Name: Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Keşfedin elektron kriyotomografi ve Jsubtomo kullanarak viral zarf glikoprotein komplekslerinin yapısal analizini. Bu yöntem, zarf virüslerindeki glikoprotein sivri uçlarını in situ çözümleyerek viral patogenez ve ilaç tasarımı için kritik bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Finlandiya Akademisi (130750 ve 218080'den J.T.H.'ye), Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z'den T.A.B.'ye) ve MRC (MR/J007897/1'den J.T.H ve T.A.B.'ye; MR/L009528/1'den T.A.B.'ye).

<ol><li>Nickell, S., Mihalache, O., Beck, F., Hegerl, R., Korinek, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+the+26S+proteasome+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of the 26S proteasome by cryoelectron tomography.</a> Biochemical and biophysical research communications. 353 (1), 115-120 (2007).</li>
<li>Goldie, K. N., Wedig, T., Mitra, A. K., Aebi, U., Herrmann, H., Hoenger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+3-D+structure+of+vimentin+intermediate+filaments+by+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the 3-D structure of vimentin intermediate filaments by cryo-electron tomography.</a> Journal of structural biology. 158 (3), 378-385 (2007).</li>
<li>Cheng, Y., Boll, W., Kirchhausen, T., Harrison, S. C., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+clathrin-coated+vesicles%3A+structural+implications+for+coat+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of clathrin-coated vesicles: structural implications for coat assembly.</a> Journal of molecular biology. 365 (3), (2007).</li>
<li>Grünewald, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+herpes+simplex+virus+from+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of herpes simplex virus from cryo-electron tomography.</a> Science. 302 (5649), 1396-1398 (2003).</li>
<li>Murphy, G. E., Leadbetter, J. R., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+structure+of+the+complete+Treponema+primitia+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ structure of the complete Treponema primitia flagellar motor.</a> Nature. 442 (7106), 1062-1064 (2006).</li>
<li>Medalia, O., Weber, I., Frangakis, A., Nicastro, D., Gerisch, G., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+architecture+in+eukaryotic+cells+visualized+by+cryoelectron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography.</a> Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of structural biology. 161 (3), 232-242 (2008).</li>
<li>Kremer, J., Mastronarde, D., McIntosh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of structural biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Castaño-Díez, D., Kudryashev, M., Arheit, M., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamo%3A+a+flexible%2C+user-friendly+development+tool+for+subtomogram+averaging+of+cryo-EM+data+in+high-performance+computing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Dynamo: a flexible, user-friendly development tool for subtomogram averaging of cryo-EM data in high-performance computing environments.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 139-151 (2012).</li>
<li>Hrabe, T., Chen, Y., Pfeffer, S., Cuellar, L. K., Mangold, A. -V., Förster, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PyTom%3A+a+python-based+toolbox+for+localization+of+macromolecules+in+cryo-electron+tomograms+and+subtomogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">PyTom: a python-based toolbox for localization of macromolecules in cryo-electron tomograms and subtomogram analysis.</a> Journal of structural biology. 178 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Computational methods for electron tomography.</a> 43 (10), Micron (Oxford, England). 1010-1030 (2012).</li>
<li>Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+in+situ--the+potential+of+subtomogram+averaging%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Structural biology in situ--the potential of subtomogram averaging).</a> Current opinion in structural biology. 23 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Frangakis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+macromolecular+complexes+in+cryoelectron+tomograms+of+phantom+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of macromolecular complexes in cryoelectron tomograms of phantom cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14153-14158 (2002).</li>
<li>Zanetti, G., Briggs, J. A. G., Grünewald, K., Sattentau, Q. J., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomographic+structure+of+an+immunodeficiency+virus+envelope+complex+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomographic structure of an immunodeficiency virus envelope complex in situ.</a> PLoS pathogens. 2 (8), (2006).</li>
<li>Liu, J., Bartesaghi, A., Borgnia, M. J., Sapiro, G., Subramaniam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+native+HIV-1+gp120+trimers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of native HIV-1 gp120 trimers.</a> Nature. 455 (7209), (2008).</li>
