Name: Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Keşfedin, Trypanosoma brucei'den izole edilen mitokondri ve editozom kullanarak RNA düzenleme inhibitörlerinin yüksek verimli taraması için floresan tabanlı bir yöntemi. Bu hassas assay, editozom fonksiyonunu hızlıca analiz eder.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Najmeh Nikpour ve Fiona Alum önerilerde bulundular ve bu el yazmasını düzenlediler. McGill Üniversitesi Biyokimya Bölümü, Kimyasal Biyolojide CIHR Eğitim Girişimi ile HM ve VM'yi destekledi. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIHR) hibe 119464 (R. S.'ye) tarafından desteklenmiştir.

Aşağıdaki protokol floresan RNA dayalı düzenleme tahlilini yapmak için prosedür açıklanmaktadır. Deney, tek bir PCR tüpü, deney kapsamına bağlı olarak, 96 oyuklu, veya 384 oyuklu plakalar içerisinde gerçekleştirilir. Daha sonra, floresans sinyali uygun bir gerçek zamanlı PCR algılama sistemi üzerinde okunabilir. Burada deney 384 oyuklu plakalar bağlamında tarif edilmektedir. 1.. Kültürleme T. brucei Hücreler <ol><li> T. için bir büyüme ortamı hazırlayın brucei formu hücreleri procyclic. Ortamı, 1 L için: <ol><li> 800 ml&#39;lik mili Q suyu içinde 25.4 g SDM-79 tozu çözülür. </li><li> 10 M NaOH ile 7.3 &#39;e 2 NaHCO 3 g ve pH ekleyin. </li><li> 900 ml, filtre ile sterilize bir son hacme nanopure su ekleyin. </li><li> % 10 son konsantrasyonlara Fetal Bovine Serum (FBS), penisilin-streptomisin çözeltisi ve hemin (2.5 mg / ml) (v / v), 100 U / ml ve 7.5 mg / L idi. </li></ol></li><li> T &lt;300 ml büyümekem&gt; 1.5 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir yoğunluğa kadar 70 rpm&#39;de çalkalanarak 28 ° C&#39;de brucei 1.7A vahşi tip (procyclic form) hücreleri. Not: Bu aktif editosome 3 ml üretmelidir ~ 600 düzenleme reaksiyonlar için yeterli toplam protein, 0.5 mg. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 6000 x g&#39;de santrifüj ile hücreler hasat </li><li> Soğutulmuş PBSG tamponu, 50 ml (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 145 mM NaCl ve 6 mM glukoz) ile pelet yıkayın ve 10 dk için 10,000 x g&#39;de santrifüj ile tekrar hücrelerin aşağı spin 4 ° C. </li></ol> Ham Mitokondri 2.. İzolasyonu Not: Tüm adımlar editosome aktivitesini korumak için buz üzerinde ya da 4 ° C&#39;de gerçekleştirilmelidir. <ol><li> DTE tamponu, 30 ml (1 mM Tris-HCl, pH 8.0 ve 1 mM EDTA) içinde yeniden süspanse hasat edilen hücreler. Yukarı okşayarak ve aşağı buz üzerinde en az 10 defa hücre zarı bozmak için bir 40 ml steril Dounce homojenleştirici (pre-soğutulmuş) kullanın. </li&gt; <li> Tercihen mitokondri çökertmek için, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 15.800 x g&#39;de 0.25 M. Santrifüj bir son konsantrasyon elde etmek için homojenat için hemen 4.3 ml,% 60 sukroz (örneğin, 1.75 M w / v) ekleyin. </li><li> STM tampon maddesi (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM sukroz ve 2 mM MgCI2) 4.6 ml mitokondriyal pelletini. I, sırasıyla 0.3 mM ve 9 U / ml nihai konsantrasyonda 0.1 M CaCI2 13.8 ul ve RNase-barındırmayan DNase 4 ul ekleyin. Buz üzerinde 1 saat için karışımın inkübe edin. