Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro mikroarray tabanlı bir analiz kullanarak bakteriyel iki bileşenli yanıt regülatörlerinin genomik bağlanma bölgelerini belirlemektir. Bu işlem; etiketli bir yanıt regülatör proteininin klonlanması ve saflaştırılması, in vitro fosforilasyon ile aktive edilmesi ve sonraki mikroarray aşamaları için pozitif kontrol olarak kullanılacak bir gen hedefinin elektroforetik mobilite kayması analizleri ile belirlenmesi yoluyla gerçekleştirilir. İkinci bir adım olarak, saflaştırılmış yanıt regülatör proteini genomik DNA ile karıştırılır; bu işlem, proteine bağlı DNA'nın afinite saflaştırması kullanılarak giriş DNA'sından ayrılmasını sağlar.

Ardından, proteine bağlı DNA ve girdi DNA'sı amplifiye edilir, protein bağlı fraksiyonda pozitif kontrol gen hedefinin zenginleşmesi QPCR ile doğrulanır, floresanla işaretlenir, havuzlanır ve bir tiling mikroarray'e hibridize edilir. Yanıt düzenleyicinin genomik bağlanma bölgelerini belirlemek için sonuçlar, incelenen yanıt düzenleyici tarafından düzenlenen en muhtemel genleri gösterir ve sonuçlar elektroforetik mobilite kayması analizleri kullanılarak daha fazla doğrulanabilir. Bu tekniğin in vivo chip chip gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, iki bileşenli sistemler için aktive edici sinyaller ve koşullar bilinmese bile kullanılabilmesidir.

Yanıt regülatörlerinin büyük çoğunluğunun gen hedefleri bilinmediğinden, bu yöntem bakteriyel sinyalizasyon alanı için büyük önem taşımaktadır ve karmaşık düzenleyici ağların aydınlatılmasına yardımcı olmaktadır. Bu prosedür, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Amy Chen tarafından gösterilecektir. Prosedüre başlamadan önce.

Klonlanmış bir DVU 3 0 2 3 gen karışımından eksprese edilen bir rr, özellikle DVU 3 0 2 3 proteinini saflaştırın. Tamponlanmış bir çözelti içerisinde, toplam 20 µL hacme gelecek şekilde 0,5 picomole DVU 3 0 2 3 proteini ile önceden hazırlanmış 100 fentomole at inated DNA substratını birleştirin. Kontrol amacıyla protein içermeyen bir reaksiyon hazırladıktan sonra, reaksiyonları oda sıcaklığında, tezgah üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edin.

İnkübasyonu takiben, bağlanma reaksiyonlarına beş mikrolitre 5x yükleme tamponu ekleyin. Her reaksiyondan 18 mikrolitreyi daha önce hazırlanmış mini %6 poliakrilamid 0.5 XTBE jeline yükleyin ve 100 voltta iki saat boyunca çalıştırın; jel çalıştırıldıktan sonra, şarj edilmiş bir naylon membranı jel boyutunda kesin ve en az 10 dakika boyunca 0.5 XTBE içinde bekletin. Ardından jeli kasetten çıkarın.

Jeldeki tüm çıkıntıları kesin ve jeli ve membranı 0.5 XTBE ile ıslatılmış iki kalın filtre kağıdı arasına yerleştirin. Jeli ve membranı yarı kuru bir blotting düzeneğine yerleştirin ve 20 voltta 30 dakika boyunca çalıştırın. Bunun ardından, membranı ticari bir UV ışığı crosslinker cihazına yerleştirin; kemilüminesan bir tespit kiti kullanarak blotu geliştirdikten sonra süreyi üç dakikaya ayarlayın ve CCD donanımlı bir kameraya bağlı bir bilgisayar kullanarak görüntüleyin.

RR'nin varlığında, RR'nin test edilen DNA'ya bağlandığını gösteren DNA substrat mobilitesinde bir kayma olup olmadığını kontrol edin. Ardından, tamponlanmış bir çözelti içinde iki ila üç mikrogram ortak genomik DNA'yı 0.5 pikomol DVU 3 0 2 3 ile karıştırın. Reaksiyonu 25 °C'de 30 dakika inkübe ettikten sonra, karışımdan 10 µL'yi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve bunu girdi DNA'sı olarak etiketleyin.