<li>Meyerson, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+molecular+structures+of+HIV+envelope+glycoproteins+using+cryo-electron+tomography+and+automated+sub-tomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Determination of molecular structures of HIV envelope glycoproteins using cryo-electron tomography and automated sub-tomogram averaging.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (58), (2011).</li>
<li>Baker, T. S., Olson, N. H., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+the+third+dimension+to+virus+life+cycles%3A+three-dimensional+reconstruction+of+icosahedral+viruses+from+cryo-electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Adding the third dimension to virus life cycles: three-dimensional reconstruction of icosahedral viruses from cryo-electron micrographs.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 63 (4), 862-922 (1999).</li>
<li>Huiskonen, J. T., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-containing+viruses+with+icosahedrally+symmetric+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Membrane-containing viruses with icosahedrally symmetric capsids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (2), 229-236 (2007).</li>
<li>Liljeroos, L., Huiskonen, J. T., Ora, A., Susi, P., Butcher, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+measles+virus+reveals+how+matrix+protein+coats+the+ribonucleocapsid+within+intact+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of measles virus reveals how matrix protein coats the ribonucleocapsid within intact virions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), (2011).</li>
<li>Arranz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+native+influenza+virion+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of native influenza virion ribonucleoproteins.</a> Science. 338 (6114), 1634-1637 (2012).</li>
<li>Karotki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eisosome+proteins+assemble+into+a+membrane+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eisosome proteins assemble into a membrane scaffold.</a> Journal of Cell Biology. 195 (5), 889-902 (2011).</li>
<li>Pietilä, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+architecture+unifies+globally+distributed+pleolipoviruses+infecting+halophilic+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Virion architecture unifies globally distributed pleolipoviruses infecting halophilic archaea.</a> Journal of virology. 86 (9), 5067-5079 (2012).</li>
<li>Huiskonen, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryotomography+of+Tula+hantavirus+suggests+a+unique+assembly+paradigm+for+enveloped+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Electron cryotomography of Tula hantavirus suggests a unique assembly paradigm for enveloped viruses.</a> Journal of virology. 84 (10), 4889-4897 (2010).</li>
<li>Bowden, T. A., Bitto, D., McLees, A., Yeromonahos, C., Elliott, R. M., Huiskonen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthobunyavirus+ultrastructure+and+the+curious+tripodal+glycoprotein+spike%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">Orthobunyavirus ultrastructure and the curious tripodal glycoprotein spike.</a> PLoS pathogens. 9 (5), (2013).</li>
<li>Maurer, U. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+Herpesvirus+Fusion+Glycoprotein+B-Bilayer+Complex+Reveals+the+Protein-Membrane+and+Lateral+Protein-Protein+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The Structure of Herpesvirus Fusion Glycoprotein B-Bilayer Complex Reveals the Protein-Membrane and Lateral Protein-Protein Interaction.</a> Structure. 21 (8), London, England. 1396-1405 (1993).</li>
<li>Gan, L., Ladinsky, M. S., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+in+a+marine+picoeukaryote+is+a+disordered+assemblage+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromatin in a marine picoeukaryote is a disordered assemblage of nucleosomes.</a> Chromosoma. 122 (5), 377-386 (2013).</li>
<li>Scheres, S. H. W., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+overfitting+in+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination.</a> Nature. 9 (9), 853-854 (2012).</li>
<li>Heymann, J. B., Belnap, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bsoft%3A+image+processing+and+molecular+modeling+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Bsoft: image processing and molecular modeling for electron microscopy.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Goddard, T. D., Huang, C. C., Ferrin, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+density+maps+with+UCSF+Chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing density maps with UCSF Chimera.</a> Journal of structural biology. 157 (1), 281-287 (2007).</li>
<li>Faini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structures+of+COPI-coated+vesicles+reveal+alternate+coatomer+conformations+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structures of COPI-coated vesicles reveal alternate coatomer conformations and interactions.</a> Science. 336 (6087), 1451-1454 (2012).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabs+enable+single+particle+cryoEM+studies+of+small+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Fabs enable single particle cryoEM studies of small proteins.</a> Structure. 20 (4), London, England. 582-592 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

