Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Bu prosedürün genel amacı, zarflı virüslerin yüzeylerinde bulunan glikoprotein komplekslerinin yapılarını incelemektir. Bu işlem, öncelikle virüs partiküllerinin, elektron kriyomikroskopi verilerinden daha önce hesaplanmış olan tomografik hacimler içerisinde konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, manuel olarak tanımlanmış bir veri alt kümesi kullanılarak glikoprotein komplekslerinin istatistiksel olarak birbirinden bağımsız iki başlangıç modelinin oluşturulmasıdır.

Ardından, bu modeller rafine edilir ve daha sonra virüs partikülleri üzerindeki tüm glikoprotein komplekslerini otomatik olarak tespit etmek için kullanılır. Son adım, tüm veri setini kullanarak glikoprotein kompleksinin yapısını rafine etmektir. Nihayetinde, final yapısını yorumlamak için moleküler görselleştirme araçları kullanılır.

Bu glikoprotein spike yapılarının üç boyutlu yapısal analizi, viral patogenezin anlaşılmasının yanı sıra ilaç tasarımı için de paha biçilemezdir. Bu tekniğin x-ışını kristaloğrafisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, membran proteinlerinin doğal membran ortamındaki yapılarının çözülmesine olanak tanımasıdır. Bu teknik, yapısal biyolojideki temel konuların ele alınmasına yardımcı olabilir.

Örneğin, membran içeren birçok virüsün yapısı. Bu teknik, söz konusu virüslerdeki glikoprotein kompleksleri hakkında bilgi sağlayabilse de, lipozomlara dahil edilmiş membran proteinleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedür, grubumun üyeleri olan Slee ve David Bittel tarafından gösterilecektir.

Başlamak için B show programında bir otogram dosyası açın. Parçacık seçme aracını kullanarak, bir virüs parçacığının merkez koordinatını belirleyerek otogramlardaki virüs parçacıklarını manuel olarak seçin. Tüm varyantlar işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.

Virüs koordinatlarını bir star dosyasına kaydedin. Bu işlemi tüm tomogramlar için tekrarlayın. Ardından, alt hacimlerdeki varyonları ayrı hacim dosyalarına çıkarmak için J sub tomo py'yi ayıklama modunda çalıştırın; iki bağımsız başlangıç modeli oluşturmak için kaydedilen star dosyalarını girdi dosyaları olarak kullanın.

İlk olarak, overyan alt hacim haritası dosyasını açın. B'de gösterilmiştir. Araç kutusu penceresi üzerinden erişilebilen partikül seçme aracını kullanarak bir spike'ın merkez koordinatını tanımlayıp, Varian alt hacimlerindeki spike'ların bir alt kümesini seçin.

Tüm belirgin spike proteinleri işlenene kadar bu adımı tekrarlayın. Spike koordinatlarını bir star dosyasına kaydedin. Yaklaşık 200 glikoprotein spike işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi görünümler varyantlara atandıktan sonra, J sub tomo create mask py kullanarak gerçek uzay maskesi oluşturun. Ardından J sub tomo create wedge mask py kullanarak bir resiprok uzay maskesi oluşturun.

Ters uzay maskesi, tek eksenli tomografik veri toplama işleminden kaynaklanan eksik kama bölgesindeki alanları hariç tutmak için kullanılır. Ardından, giriş dosyası olarak kaydedilmiş bir seçim dosyası kullanarak J.Sub tomo create averages. PY ile iki başlangıç ortalaması oluşturun.

Başlangıç ortalamalarındaki gürültüyü azaltmak için ization kullanın; önceden oluşturulmuş iki modeli J sub tomo iterate gold PY ile iteratif olarak hizalayın ve ortalayın. Bu sürecin her iki aşamasına ilişkin ayrıntılar metin protokolünde bulunabilir. Kyira'da ortaya çıkan alçak geçiren filtreli harita dosyasını inceleyerek yapıdaki simetri derecesini değerlendirin. Örneğin, spike trimerik bir kompleks ise, üçlü simetri belirgin olmalıdır.