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 15,800 xg&#39;de DNase I Santrifüjü etkisiz hale getirmek için STE tampon 4,6 ml (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM sukroz ve 2 mM EDTA) ekleyin </li><li> 400 ul liziz tamponu (10 mM Tris-HCl pH 7.2, 10 mM MgCl2, 100 mM KCI, 1 ug / ml pepstatin, 1 mM DTT, ve 1 x tam EDTA içermeyen proteaz inhibitörü) ve bir transfer pelletini mikrofüj tüpü. </li><li> % 1 a bir nihai konsantrasyona kadar% 10 Triton X-100 eklemend bir boru döndürücüde 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe lizat. </li><li> 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 17,000 x g santrifüj ile iki kez mitokondriyal lizat temizleyin; temizlenmiş süpernatan her tutma. </li></ol> 3.. Editosome Arıtma <ol><li> Dökün 10 ml 10% -30% (40 mM HEPES pH 7.9, 20 mM Mg (OAc) 2, 100 mM KCl 2x HHE gradyan tamponu kullanılarak, bir ultra santrifüj tüp içinde (v / v) gliserol lineer gradyan (Tablo 1), ve 2 mM EDTA) ve kullanma kılavuzunu takip ederek bir degrade yapımcısı. </li><li> Dikkatlice gliserol gradyanın tepesinden çözeltisi 500 ul çıkarıp hafifçe silinir mitokondriyal lizat 500 ul yükleyin. Ultrasantrifüj işlemi kullanılarak 4 ° C&#39;de 6 saat boyunca 178,000 x g&#39;de Spin. </li><li> 4 ° C &#39;de, gradyanın alt üst sıralı 500 ul fraksiyonlar toplamak Sonra kullanıma kadar -80 ° C&#39;de sıvı azot ve mağaza kullanarak kesirler dondurma oturtun. </li></ol><ol><li> 3 dakika boyunca 90 ° C&#39;de ısıtma ile 1:1 &#39;lik bir mol oranında, bir T7 yükseltici oligonükleotid (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3&#39;) ile T7 promotörü dizisi (Tablo 2) tamamlayıcı bir sekansı içeren ve oda sıcaklığında soğutulduktan ilgili DNA şablonu tavlama en az 10 dakika karıştırıldı. </li><li> Kullanım kılavuzunu takip ederek in vitro transkripsiyon kiti kullanılarak RNA&#39;yı. </li><li> 7 M üre boya (7 M üre,% 0.05 ksilen Cynol ve% 0.05 bromofenol mavisi) eşit hacmi eklenerek transkripsiyon reaksiyonu durdurun. 9% poliakrilamid jel (% 9 akrilamid, 7 M üre, 1 x TBE) denatüre steril bir filtre üzerinde çalıştırın. </li><li> Bir bulmak için kısa dalga boylu UV lamba ve tüketim ilgili RNA ile ultraviyole (UV) gölgeleme kullanın. Bir mikrofüj tüpüne eksize jel parça koyun ve jel elüsyon tampon 400 ul (20 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaOAc, 1 mM EDTA ve% 0.25 SDS) ekleyin. Bir tüpü rotatifine oda sıcaklığında gece boyunca Zehir. </li><li> Precisoğuk% 100 etanol içinde 1 ml ilave edildi ve 30 dakika, -20 ° C, gece boyunca -80 ° C&#39;de ya da inkübe edilerek elüe RNA pitate. </li><li> RNA aşağı pelet 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> % 75 etanol içinde 1 ml pelet yıkayın. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 16,000 x g&#39;de santrifüje </li><li> Tablo 2&#39;de gösterildiği gibi, istenen konsantrasyonları elde etmek için RNase içermeyen su içinde uygun bir RNA topağı yeniden süspanse edin. </li></ol> 5. Floresans tabanlı RNA Düzenleme Testi <ol><li> Tek bir reaksiyon için, bir mikrofuj tüp içinde preA6Rbz 1 pmol (1 ul) ve 2.5 pmol gA6Rbz (1 ul) (1:2.5 mol oranı) bir araya 3 dakika boyunca 70 ° C&#39;de inkübe edilir ve bu da oda sıcaklığında bekletin en az 10 dak. </li><li> Bu arada (25 mM HEPES pH 7.9, 10 mM Mg (OAc) 2, 50 mM KCI ve 10 mM EDTA), 1 mM 1x HHE tampon içeren düzenleme reaksiyonu için, preA6Rbz ve gA6Rbz olmadan Tablo 3 kullanarak bir ana karışım hazırlamakATP, 5 mM CaCl2, Torula maya RNA,% 0.1 Triton X-100 ve saflaştırılmış editosome 16 ng / ml. </li><li> Ana karışımı tamamlamak için tavlı preA6Rbz ve gA6Rbz ekleyin. </li><li> RNase içermeyen su 2 ul (no bileşikleri ile kuyu) veya 200 uM kimyasal bileşiklerin birinin veya 2 ul birini içeren kuyu içine ana karışımı (Tablo 3) 18 ul koyun ve şekil 5&#39;e göre olan bir plaka içerisinde kontrol örneklerini içerir. </li><li> Bir plaka kapatıcı ile plaka Seal ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için aşağı plaka döndürün. 4 saat boyunca 28 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> Her bir oyuğa gA6Rbz yarışmacının 25 pmol (2 ul) ilave edin. Plakayı aşağı spin ve gerçek-zamanlı PCR makinesine koyun, taze bir mühürleyen yerleştirin. Aşağıdaki deney Programı: Adım 1: 5 dakika boyunca 85 ° C; Adım 2: 10 dakika boyunca 24 ° C; Adım 3: kes. </li><li> 23 ul son hacim olması için her bir oyuğa FRET alt-tabakanın 15 pmol (1 ul) ilave edin. Taze bir mühürleyen ile plaka mühür.Çabuk plaka spin ve real-time PCR makinede geri yerleştirin. </li><li> Aşağıdaki adımlara yeni bir deneme Programı: Adım 1: 1 dakika için 37 ° C; Adım 2: oku; Adım 3: 1, 40 kez Git Adım; Adım 4: durdurun. </li><li> Okuma gerektiren ve FAM filtresi seçmek tüm kuyuları seçerek Kur plaka. 23 ul ve çalışma başlatmak gibi giriş seviyesi. </li><li> Analizi için bir çubuk grafik üzerinde yamaçları çizilerek kinetik bir ölçümünü elde etmek için her bir oyuğa / numuneden elde edilen değerlerin eğimi hesaplanır. NOT: Bir kinetik okuma numune ve arka plan arasındaki sinyal-gürültü oranını iyileştirir; arkaplan örneği sıfıra yakın bir eğime sahip gibi. Bir uç nokta okuma yüksek bir arka plan gürültü vardır. </li></ol>