<html> Viryon membran viral glikoprotein başak yapısının ortaya çıkarılmasıyla, virüs kopyalanmasını anlamak ve tedavi etmek ve enfeksiyonu önlemek için terapötik maddelerin geliştirilmesi için esastır. Tek bir parçacık ortalama ile bir araya Elektron mikroskobu kriyo-glikoprotein dahil olmak üzere sivri zarflı virüs partiküllerinin, yapılarını çözmek için en çok kullanılan yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, bu yöntem, simetrik virüsleri icosahedrally sınırlıdır. Burada, Jsubtomo elektron cryo-tomografi ve subtomogram ortalamanın uygulaması ile, biz pleomorfik diğer mevcut yapısal biyoloji yöntemleri uygun değildir virüsleri glikoprotein sivri zarflı belirlenmesi için genel bir protokol ana hatlarıyla. Bizim için temsili sonuçlar, bu yöntemin çözünürlüğü etki mimari, oligomerizasyonu ve sağlam viryonları üzerindeki glikoprotein sivri yüksek dereceli kuruluşa bakış açısı ortaya çıkarmak için yeterli olduğunu göstermektedir. jove_content &quot;&gt; Bu protokol çerçevesinde en kritik adım, bu aşamada başka. Başarılı yürütme glikoprotein kramponları, böylece yeterince büyük ve çok sıkı birbirlerine karşı değil dolu olduğunu varsayar birinden istatistiksel olarak bağımsız iki güvenilir bir başlangıç ​​modelleri oluşturmak bireysel sivri yapabilirsiniz görsel tanınan ve el tomogramları toplanmış ve iki bağımsız modelleri ortalaması alınmalıdır., bu mümkün değilse, protokol iki değişiklik teşebbüs edilebilir. Birincisi, iki bağımsız random modeller sonra ilk subtomograms rastgele iki alt kümelerini tanımlama ve inşa edilebilir Bu alt-gruplar içinde 30 subtomograms ortalama. İkinci olarak, izole edilmiş bir sivri yapı, X-ışını kristalografisi ile, örneğin başka yollarla elde edilmiş olsa bile, bu başlangıç ​​modeli olarak kullanılabilir. Ancak, bakım, düşük alınmalıdır arıtmanın bir sonraki turda olacak iki sonuçlanan modelleri gibi, düşük çözünürlüklü cut-off (50-70 Å) kullanarak filtreyi Bu modeli geçmekSadece bu çözünürlükte ötesinde istatistiksel bağımsız olması. Bu ihtar nedeniyle, eski yaklaşım tavsiye edilir. Bu protokol elde çözünürlük, dört ana faktöre bağlıdır: i. veri toplama stratejisi ve girdi verilerinin kalitesi, ii. subtomograms sayısı, III. hizalama subtomograms doğruluğu ve iv. yapıların heterojen. Birinci ve ikinci sınırlama, büyük ölçüde yüksek sinyal-gürültü doğrudan elektron CTF ile kombine dedektörleri tomografi giderilmiştir ve otomatik veri toplanmasını kullanılarak aşılabilir birlikte, hizalama hassasiyeti daha da ilgi kendisinin yapısının boyutu ve şekli etkilenir. Belirgin özellikleri göstermeyen küçük sivri bu protokolü uygulanır, bu hizalama doğruluk ve böylece çözünürlüğü arttırmak için 31 sivri Fab fragmanlarını bağlamak için avantajlı olabilir. Son olarak, bu yapılar için ortalama halinde sergi çoklu biçimlerde, alt-tomam sınıflandırma yöntemi ayrıca farklı konformasyonlara ortalama için kullanılabilir. Bu amaçla, Jsubtomo güçlü subtomogram sınıflandırma 9 sunan, Dinamo paketi ile bütünleştirir. Yukarıdaki protokol izole edilmiş viral glikoproteinler de, X-ışını kristalografisi tamamlayıcıdır. Kristalografik yapılar viryon zanna göre glikoproteinin Tam bir yönlendirme elde etmek için alt-tomogram ortalamalar içine monte edilebilir. Bu metodolojinin uygulama şüphesiz zarflı virüs yapısında ve patobiyolojisi üzerine ışık tutmaya devam edecektir.

