Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Bu prosedürün genel amacı, zarflı virüslerin yüzeylerinde bulunan glikoprotein komplekslerinin yapılarını incelemektir. Bu, ilk olarak virüs parçacıklarının daha önce elektron kriyo mikroskobu verilerinden hesaplanan tomografik hacimlere yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, manuel olarak tanımlanmış bir veri alt kümesi kullanarak glikoprotein komplekslerinin istatistiksel olarak bağımsız iki başlangıç modelini oluşturmaktır.

Daha sonra, bu modeller rafine edilir ve daha sonra virüs parçacıkları üzerindeki tüm glikoprotein komplekslerini otomatik olarak tespit etmek için kullanılır. Son adım, tam veri setini kullanarak glikoprotein kompleksinin yapısını rafine etmektir. Sonuç olarak, nihai yapıyı yorumlamak için moleküler görselleştirme araçları kullanılır.

Bu glikoprotein sivri uçlarının üç boyutlu yapısal analizi, ilaç tasarımında olduğu kadar viral patogenezi anlamak için de paha biçilmezdir. Bu tekniğin x-ışını kristalografisi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu tekniğin doğal zar ortamındaki zar proteinlerinin yapılarının çözülmesine izin vermesidir. Bu teknik, yapısal biyolojideki temel konuların ele alınmasına yardımcı olabilir.

Örneğin, virüs içeren birçok zarın yapısı. Bu teknik, bu virüslerdeki glikoprotein kompleksleri hakkında bilgi sağlayabilse de, lipozomlara dahil edilen zar proteinleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedür, grubumun iki üyesi, Slee ve David Bittel tarafından gösterilecek.

Başlamak için B gösterisinde bir autogram dosyası açın. Parçacık toplama aracını kullanarak bir virüs parçacığının merkez koordinatını tanımlayarak virüs parçacıklarını gram cinsinden manuel olarak seçin. Tüm varyantlar işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.

Virüs koordinatlarını bir yıldız dosyasına kaydedin. Tüm tomolar için bu işlemi tekrarlamaya devam edin. Daha sonra J sub tomo py'yi ayıklama modunda çalıştırın Alt birimlerdeki değişkenleri ayrı birim dosyalarına ayıklamak için, iki bağımsız başlangıç modeli oluşturmak üzere kaydedilen yıldız dosyalarını giriş dosyaları olarak kullanın.

İlk olarak, yumurtalık alt birim harita dosyasını açın. B gösterisinde. Araç kutusu penceresinden erişilebilen parçacık toplama aracını kullanarak bir ani artışın merkez koordinatını tanımlayarak Varian alt birimlerindeki ani artışların bir alt kümesini seçin.

Açıkça belirgin olan tüm ani artışlar işlenene kadar bu adımı tekrarlayın. Ani artış koordinatlarını bir yıldız dosyasına kaydedin. Yaklaşık 200 glikoprotein sivri ucu işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi varyanlara görünümler atadıktan sonra, J sub tomo kullanarak gerçek bir boşluk maskesi oluşturun. Maske py oluşturun. Ardından J sub tomo kullanarak karşılıklı bir boşluk maskesi oluşturun, kama maskesi py oluşturun.

Karşılıklı boşluk maskesi, tek eksenli tomografik veri toplamadan kaynaklanan eksik kama bölgesindeki bölgeleri hariç tutmak için kullanılır. Ardından, J.Sub tomo create ortalamalarını kullanarak iki başlangıç ortalaması oluşturun. Giriş dosyası olarak kaydedilmiş bir seçim dosyasını kullanan PY.

İlk ortalamalarda gürültüyü azaltmak için kullanılan kullanım, daha önce oluşturulan iki modeli J sub tomo yinelemeli altın PY ile yinelemeli olarak hizalamak ve ortalamasını almaktır. Bu işlemin her iki aşaması için ayrıntılar metin protokolünde bulunabilir. Ortaya çıkan alçak geçiren filtrelenmiş harita dosyasını kyira'da inceleyerek yapıdaki simetri derecesini değerlendirin. Örneğin, sivri uç trimerik bir kompleks ise, üç katlı simetri belirgin olmalıdır.

Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yapının iyileştirilmesine devam edin. Ardından, şablon eşleştirme için Varian yüzeyinde eşit olarak bulunan tohumlar oluşturun ve JVs py komutunu çalıştırarak tohumlara bir ilk görünüm vektörü atayın. Giriş dosyaları beklenen ani artış sayısından yaklaşık 1,5 kat daha fazla tohum oluşturduğundan, önceden oluşturulmuş yıldız dosyalarını kullanın.

Bu görünüm vektörü, her bir tohum noktasına en yakın sivri ucun yönünü yaklaşık olarak gösterir. Ardından, daha önce olduğu gibi virüs yüzeyinin iki bağımsız ortalamasını oluşturun. Ardından, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi tohumların konumunu iyileştirin.

Son olarak, jvs.py kullanarak rafine edilmiş tohum yıldız dosyalarının com işaretleyici dosyalarını oluşturun. CMM dosyalarını ve ilgili virion harita dosyalarını açarak tohumları inceleyin. Kyira'da.

Rafine edilmiş tohumların virüs zarına göre doğru şekilde hizalandığından emin olun. İyileştirilmiş işaretçiler, çapraz korelasyonlarına göre renklendirilebilir: Katsayılar, yerel şablonu kullanarak Varian alt hacimlerindeki tüm ani artışları otomatik olarak bulur, rafine tohumlar etrafında eşleştirir, bulunan sivri uçları hizalar ve ortalamasını alır, ilk şablonlar olarak manuel olarak toplanan sivri uçların bir alt kümesinden oluşturulan ortalamaları kullanır. Bu işlem için ek ayrıntılar, sonuçları görselleştirmek için metin protokolünde bulunabilir, görselleştirme için kyira'daki sivri ucun rafine yapısını açın.

Atomik yapıları sığdırmaya devam edin. Daha sonra j Subo Create model DO py kullanarak virion'un bileşik bir modelini oluşturun. Son olarak, kyira'da görselleştirme için bileşik modeli açın.

İlk model, elle toplanan 205 sivri uç kullanılarak rafine edildi. Üç katlı. En ortadaki sivri ucun simetrisi, herhangi bir simetri uygulanmadan belirgindi ve Varian yüzeylerindeki tüm sivri uçları manuel olarak tespit etmek için sonraki iyileştirme turlarına uygulandı. Her vion için 43 nanometre yarıçapında ve 20 derecelik aralıkta 106 tohum üretildi ve konumları zara göre yinelemeli olarak rafine edildi.

Nihai ortalamayı hesaplamak için en iyi ilişkili glikoprotein spike yamaları kullanıldı. Ortalama 35 angstrom çözünürlüğe çözüldü. Altı komşu sivri ucun bir miktar katkısına ek olarak ortada trimerik bir sivri uç yapısı ortaya çıkardı.

Yapının bilinen pozisyonlara yerleştirilmesiyle hesaplanan varisin kompozit modelleri, Varian yüzeyindeki sivri uçların yerleşimini ortaya çıkardı. Bazen, yerel olarak sipariş edilen sivri uçlar belirgindi. Bu yordamı denerken, yalnızca en iyi verileri kullanmak ve tüm ara sonuçları dikkatlice kontrol etmek önemlidir.

Bu prosedürü takiben, protein-protein etkileşimlerinin daha doğru bir görünümünü elde etmek için x-ışını kristalografi yapıları nihai ortalamaya yerleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, J Omo kullanarak viral zarf glikoprotein yapılarının ortalamasının nasıl alınacağını iyi anlamış olmalısınız.