<ol><li>Benne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcript+of+the+frameshifted+coxII+gene+from+trypanosome+mitochondria+contains+four+nucleotides+that+are+not+encoded+in+the+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA.</a> Cell. 46, 819-826 (1986).</li>
<li>Hajduk, S., Ochsenreiter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+in+kinetoplastids%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">RNA editing in kinetoplastids.</a> RNA biology. 7, 229-236 (2010).</li>
<li>Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridine+insertion%2Fdeletion+editing+in+trypanosomes%3A+a+playground+for+RNA-guided+information+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews+RNA%22%5BJournal%5D)">Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer.</a> Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).</li>
<li>Seiwert, S. D., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing%3A+transfer+of+genetic+information+from+gRNA+to+precursor+mRNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro.</a> Science. 266, 114-117 (1994).</li>
<li>Weng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+RNA-binding+complex+from+mitochondria+of+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular%22%5BJournal%5D)">Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids.</a> Molecular. 32, 198-209 (2008).</li>
<li>Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TbRGG1%2C+an+essential+protein+involved+in+kinetoplastid+RNA+metabolism+that+is+associated+with+a+novel+multiprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex.</a> RNA. 14, 970-980 (2008).</li>
<li>Ammerman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+trypanosome+RNA+editing+accessory+complex%2C+MRB1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1.</a> Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).</li>
<li>Huang, C. E., O'Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+function+of+the+RNA+editing+complex+in+Trypanosoma+brucei+requires+band+III+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein.</a> Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).</li>
<li>Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+in+Trypanosoma+brucei+requires+three+different+editosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes.</a> Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).</li>
<li>Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+RNA+editing+complex%3A+band+II+is+structurally+critical+and+maintains+band+V+ligase%2C+which+is+nonessential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential.</a> Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).</li>
<li>Schnaufer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA+ligase+essential+for+RNA+editing+and+survival+of+the+bloodstream+form+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei.</a> Science. 291, 2159-2162 (2001).</li>
<li>Tarun, S. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KREPA6+is+an+RNA-binding+protein+essential+for+editosome+integrity+and+survival+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei.</a> RNA. 14, 347-358 (2008).</li>
<li>Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+of+trypanosomiases+and+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+parasitology%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis.</a> Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).</li>
<li>Denise, H., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+mode+of+action+of+drugs+used+against+sleeping+sickness%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness.</a> Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).</li>
<li>Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+uridylate+deletion+in+vitro+suggests+a+mechanism+for+kinetoplastid+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing.</a> Cell. 84, 831-841 (1996).</li>
<li>Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uridylate+addition+and+RNA+ligation+contribute+to+the+specificity+of+kinetoplastid+insertion+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing.</a> Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).</li>
<li>Igo, R. P. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+uridylate-specific+exoribonuclease+activity+in+Trypanosoma+brucei+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing.</a> Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).</li>
<li>Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hammerhead+ribozyme+substrate+and+reporter+for+in+vitro+kinetoplastid+RNA+editing%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing.</a> RNA. 8, 548-554 (2002).</li>
<li>Moshiri, H., Salavati, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+reporter+substrate+for+monitoring+RNA+editing+in+trypanosomatid+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens.</a> Nucleic Acids Res. 38, e138(2010).</li>
<li>Jenne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+identification+and+characterization+of+hammerhead-ribozyme+inhibitors+using+fluorescence-based+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology.</a> Nature. 19, 56-61 (2001).</li>
<li>Hartig, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-dependent+ribozymes+report+molecular+interactions+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time.</a> Nature. 20, 717-722 (2002).</li>
<li>Famulok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+aptamers+and+aptazymes+as+probes+for+screening+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+molecular+therapeutics%22%5BJournal%5D)">Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches.</a> Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).</li>
<li>Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+an+apolipoprotein+B+messenger+RNA+editing+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein.</a> Science. 260, 1816-1819 (1993).</li>
<li>Jurica, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+a+wrench+to+throw+into+the+splicing+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Searching for a wrench to throw into the splicing machine.</a> Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).</li>
<li>Spahn, C., Prescott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Throwing+a+spanner+in+the+works%3A+antibiotics+and+the+translation+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus.</a> Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Trypanosom RNA düzenleme kompleksine karşı inhibitörlerini teşhis etmek için yeni bir yüksek veri akışı tarama yöntemi tripanosomatidlerde neden olduğu hastalıkların karşı ilaç keşfi için yeni bir araç temin sunuldu. FRET tabanlı tahlil ribozim yaygın olarak farklı amaçlar 20-22 için kullanılmıştır; ancak, RNA düzenleme aktivitesi 19 in vitro izlenmesi için FRET bazlı ribozim tahlilin kapasitesini kullanılmıştır var. Bu deney, potansiyel olarak, memelilerde 23 çekirdeği ile kodl...