Elektron cryo-tomografi karmaşık biyolojik örneklerin bir üç boyutlu (3D) yeniden hesaplanmasını sağlayan bir elektron cryo-mikroskopi görüntüleme tekniğidir. Müsait örnekler bütün prokaryotik hücreler 5 ve bütün ökaryotik hücreler 6 bile ince alanlara saflaştırılmış makro-moleküler kompleksler 1, filaman 2, kaplamalı veziküller 3 ve pleomorfik membran virüs 4 arasında değişir. Bir tilt-dizi, 3D tomografik hacimleri, ya tomogramları veri toplama ardından, Bsoft 7 ve imod 8 olmak üzere birkaç kurulan yazılım paketleri kullanılarak hesaplanabilir. Elektron cryo-tomografi sınırı gelen tomografik hacimlerinin biyolojik yorumlanması biyolojik örneklerin çalışmaya doğasında iki yönü. Bağlı olarak büyük radyasyon hasarı verilmesinden önce, biyolojik malzemelerden uygulanabilir sınırlı elektron doz signa, İlktomografi veri L-gürültü oranları tipik olarak çok düşüktür. İkinci olarak, veri toplama sırasında kısıtlı örnek eğim geometrisinin bir sonucu olarak, nesnenin bazı incelemeler tomografik hacimde bir sözde &#39;eksik kama&#39; artefakt yol mevcut kalır. Tomografik birim halinde başarılı olarak 9-12 ortalama böyle makromoleküler kompleksler olarak özdeş yapılar, tekrar içerir, ancak, bu dezavantajların her ikisi de aşılabilir. Tomogram rekonstrüksiyonlarda gelen yapıları ortalama önce, ilgi nesneler bulundu ve aynı yönde hizalanmış olmalıdır. Bu tür yapıları yerlerinin çoğu zaman, şablon olarak 13 eşleşen anılan bir yaklaşım kullanarak tomografik hacminde bir şablon yapının çapraz korelasyon elde edilebilir. Bu eşleştirme işleminde kullanılan şablon elektron cryo-mikroskobu veya 3D rekonstrüksiyon ile birlikte elektron cryo-tomografi elde edilebilir, ya da gelen simüle bir yoğunluk haritası olabilirBir atom yapısı. Birkaç bilgisayar paketler 11, bu görevleri yerine getirmek üzere geliştirilmiştir. HIV-1 gibi membran virüsler, glikoprotein sivri ortalama, onların yapısını 14-16 çalışmak için özellikle başarılı bir yaklaşım olmuştur. Yapının, virüs konakçı etkileşimleri hem de moleküler temeli ortaya çıkartılması ve anti-viral ve aşı tasarımının gelişimi yönlendirmek için ayrılmaz bir parçasıdır. Makromoleküler glikoproteinler kristalografi ayrı ayrı virütik ve komplekslerin yapı analizine (4, bir zaman daha iyi) yüksek çözünürlüklü için tercih edilen bir tekniktir, ancak bu yöntemle elde edilen X-ışını yapısı, viryonun üzerindeki doğal ortamdan izole membran proteinleri vardır . Bu durumda, bu virion bağlamında viral glikoproteinlerin daha yüksek dereceli mimari, önemli bilgileri, eksik kalır. Öte yandan, elektron mikroskobu ve kriyo-tek parçacık yenidenbütün kılıflı virüsler ikosahedral simetri 17,18 ile virionlann sınırlandırılmıştır. Alt ses uyumu ile birlikte elektron cryotomography böylece yerinde düzensiz şekilli, pleomorfik virüslerin glikoprotein sivri çalışma izin tamamlayıcı bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Biz Jsubtomo tomografik alt birimlerin tespiti, hizalama ve ortalama için (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) adında bir yazılım geliştirdik. Jsubtomo hücresel ve viral yapının 19-26 bir dizi yapı belirlemelerinde kullanılmıştır. Burada, biz belirlenmesi viral yüzey başak yapıları sağlayan ayrıntılı bir protokol, anahat. Gürültü ilişkilendirerek aşırı arıtma ortalama yapıların aşmak için, &#39;altın standart&#39; arıtma şeması 10,27 benimsenmiştir. Son olarak, görselleştirme ve tipik sonuçların yorumlanması için stratejiler tartışılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Jsubtomo (ver 1.3.1)</td><td>Oxford Üniversitesi</td><td>n/a</td><td>www.opic.ac.uk/jsubtomo</td></tr><tr><td>Bsoft (ver 1.8.7)</td><td>NIAMS, NIH</td><td>n/a</td><td>bsoft.ws</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF</td><td>n/a</td><td>www.cgl.ucsf.edu/chimera</td></tr></tbody></table>