Yapılandırmayı, metin protokolünde detaylandırıldığı şekilde geliştirmeye devam edin. Ardından, şablon eşleştirme için Varian yüzeyinde eşit olarak konumlandırılmış tohumlar oluşturun ve JVs py'yi çalıştırarak tohumlara bir başlangıç görünüm vektörü atayın. Girdi dosyaları olarak önceden oluşturulan yıldız dosyalarını kullanın ve beklenen spike sayısından yaklaşık 1,5 kat daha fazla tohum üretin.

Bu görünüm vektörü, her bir tohum noktasına en yakın olan spike yönünü yaklaşık olarak belirler. Ardından, daha önce yapıldığı gibi virüs yüzeyinin iki bağımsız ortalamasını oluşturun. Daha sonra, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde tohumların konumunu optimize edin.

Son olarak, jvs.py kullanarak rafine edilmiş seed star dosyalarının com marker dosyalarını oluşturun. CMM dosyalarını ve ilgili virion harita dosyalarını açarak seed'leri inceleyin. kyira içinde.

Rafine edilmiş tohumların virüs membranına göre doğru şekilde hizalandığından emin olun. Rafine edilmiş işaretleyiciler, çapraz korelasyon katsayılarına göre renklendirilebilir; rafine edilmiş tohumlar etrafında yerel şablon eşleştirme kullanarak Varian alt hacimlerindeki tüm spike proteinlerini otomatik olarak belirleyin, tespit edilen spike proteinlerini hizalayın ve ortalamalarını alın; başlangıç şablonları olarak manuel olarak seçilen spike proteinlerinin bir alt kümesinden oluşturulan ortalamaları kullanın. Bu işlemle ilgili ek ayrıntılar metin protokolünde bulunabilir; sonuçları görselleştirmek için, spike proteininin rafine edilmiş yapısını görselleştirme amacıyla kyira'da açın.

Atomik yapıların yerleşimiyle devam edin. Ardından j Subo Create model DO py kullanarak virionun kompozit bir modelini oluşturun. Son olarak, görselleştirme için kompozit modeli kyira'da açın.

İlk model, manuel olarak seçilmiş 205 spike kullanılarak geliştirilmiştir. En merkezdeki spike'ın üçlü simetrisi, herhangi bir simetri uygulanmadan belirginleşmiş ve Varian yüzeylerindeki tüm spike'ların manuel olarak tespit edilmesi için sonraki geliştirme turlarına uygulanmıştır. Her vion için 43 nanometre yarıçapta ve 20 derecelik aralıklarla 106 seed oluşturulmuş ve konumları membrana göre iteratif olarak geliştirilmiştir.

En iyi korelasyona sahip glikoprotein spike yamaları, nihai ortalamayı hesaplamak için kullanıldı. Ortalama, 35 angstrom çözünürlüğe indirgendi. Bu işlem, merkezde trimerik bir spike yapısının yanı sıra altı komşu spike'tan gelen bazı katkıları ortaya çıkardı.

Yapının bilinen konumlara yerleştirilmesiyle hesaplanan varislerin kompozit modelleri, Varian yüzeyi üzerinde spike'ların yerleşimini ortaya çıkardı. Zaman zaman, yerel olarak düzenlenmiş spike yamaları belirginleşti. Bu prosedür uygulanırken, yalnızca en iyi verilerin kullanılması ve tüm ara sonuçların dikkatle kontrol edilmesi önemlidir.

Bu prosedürün ardından, protein-protein etkileşimlerinin daha doğru bir görünümünü elde etmek için x-ışını kristalografi yapıları nihai ortalamaya uydurulabilir. Bu videoyu izledikten sonra, J Omo kullanarak viral zar glikoprotein yapılarının nasıl ortalandığına dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.