RNA düzenleme, bir post-transkripsiyonel mRNA modifikasyon bir işlem olup, ilk tripanosomatidlerde 1 keşfedilmiştir. O zamandan beri, önemli iş Tiypanosoma brucei 2,3 RNA düzenleme arkasındaki mekanizmayı inceleyerek yapılmıştır. Enzimatik reaksiyonlar bir dizi olarak, editosome, yaklaşık 20 protein bir çekirdek kompleksi, enerji üretim oksidatif fosforilasyon sisteminin çoklu bileşenleri için olgun mRNA mitokondriyal oluşturur. Katalitik olayların sırası kılavuzu RNA&#39;lar (gRNAs) tarafından dikte gibi, endonükleolitik bölünme, üridilat (U) ekleme veya silme, ve ligasyon 4. Çekirdek editosome kompleks proteinlerine ilave olarak, yardımcı bir dizi faktör de 5-7 tespit edilmiştir. Bu proteinler daha çok bağımsız kompleksleri gruplandırılmıştır görülür. Ancak, çekirdek editosome kompleks protein montaj sırası ve aksesuar ile çekirdek kompleks etkileşim kalıplarıkompleksleri belirlenecek henüz. Tripanosomatidlerde RNA düzenleme işlemini hedefleme kimyasal Disektörler sağlayabilir ki editosome kompleksinin oluşumu ve işlevi okuyan yardım. Ayrıca, birkaç editosome proteinler üzerinde fonksiyonel çalışmalar ilaç 8-12 hedef olarak potansiyellerini gösteren, farklı yaşam evrelerinde genelinde zorunluluk göstermiştir. Bu nedenle, editosome en bulunan inhibitörleri aynı zamanda tripanosomatidlerde karşı kurşun bileşikleri olarak hareket edebilir. Tripanosomatid neden olduğu hastalıklara karşı mevcut ilaçlar, toksik verimsiz ve 13,14 pahalı gibi bu, zamanında. Bir etkili ve uygun in vitro deney RNA düzenlemeyi engelleyen özel inhibitörler için kimyasal evreni keşfetmek için gereklidir. Üç deneyleri geliştirilmiş ve editosome aktivitelerini izlemek için kullanılmıştır: vitro RNA düzenleme tahlilinde 15 (a) tam yuvarlak, (b) in vitro RNA düzenleme tahlilinde 16,17, ön ayrıldı and (c) çekiç ribozimi (HHR) deneyi 18-tabanlı. İlk iki deney radyoaktivite yardımıyla düzenlenmiş ürün (ATPase 6 mRNA) doğrudan görselleştirme dayanır. HHR-bazlı analiz düzenleme üzerine bir Ribozim davranmasına modellenmiştir ATPaz 6 mRNA değiştirilmiş bir sürümünü kullanır. Fonksiyonel Ribozim sonra özellikle bir muhabir olarak hizmet veren, radyo etiketli RNA substrat Cleaves. Son zamanlarda, Moshiri&#39;nin et al. Geliştirilmiş bir &#39;karışımı ve ölçmek&#39; radyo işaretli RNA alt-tabaka, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) alt-tabaka 19 ile değiştirildiği burada RNA düzenleme izlemek için in vitro tahlilinde raportör HHR-göre. Bu testin prensibi avantajlar şunlardır: (a) aktif ribozim ve alt-tabaka bölünme üretim düşük hacimli (örneğin 20 ul) aynı tüp içerisinde aynı anda meydana gibi, hızlı ve uygun bir karışım ve tahlilin ölçmek tür, (b ) bu radyoaktif etiketli malzemelerin kullanımı önler, (c) bir hassasiyeti olduğufloresan bir mikro-titre plaka biçiminde enstrümantasyon, ve (d)-gürültü oranı yüksek bir sinyal ile fforded. Bu tayin kullanılarak, saflaştırılmış editosome karşı bilinen RNA ligaz düzenleme inhibitörlerinin etkisi 19, teyit edilmiştir. Bu deney esas olarak T&#39;den bütün editosomes karşı, RNA düzenleme önleyicilerinin hızlı tespit edilmesi için tahlil doğrulanmış brucei. Şekil 1 ayrıntılı bir adım adım şemadır flüoresan bazlı vitro RNA düzenleme deneyde gösterilebilir. Bu protokol, ya in vitro RNA ya da düzenleme izleme kolayca çeşitli ölçekler bileşik kütüphanelerinin taranması için adapte edilmesi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>SDM-79 Orta</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12483-020</td><td>55 & # 176'da ısı inaktivasyonu; 1 saat için C</td></tr><tr><td>Hemin, minimum% 80</td> <td>Sigma</td><td>H5533-10G</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Sollution</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Dnase 1 rekombinant, Rnase Free&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMax Express Büyük&nbsp; ölçekli RNA&nbsp; üretim sistemi</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Kimble Kontes Dounce Doku Öğütücüler&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>K885300-0040&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gradyan Ustası, ver 5.25&nbsp;</td><td>Biocomp</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Tüp, 13.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-100XP&nbsp; Ultrasantrifüj&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392052</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti ROTOR</td><td>Beckman Coulter</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>MicroSeal 'B' Contası, Contalar</td><td>Biorad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>CFX 384 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Biorad</td><td>185-5484</td><td></td></tr><tr><td>Akrilik/Bis çözeltisi (19:1), %40 (a/h)</td><td>Bio Basic</td><td>A0006-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Üre, Moleküler biyoloji sınıfı, 1 kg</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9902</td><td></td></tr></tbody></table>