jsubtomo kullanılarak elektron cryotomography rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini spikes ortalamasını

Averaging of Viral Envelope Glycoprotein Spikes from Electron Cryotomography Reconstructions using Jsubtomo

Zarflı virüsler konakçı hücrelere giriş aracılık etmek ile ilgili yüzeyi üzerindeki zar glikoproteinleri kullanmaktadır. Bu glikoprotein &#39;sivri&#39; Üç-boyutlu yapısal analizler çoğunlukla viral patogenezi anlamak için ve ilaç tasarımında teknik açıdan zor ama önemlidir. Burada, bir protokol elektron cryo-tomografi verileri hesaplama ortalamaya yoluyla viral başak yapı tayini için sunulmuştur. Elektron cryo tomografi bir doğala yakın, dondurulmuş sulu halde membran virüsler gibi biyolojik örneklerin pleomorfik, üç boyutlu hacimli tomografik rekonstrüksiyon veya tomografi, elde etmek için kullanılan elektron mikroskobu bir tekniktir. Bu tomografi düşük çözünürlükte olsa, üç boyutta ilgi yapılar ortaya çıkarmak. Alt birimlerine veya alt tomografi Hesaplamalı ortalama, viral glikoprotein sivri gibi yapısal motiflerini, tekrar eden yüksek çözünürlüklü detay elde etmek için gereklidir. Ali için ayrıntılı bir hesaplama yaklaşımıgning ve Jsubtomo yazılım paketi kullanarak, alt-tomogram ortalama özetlenmiştir. Bu yaklaşım, virion zar üzerinde yüksek seviyeli başak sivri uç etkileşimlerin bir çalışma 20-40 Â çözünürlük aralığında ve çalışma viral glikoprotein sivri yapısının görselleştirme sağlar. Tipik sonuçlar Bunyamwera virüsü, Bunyaviridae ailesinden zarflı virüs için sunulmuştur. Bu aile, insan ve hayvan sağlığı için bir tehdit patojenlerin yapısal olarak farklı bir gruptur.

