elektroporasyonu

Daha fazla video keşfet