tripanozomlann rna düzenleme karşı ilaçlar tarama için bir muhabiri olarak rna catalyst

RNA Catalyst as a Reporter for Screening Drugs against RNA Editing in Trypanosomes

Önemli bir ilerleme trypanosom mitokondriyal RNA düzenleme mekanizmasını belirleyen yapılmıştır. Benzer bir şekilde, önemli bir ilerleme RNA düzenlemeyi katalize editosome kompleksin bileşenleri tespit yapılmıştır. Ancak, bu proteinlerin nasıl birlikte çalıştığını hala net değildir. Editosome karşı yüksek verimli bir ekrandan edilen kimyasal bileşikler, düzenleme çevrimi içinde bir veya daha fazla aşamasını bloke eden ya da etkileyebilir. Bu nedenle, yeni kimyasal bileşiklerin tanımlanması editosome fonksiyonu ve kesme düzeneği için değerli moleküler problar üretecektir. Önceki çalışmalarda, in vitro deneyler, düzenleme, radyo-etiketli RNA kullanılarak gerçekleştirildi. Bu deneyler zaman verimsiz ve yüksek verimli amaçlar için uygun, alıcıdır. Burada, homojen floresans-esaslı &quot;karıştır ve ölçmek&quot; RNA düzenleme izlemek için bir çekiç ribozim in vitro haberci deneyi sunulmuştur. Sadece bir RNA düzenleme bir sonucu olarakçekiç ribozim, bir flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) oligonükleotid alt-tabaka bölünme geçirmektedir. Bu da, böylece bir sinyal üreten söndürücüden fluorofor ayrılması ile sonuçlanır. Editosome fonksiyonu bloke edildiğinde aksine, floresans sinyali söndürülür olacaktır. Bu in vitro RNA ya da düzenleme editosome fonksiyonunu inhibe kimyasallar yüksek yayılımlı tarama esnasında izlenmesi için genel olarak uygulanabilir olması gerekir, son derece hassas ve basit bir testtir.

Büyük çaplı bir ekranı set edilmesi için gereken gerekli adımları göstermek için, 2-5 tahlilin kalitesine ilişkin temsili kontrol deneyleri Şekil. Bu tarama birkaç gün boyunca tutarlı bir deney için ya da farklı ekranlar karşılaştırılması için gerekli kontrol deneyleri bulunmaktadır. Floresan Sinyal-gürültü Oranı değerlendirilmesi Büyük çaplı bir kurulumunda fosforla etiketlenmiş oligonükleotid substratın istikra...

Tripanosomatid patojenlerde benzersiz RNA düzenleme sürecini hedefleyen kimyasalların yüksek verimli taramasına uygulanabilen, oldukça hassas ribozim bazlı bir test bu yazıda açıklanmaktadır. İnhibitörler, RNA düzenleme sürecinin hipoteze dayalı analizi için araçlar olarak ve nihayetinde terapötik olarak kullanılabilir.

Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst

Substantial progress has been made in determining the mechanism of mitochondrial RNA editing in trypanosomes. Similarly, considerable progress has been ...

Bu prosedürün genel amacı, om inhibitörlerinin hızlı bir şekilde tanımlanması için Trias Broce'den ekstrakte edilen fonksiyonel om'lar kullanılarak RNA düzenlemesini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle tbr'den mitokondrilerin ve hedef düzenleme bölgelerinin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise sentetik RNA düzenleme raporlayıcı substratının hazırlanmasıdır.Ardından bileşikler, RNA düzenleme raporlayıcısı ile birlikte saflaştırılmış edito bölgelerine bağlanmaya tabi tutulur. Edito bölgelerinin işlevini bloke eden bileşiklerin varlığında, RNA raporlayıcısı düzenlemeye uğramayacak ve inaktif kalacaktır. Son adım, F iplik substratını eklemek ve RNA düzenleme raporlayıcısının bu substratı seçici ve spesifik olarak kesme yeteneğini izlemektir.İnhibitör bir bileşik durumunda, RNA düzenlemesi engellenir ve azalmış bir floresan sinyali tespit edilir veya hiç sinyal tespit edilmez. Nihayetinde, fret substratından zamanın bir fonksiyonu olarak yayılan floresanızı izlemek için gerçek zamanlı bir PCR cihazı kullanılır. Bu tekniğin geleneksel in vitro düzenleme analizlerine göre temel avantajı, RNA düzenlemesine karşı kimyasal bileşiklerin yüksek kapasiteli taraması için kullanıl