Biz 24 set daha önce yayınlanmış verileri kullanılarak Bunyamwera virüsü (Orthobunyavirus, Bunyaviridae) zarf glikoprotein kompleksi için yukarıda belirtilen alt tomogram ortalama iş akışı uygulama göstermektedir. Veri toplama ve arıtım parametreleri izleyen Tablo 1 &#39;de listelenmiştir. Bir temsilci tomogram, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Parametre (birim) </td><td> Değer </td></tr><tr><td> Veri toplama </td><td></td></tr><tr><td> Gerilimi (kV) </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Kalibre büyütme (X) </td><td> 111.000 </td></tr><tr><td> Piksel boyutu (Å) </td><td> 5.4 </td></tr><tr><td> Tahmini doz (e - / Å 2) </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Underfocus (um) </td><td> 4.0-4.5 </tD&gt; </tr><tr><td> İlk CTF sıfır (Å) bir </td><td> 26-30 </td></tr><tr><td> Eğim aralığı (°) </td><td> -60-60 </td></tr><tr><td> Tilt örnekleme (°) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Veri ve arıtma </td><td></td></tr><tr><td> Tomografi </td><td> 11 </td></tr><tr><td> Virionları </td><td> 29 </td></tr><tr><td> Viryonunun başına Tohumlar </td><td> 106 </td></tr><tr><td> Tohum sayısı </td><td> 3.074 </td></tr><tr><td> Spike tespit </td><td> 1.346 </td></tr><tr><td> Örtüşmeler çıkarıldıktan sonra ani </td><td> 1.401 </td></tr><tr><td> Çapraz-korelasyon sivri tabanlı değil seçimi </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Spike son ortalamaya dahil </td><td> 1.022 </td></tr><tr><td> Simetri </td><td> C3 </td></tr><tr><td> Açısal örnekleme (°) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Çözünürlükarıtmada kullanılan aralığı (Å) </td><td> 42-334 </td></tr><tr><td> Nihai çözünürlük tahmini (a) b </td><td> 35 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Bunyamwera veri toplama ve arıtma istatistikleri. Bir CTF, kontrast transfer fonksiyonu. b 0.143 bir eşik iki bağımsız rafine yapılar arasındaki Fourier kabuk korelasyon kullanılarak hesaplanmıştır. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2:. Bunyamwera virionlann bir tomografisinde yoluyla Dilim her viryonunun çevresi belirgin Çeşitli başak yan görüntüleridir ok uçları ile gösterilir. Tomogram 60 Â Filtresinde düşük geçiş olmuştur. Ölçek çubuğu 100 nm. Öncelikle, biz 205 elle aldı sivri kullanarak bir başlangıç ​​modeli (rafine <strong&gt; Şekil 3). Merkez-en başak üç kat simetri herhangi bir simetri (Şekil 3B) uygulamadan açıktı ve arıtma sonraki turlarda (Şekil 3C) empoze edildi. Viryon yüzeyler üzerinde otomatik olarak sivri tespit için, 43 nm ile 20 ° (Şekil 4A) arasında aralığın yarıçapta her bir virion 106 tohumları üretilir ve yinelemeli membran (Şekil 4B) göre konumlarını rafine. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3: ilk şablon yapısı iyileştirildi. (A) Silindir şeklinde sivri elle tanımlanmış pozisyonlarda inşa (C100) şablonu ortalama. (B) Ortalama yoğunluğu arıtma beş tur sonra herhangi bir simetri olmadan (C1), üç kat ile görüntüler bir başak empozesimetrik özellikleri. Modelin çözünürlüğü 48 Å. Başak (C) Ortalama üç kat simetri ile arıtma beş turdan sonra 41 Å de çözüldü. <img alt="Şekil 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig4highres.jpg" width="600" /> Şekil 4:.. Tohumların Arıtma ab) A, (daha önce tohumların bir alt) ve sonra (B) &#39;arıtma Şekil 2&#39; den bir viryon yoğunluğuna (B) &#39;de gösterilmektedir tohumlar olmuştur renk kodlu ilgili Çapraz göre korelasyon katsayıları (mavi, düşük korelasyon; kırmızı, yüksek korelasyon). (Örtüşmelerin çıkardıktan sonra üst% 75; ~ 1,000 kramponları) iyi correlating glikoprotein başak yamalar son ortalamasını hesaplamak için kullanıldı. Ortalama 35-Å çözünürlük (Şekil 5) karar verildi. Bu, ortada bir trimetik başak yapı ortaya çıkardıaltı komşu sivri bazı katkı ilave. Bilinen pozisyonlarda yapısını yerleştirerek hesaplanan virionlar, kompozit modelleri, viryon yüzeyi (Şekil 6) üzerine sivri yerleştirilmesini saptandı. Bazen, sivri yerel emretti yamalar (Şekil 6B) belirgindir. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig5highres.jpg" width="600" /> Şekil 5: şablon eşleştirme sonra glikoprotein başak tabakasının bir yama Rafine yapısı. (AB) &#39;bile&#39; ve &#39;garip&#39;, verilerin iki yarısı yeniden inşa İki haritalar gösterilmektedir. Iki harita yaklaşımın validness doğrulayan bir benzerlik dikkat çekici derecesini göstermektedir. Iki harita birbirinden bağımsız olarak tamamen yeniden inşa edilmiş olarak başak uzun ekseni etrafında yönelim farklı. Iki harita (C) ortalama ile gösterilir35 Å nihai kararı. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51714/51714fig6highres.jpg" width="600" /> Şekil 6: Bunyamwera virion üzerindeki sivri Yerleştirme. (A), viryonun Bileşik modeli. Görünüm vektörleri (sopa) sivri yönelimleri göstermektedir. Renkler her başak ve şablon yapısı (mavi, düşük korelasyon; kırmızı, yüksek korelasyon) arasındaki çapraz korelasyon göstermektedir. Sivri bir sipariş yama (B) A close-up.