0,6 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne 30 µL nikel NTA agaroz reçinesi ekleyin. Reçineyi santrifüj sonrası tüpün dibinde toplamak için örneği 100 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Bu aşamada süpernatantı uzaklaştırın.

100 µL yıkama tamponu ekleyin ve içeriği karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. Santrifüj sonrası, iki dakika boyunca 100 G uygulayın ve süpernatantı uzaklaştırın. Bağlama reaksiyonunun geri kalan 90 µL'sini nikel NTA reçine yıkamasına ekleyin.

Ardından numuneyi bir döner çalkalayıcıda 30 dakika boyunca inkübe edin. İşlem tamamlandığında, numuneyi 100 Gs hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, yıkama adımlarını üç kez daha tekrarlayın.

Ardından reçineye 35 µL elüsyon tamponu ekleyin ve vorteksleyerek karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında, tezgah üzerinde beş dakika inkübe edin. Numuneyi santrifüj ettikten sonra, süpernatanı yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve proteine bağlı DNA fraksiyonu olarak etiketleyin.

Ardından, girdi ve proteine bağlı DNA fraksiyonlarının saflaştırılmasını takiben, girdi DNA'sına 35 µL elüsyon tamponu ekleyin. Her birinden ayrı PCR tüplerine 10 µL ekleyin. Daha sonra her örneğe bir µL 10x fragmantasyon tamponu, iki µL kütüphane hazırlama tamponu ve bir µL kütüphane stabilizasyon solüsyonu ekleyerek örnekleri vorteksleyerek iyice karıştırın.

Numuneleri bir termal döngüleyici cihazda 95 °C'de iki dakika boyunca inkübe edin. İşlem tamamlandığında, numuneleri buz üzerinde soğutun. Ardından, numunelere bir µL kütüphane hazırlama enzimi ekleyin ve içeriği pipetleyerek karıştırın.

Numuneleri bir termal döngüleyici cihazda inkübe edin. İnkübasyon sonrası, her tüpe 47,5 µL su, 7,5 µL 10x amplifikasyon master mix'i ve beş µL polimeraz ekleyin. Numuneler karıştırıldıktan sonra, onları bir termal döngüleyici cihazda ısıtın.

Önceden tasarlanmış her primer seti için 1x master mix hazırlayarak her bir DNA şablonu için triplike QPCR reaksiyonları kurun; ardından 96 kuyucuklu bir PCR plakasının her kuyucuğuna 18 µL master mix paylaştırın. Amplifiye edilmiş ve saflaştırılmış girdi ve proteine bağlı DNA örneklerini su ile 5 ng/µL olacak şekilde seyreltin ve her bir örnekten 2 µL'yi kuyucuklara ekleyin. Bunun ardından plakayı UltraClear QPCR sızdırmazlık filmi ile kapatın.

Plakayı bir santrifüjde 200 GS hızında bir dakika boyunca döndürün. Plaka bir gerçek zamanlı QPCR makinesine yerleştirildikten sonra, girdi DNA'sını s si three ve zenginleştirilmiş DNA'yı sci five ile işaretlemek için aşağıdaki koşullar kullanılarak, 1 µg DNA'yı 40 µL S3 SCI-FI işaretli dokuzlu nükleotidlerle (nine mers) karıştırın ve hacmi su ile 80 µL'ye tamamlayın. Örnekleri bir termal döngüleyici (thermal cycler) içerisinde, karanlıkta 98 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin.

İşlem tamamlandığında, örnekleri buz üzerinde iki dakika boyunca hızlıca soğutun; ardından her reaksiyona iki mikrolitre 3' - 5' ekzonükleaz polimeraz, 5 millimolar deoksiribonükleotid trifosfat ve sekiz mikrolitre su ekleyin. Karıştırdıktan sonra, reaksiyonları bir termal döngüleyici cihazda, karanlıkta, 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Bu aşamada, reaksiyonları durdurmak için 50 millimolar olacak şekilde EDTA ve 0.5 molar olacak şekilde sodyum klorür çözeltisi ekleyin.