rna-catalyst-as-reporter-for-screening-drugs-against-rna-editing

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protein agregatlarının prion benzeri yayılımı, son zamanlarda birçok nörodejeneratif hastalıkta rol oynadığı ortaya çıkmıştır. Bu protokolün amacı, nematod C. elegans'ın protein yayılımını izlemek ve prion benzeri olayları araştırmak için bir model sistem olarak nasıl kullanılacağını açıklamaktır.

Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi<em&gt; ° C. elegans</em

Burada, hücre bazlı bir raportör gen tahlilini, 3' UTR aracılığıyla uygulanan transkripsiyon sonrası kontrol mekanizmalarını modüle eden bileşikler için kimyasal kitaplıkları taramak için değerli bir araç olarak tanımlıyoruz.

Post-transkripsiyonel ayarlı genlerin kimyasal Modülatörler için yüksek verimli tarama

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Ribonucleotides genom ökaryotik nükleer DNA ikileşmesi sırasında dahil en bol kanonik olmayan nükleotit arasındadır. Düzgün kaldırdıysanız, ribonucleotides DNA hasarı ve mutagenesis neden olabilir. Burada, ribonucleotide birleşme DNA ve mutajenik etkileri içine bolluk değerlendirmek için kullanılan iki deneysel yaklaşımlar mevcut.

Eğitim Ribonucleotide ortaklık: Strand-özel hafiye-in Ribonucleotides Maya genom ve Ribonucleotide kaynaklı Mutagenesis ölçme

Burada, sentetik veya in vitro transkripsiyonu RNA üzerinde metiltransferaz aktivitesinin doğrudan analizi için antikor içermeyen bir in vitro tahlil açıklanmıştır.

RNA metiltransferaz aktivite analizi için Antibody Içermeyen tahlil

NMR tabanlı aktivite, iki nükle ribohidolaz enzimin inhibitörlerinin tanımlanması ve karakterize edilmesi için geliştirilmiştir. 500 μM ve 250 μM ' de ilk bileşik olarak yapılan protokoller, ıC50 değerlerinin belirlenmesi, deterjan sayacı ekranı, atlama-seyreltme sayacı ekranı ve E. coli tüm hücrelerde saptanması için doz-yanıtı sağlar.

NMR tabanlı aktivite bileşik Inhibisyonu belirlenmesi için Assays, ıC50 değerleri, Artifactual aktivite, ve Nükrenoside Ribohidolases tüm hücre aktivitesi

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Bu protokolün amacı, C. elegans genomunun monte edilmiş ribonikleoprotein kompleksleri ve tarama için dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi kullanılarak sorunsuz CRISPR/Cas9 düzenlemesini sağlamaktır. Bu protokol, C. elegans'ta eklemeler, silmeler, gen değiştirmeleri ve kodon ikameleri de dahil olmak üzere çeşitli genetik değişiklikler yapmak için kullanılabilir.

CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

RNA düzenleme olaylarının genomik ölçekte hızlı tespiti ve güvenilir bir şekilde ölçülmesi zorlu olmaya devam etmektedir ve şu anda doğrudan RNA dizileme yöntemlerine dayanmaktadır. Burada açıklanan protokol, RNA düzenlemesini tespit etmek için basit, hızlı ve taşınabilir bir yöntem olarak mikrosıcaklık gradyan jel elektroforezi (μTGGE) kullanır.

RNA Düzenlemenin Hızlı Tespiti için Dizilemesiz Bir Yaklaşım

Keşfedin, Trypanosoma brucei'den izole edilen mitokondri ve editozom kullanarak RNA düzenleme inhibitörlerinin yüksek verimli taraması için floresan tabanlı bir yöntemi. Bu hassas assay, editozom fonksiyonunu hızlıca analiz eder.

Tripanozomlann RNA Düzenleme karşı ilaçlar Tarama için bir Muhabiri olarak RNA Catalyst

Daha fazla video keşfet