Jsubtomo hesaplama paketi ile elektron kriyo-tomografisi ve alt tomogram ortalamasının bir kombinasyonu kullanılarak viral membran glikoprotein komplekslerinin yapılarını belirlemek için bir yaklaşım sunulmuştur.

Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Enveloped viruses utilize membrane glycoproteins on their surface to mediate entry into host cells. Three-dimensional structural analysis of these ...

Bu prosedürün genel amacı, zarflı virüslerin yüzeylerinde bulunan glikoprotein komplekslerinin yapılarını incelemektir. Bu işlem, öncelikle virüs partiküllerinin, elektron kriyomikroskopi verilerinden daha önce hesaplanmış olan tomografik hacimler içerisinde konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, manuel olarak tanımlanmış bir veri alt kümesi kullanılarak glikoprotein komplekslerinin istatistiksel olarak birbirinden bağımsız iki başlangıç modelinin oluşturulmasıdır.Ardından, bu modeller rafine edilir ve daha sonra virüs partikülleri üzerindeki tüm glikoprotein komplekslerini otomatik olarak tespit etmek için kullanılır. Son adım, tüm veri setini kullanarak glikoprotein kompleksinin yapısını rafine etmektir. Nihayetinde, final yapısını yorumlamak için moleküler görselleştirme araçları kullanılır.Bu glikoprotein spike yapılarının üç boyutlu yapısal analizi, viral patogenezin anlaşılmasının yanı sıra ilaç tasarımı için de paha biçilemezdir. Bu tekniğin x-ışını kristaloğrafisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, membran proteinlerinin doğal membran ortamındaki yapılarının çözülmesine olanak tanımasıdır. Bu teknik, yapısal biyolojideki temel konuların ele alınmasına yardımcı olabilir.Örneğin, membran içeren birçok virüsün yapısı. Bu teknik, söz konusu virüslerdeki glikoprotein kompleksleri hakkında bilgi sağlayabilse de, lipozomlara dahil edilmiş membran proteinleri gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Prosedür, grubumun üyeleri olan Slee ve David Bittel tarafından gösterilecektir.Başlamak için B show programında bir otogram dosyası açın. Parçacık seçme aracını kullanarak, bir virüs parçacığının merkez koordinatını belirleyerek otogramlardaki virüs parçacıklarını manuel olarak seçin. Tüm varyantlar işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.Virüs koordinatlarını bir star dosyasına kaydedin. Bu işlemi tüm tomogramlar için tekrarlayın. Ardından, alt hacimlerdeki varyonları ayrı hacim dosyalarına çıkarmak için J sub tomo py'yi ayıklama modunda çalıştırın; iki bağımsız başlangıç modeli oluşturmak için kaydedilen star dosyalarını girdi dosyaları olarak kullanın.İlk olarak, overyan alt hacim haritası dosyasını açın. B'de gösterilmiştir. Araç kutusu penceresi üzerinden erişilebilen partikül seçme aracını kullanarak bir spike'ın merkez koordinatını tanımlayıp, Varian alt hacimlerindeki spike'ların bir alt kümesini seçin.Tüm belirgin spike proteinleri işlenene kadar bu adımı tekrarlayın. Spike koordinatlarını bir star dosyasına kaydedin. Yaklaşık 200 glikoprotein spike işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.Metin protokolünde açıklandığı gibi görünümler varyantlara atandıktan sonra, J sub tomo create mask py kullanarak gerçek uzay maskesi oluşturun. Ardından J sub tomo create wedge mask py kullanarak bir resiprok uzay maskesi oluşturun.Ters uzay maskesi, tek eksenli tomografik veri toplama işleminden kaynaklanan eksik kama bölgesindeki alanları hariç tutmak için kullanılır. Ardından, giriş dosyası olarak kaydedilmiş bir seçim dosyası kullanarak J.Sub tomo create averages. PY ile iki başlangıç ortalaması oluşturun.Başlangıç ortalamalarındaki gürültüyü azaltmak için ization kullanın; önceden oluşturulmuş iki modeli J sub tomo iterate gold PY ile iteratif olarak hizalayın ve ortalayın. Bu sürecin her iki aşamasına ilişkin ayrıntılar metin protokolünde bulunabilir. Kyira'da ortaya çıkan alçak geçiren filtreli harita dosyasını inceleyerek yapıdaki simetri derecesini değerlendirin. Örneğin, spike trimerik bir kompleks ise, üçlü simetri belirgin olmalıdır.Yapılandırmayı, metin protokolünde detaylandırıldığı şekilde geliştirmeye devam edin. Ardından, şablon eşleştirme için Varian yüzeyinde eşit olarak konumlandırılmış tohumlar oluşturun ve JVs py'yi çalıştırarak tohumlara bir başlangıç görünüm vektörü atayın. Girdi dosyaları olarak önceden oluşturulan yıldız dosyalarını kullanın ve beklenen spike sayısından yaklaşık 1,5 kat daha fazla tohum üretin.Bu görünüm vektörü, her bir tohum noktasına en yakın olan spike yönünü yaklaşık olarak belirler. Ardından, daha önce yapıldığı gibi virüs yüzeyinin iki bağımsız ortalamasını oluşturun. Daha sonra, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde tohumların konumunu optimize edin.Son olarak, jvs.py kullanarak rafine edilmiş seed star dosyalarının com marker dosyalarını oluşturun. CMM dosyalarını ve ilgili virion harita dosyalarını açarak seed'leri inceleyin. kyira içinde.Rafine edilmiş tohumların virüs membranına göre doğru şekilde hizalandığından emin olun. Rafine edilmiş işaretleyiciler, çapraz korelasyon katsayılarına göre renklendirilebilir; rafine edilmiş tohumlar etrafında yerel şablon eşleştirme kullanarak Varian alt hacimlerindeki tüm spike proteinlerini otomatik olarak belirleyin, tespit edilen spike proteinlerini hizalayın ve ortalamalarını alın; başlangıç şablonları olarak manuel olarak seçilen spike proteinlerinin bir alt kümesinden oluşturulan ortalamaları kullanın. Bu işlemle ilgili ek ayrıntılar metin protokolünde bulunabilir; sonuçları görselleştirmek için, spike proteininin rafine edilmiş yapısını görselleştirme amacıyla kyira'da açın.Atomik yapıların yerleşimiyle devam edin. Ardından j Subo Create model DO py kullanarak virionun kompozit bir modelini oluşturun. Son olarak, görselleştirme için kompozit modeli kyira'da açın.İlk model, manuel olarak seçilmiş 205 spike kullanılarak geliştirilmiştir. En merkezdeki spike'ın üçlü simetrisi, herhangi bir simetri uygulanmadan belirginleşmiş ve Varian yüzeylerindeki tüm spike'ların manuel olarak tespit edilmesi için sonraki geliştirme turlarına uygulanmıştır. Her vion için 43 nanometre yarıçapta ve 20 derecelik aralıklarla 106 seed oluşturulmuş ve konumları membrana göre iteratif olarak geliştirilmiştir.En iyi korelasyona sahip glikoprotein spike yamaları, nihai ortalamayı hesaplamak için kullanıldı. Ortalama, 35 angstrom çözünürlüğe indirgendi. Bu işlem, merkezde trimerik bir spike yapısının yanı sıra altı komşu spike'tan gelen bazı katkıları ortaya çıkardı.Yapının bilinen konumlara yerleştirilmesiyle hesaplanan varislerin kompozit modelleri, Varian yüzeyi üzerinde spike'ların yerleşimini ortaya çıkardı. Zaman zaman, yerel olarak düzenlenmiş spike yamaları belirginleşti. Bu prosedür uygulanırken, yalnızca en iyi verilerin kullanılması ve tüm ara sonuçların dikkatle kontrol edilmesi önemlidir.Bu prosedürün ardından, protein-protein etkileşimlerinin daha doğru bir görünümünü elde etmek için x-ışını kristalografi yapıları nihai ortalamaya uydurulabilir. Bu videoyu izledikten sonra, J Omo kullanarak viral zar glikoprotein yapılarının nasıl ortalandığına dair iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