Ardından, 10 dakika boyunca karanlıkta inkübasyonun ardından 0.9 hacim izopropanol içeren 1.5 mililitrelik tüplere aktarın. Numuneleri 12,000 GS'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. S3 ve sci-fi işaretli DNA'lardan altışar mikrogramı bir 1.5 mililitrelik tüpte birleştirin ve santrifüj kapağı şeffafsa kapatarak karanlıkta, düşük ısıda santrifüj içerisinde vakumla kurutun.

Peletler kuruduktan sonra, bunları beş µL su içerisinde süspande ediyoruz. Ardından, 15 saniye boyunca vortekslenen örneklere, önceden hazırlanmış 1x hibridizasyon solüsyonu master mix'inden 13 µL ekleyin ve örnekleri bir kuru banyoda 95 °C'de beş dakika inkübe edin. Örnekleri kuru banyodan çıkarın ve yüklemeye hazır olana kadar 42 °C'deki bir hibridizasyon sistemine yerleştirin.

Ardından, önceden hazırlanmış karıştırıcı lam düzeneğini hibridizasyon sisteminin içine yerleştirin. Dolum portuna 16 µL örnek yükleyin. Daha sonra portları yapışkan bir filmle mühürleyin ve sistemdeki karıştırma işlemini başlatın. 42 °C'de 16 ila 20 saat hibridizasyon yaptıktan sonra.

Karıştırıcı lamı, bir sökme aracına yerleştirin ve ılık tampon çözelti içeren bir kabın içine koyun. Karıştırıcıyı, sökme aracını şiddetli bir şekilde sallayarak soyun. Lamı, 50 milliliters yıkama tamponu bir içeren bir kaba yerleştirin ve iki dakika boyunca şiddetle sallayın.

Ardından önceki adımı 50 mililitre yıkama tamponu iki ve 50 mililitre yıkama tamponu üç RRR DVU 3 0 2 3 kaymış ile tekrarlayın. DVU 3 0 2 5 QPCR'ın üst bölgesi, DVU 3 0 2 5 üst bölgesinin giriş DNA'sına kıyasla proteine bağlı fraksiyonda zenginleştiğini göstermiş, böylece bağlanma koşullarının DVU 3 0 2 3 için uygun olduğunu göstermiştir; DVU 0 0 1 3 negatif kontrol olarak kullanılmıştır. DAP chipp analizi sonrası elde edilen en yüksek dört pik, DV 3 0 2 3'ün en olası hedefleri olarak seçilmiştir.

Pozitif hedef DVU 3 0 2 5, en yüksek skorla elde edilen ilk zirveydi. Diğer iki gen hedefi, ly kodlanmış iki diğer laktat permeazdır. Dördüncü gen hedefi bir üst bölgede değil, konverjan şekilde transkribe edilen iki gen arasındaki genler arası bölgede yer alır; DAP chip meme tarafından elde edilen hedeflerin üst bölgeleri, bir bağlanma bölgesi motifini öngörmek için kullanılmıştır.

Motif, motif içindeki korunmuş bazlarda yer değiştirme yapılarak daha da doğrulanmış ve bu işlem bağlanma kaymasını ortadan kaldırmıştır. Doğrulanan motif, DVU 3 0 2 3 ortolog lokuslarına sahip diğer sülfat indirgeyen bakteri genomlarını taramak için kullanılmış; motifin, otolog rs'ler için öngörülen motif dizileri kullanılarak açık okuma çerçevelerinin üst bölgelerinde yer aldığı durumlar olası gen hedefleri olarak seçilmiştir. Divo Garris Hilton Burrow'unkiyle yakından benzerlik gösteren bir konsensüs bağlanma bölgesi motifi oluşturulmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, düzenleyici proteinler için gen hedeflerini belirlemede Daptive yönteminin nasıl kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu yöntem, protein saflaştırılabildiği ve genom dizisi bilindiği sürece, herhangi bir düzenleyici proteinin bağlanma boyutunu analiz etmek için kullanılabilir.