averaging-viral-envelope-glycoprotein-spikes-from-electron

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protokol zarı proteinleri kullanarak kriyo-elektron tomografisi ve 3D görüntü işleme yapıları belirlemek için yüksek verimli bir yaklaşımı açıklar. Numune hazırlama, veri toplama, veri işleme ve yorumlama kapsar ve yaklaşım, HIV-1 zarf glikoprotein bir temsilcisi hedef üretim ile son bulur. Bu hesaplama prosedürleri, araştırmacılar ve öğrenciler uzaktan çalışma ve veri işleme ve yapısal analiz için katkıda bulunmayı sağlayan bir şekilde dizayn edilmiştir.

Cryo-Elektron Tomografi ve Otomatik Sub-tomogram Ortalaması kullanarak HIV Zarf Glikoproteinler Moleküler Yapılarının Belirlenmesi

Bu makale kriyo-elektron mikroskobu ile helisel monte moleküllerin üç boyutlu (3D) yapısı elde etmek için bir yöntem açıklanır. Bu protokol, HIV-1 kapsid meclisleri iteratif sarmal gerçek uzay rekonstrüksiyon yöntemi ile bir yoğunluk haritası ulaşmak için ayrıntılı 3 boyutlu rekonstrüksiyon prosedürü göstermek için kullanın.

Cryo-Elektron Mikroskopi tarafından HIV-1 kapsid Meclisleri Yapısı ve iteratif Helisel Gerçek uzay İmar

Biz toplamak ve tüm mitokondri süreç elektron cryo-tomografi nasıl bir protokol mevcut. Teknik, doğal biyolojik membranların büyük membran protein komplekslerinin yapısı, işlevi, ve organizasyon hakkında detaylı bilgiler sağlar.

Elektron Cryo-tomografi ile Mitokondri ATP Sintazı dimerlerini Görselleştirme

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Burada, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak nano ölçekte sıvı-EM ve kriyo-EM analizi için uygun virüs düzenekleri hazırlamak için protokoller açıklanmaktadır.

Sıvı ve Buzdaki Virüs Düzeneklerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesinin İlerlemesi

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Bu video protokolü, virolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron mikroskobu tomografisinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir. Optimum sonuçlar için numuneler, yüksek basınçlı dondurma ve ardından dondurma ikamesi ile hazırlanır.

Virolojide Taramalı Transmisyon Elektron Mikroskobu Tomografisi: Yüksek Basınçlı Dondurulmuş, Dondurularak İkame Edilmiş Örneklerin 3 Boyutlu Görüntülenmesi

Bu makale, kriyo-elektron tomografisi kullanılarak görüntülenen influenza virüslerinin veri işlemesi ve ardından hemaglutinin glikoproteininin subtomogram ortalaması için bir protokol sunmaktadır. Bu protokol, görüntü ön işlemeden son model iyileştirmeye kadar adım adım veri işlemeyi kapsar.

İnfluenza Virüslerinin Kriyo-elektron Tomografisinden Hemaglutinin'in Nanometre Altı Çözünürlükte Yapısal Tayini

Virochip korunmuş dizi homoloji temelinde aynı anda, bilinen tüm virüsleri yanı sıra roman virüsler tespit etmek için tasarlanmış bir pan-viral mikroarray. İşte biz, varlığı bilinen ve bilinmeyen virüslere hem de klinik örnekleri analiz etmek için bir Virochip tahlil nasıl çalıştırılacağını göstermektedir.

Viral Patojenler Klinik Örnekler Ekranına bir Pan-Viral Mikroarray Testi (Virochip)

Keşfedin elektron kriyotomografi ve Jsubtomo kullanarak viral zarf glikoprotein komplekslerinin yapısal analizini. Bu yöntem, zarf virüslerindeki glikoprotein sivri uçlarını in situ çözümleyerek viral patogenez ve ilaç tasarımı için kritik bilgiler sunar.

Jsubtomo kullanılarak Elektron Cryotomography Rekonstrüksiyonunda ikinci viral zarf glikoproteini Spikes ortalamasını

Daha fazla video keşfet