Name: Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Öğrenin fare embriyonik pankreas progenitörlerini 3D Matrigel kültüründe genişletme ve dallanmış organoidlere farklılaştırma yöntemini. Bu teknik canlı görüntüleme ve fonksiyonel manipülasyon için gelişmiş bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Det sutable Forskningsråd / Sundhed og Sygdom Bir Genetik Pilot ödülü NCCR Frontiers, Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı Hibe 41-2009-775 ve Grant 12-126875 tarafından sırayla finanse edildi. Yazarlar video çekimi sahipliği için Spagnoli laboratuvar teşekkür ederim.

Bu protokol kemirgen E10.5 türetilen pankreas organoids epitel hücreleri pankreas ayrışmış büyümeyi hedeflemektedir. Protokol hayvan deney için etik kurul onayı gerektirir. E10.5 fare embriyoları Dorsal Pankreas Bud 1. Diseksiyon <ol><li> Bir makas ile karın açmak, embriyonik gün (E) 10.5 aşımına hamile fareler kurban, iki rahim boynuzları çıkarın ve soğuk fosfat tamponu (PBS) veya Dulbeccol ile dolu bir 10 cm Petri kabındaki koyun modifiye temel, orta (DMEM) buz üzerinde tutuldu. Hücre ekimi için kurban gelen toplam deney hücre zarar görmesini önlemek için, 60-90 dakika içinde yapılır. </li><li> Küçük bir makas kullanarak tek tek embriyo bölümler halinde rahim ayırın. Gibi soğuk PBS ile bir 35 mm Petri kabı, bir embriyo transfer ve üstten aydınlatma ile bir mikroskop altında görselleştirmek. Diseksiyon forseps ile çevreleyen kas, desidua ve yumurta sarısı sa kaldırmakc ve embriyo maruz. Lütfen soğuk DMEM ortama embriyo yerleştirin. Embriyolar kolayca 3 ml&#39;lik plastik transferi pipet / damlalık kullanarak transfer edilebilir. Devam etmeden önce benzer bir şekilde, her bir embriyonun izole edin. </li><li> PBS içinde temiz bir 35 mm Petri kabı içine bir embriyo yerleştirin. <ol><li> Ön ayakları kaldırmak için ince forseps (0.05 mm genişlik) kullanın. Yavaşça omurilik bölgesinden sindirim sistemi (Şekil 1) ayırmak için açılış forseps yerleştirin. İSTEĞE BAĞLI: daha rahat, mide görmek aşağı sarısı sap altında kalp ve kuyruk bölgeye, embriyonun üst vücut kaldırmak için. </li><li> Mide, karaciğer ve bağırsak bulun. Forseps kullanılarak, bağırsak mideden mide-bağırsak yolu izole etmek ve (Şekil 1), buz üzerinde, soğuk DMEM içine yerleştirin. Dorsal pankreatik bud mide dorsal, posterior (Şekil 1) takılır. </li><li> Bir simi her bireyin gastrointestinal izoleDevam etmeden önce lar şekilde. Embriyoların genotip gerekiyorsa, diseksiyon zamanda kuyruk toplar ve buz soğuk DMEM ile 24 kuyucuklu bir plaka içerisinde farklı bir kuyu içinde her bir mide-bağırsak yolu tutmak. </li></ol></li><li> Soğuk PBS ile temiz bir 35 mm Petri tabağına yerleştirin, bir mide-bağırsak yolu. Şimdi diseksiyon mikroskop altında dorsal pankreas tomurcuk görselleştirmek ve teşrih parlak alanda aşağıdan aydınlatma kullanın. Bu koşullar hacimlerinin görselleştirme optimize eder. Elektrolitik-bilenmiş tungsten iğne veya 20 G şırınga iğneleri kullanarak, epiteli etrafında mümkün olduğunca az mezenşimin ile pankreas tomurcuğu (Şekil 1) izole. <ol><li> 2-3 dakika boyunca, bir soğuk dispase çözeltisi (1.25 mg / ml) ihtiva eden bir petri çanağı içine izole edilmiş tomurcuk aktarın. Bu noktadan itibaren, transfer en uygun bir ağızdan-kontrol edilen esnek bir boru bağlanmış alev çekilmiş 50 ul bir cam kılcal ile yapılabilir. Alternatif olarak, ancak daha ritomurcuğu kaybetme sk, uygun plastik ipuçları ile 10 ul otomatik pipet (Pipetman) kullanın. </li><li> Mikroskopik kontrol altında pankreas tomurcuk aspirasyon ve fırlamasını gerçekleştirin. Geri PBS içinde pankreas tomurcuk koydu. Bundan başka, cam kılcal (Şekil 1) kullanılarak, iğnelerin ve yumuşak aspirasyon ile mezenşimin gelen izole edilmiş pankreas tomurcuk temizleyin. </li><li> Tüm mezenşimin çıkarıldığında, soğuk PBS içinde pankreatik tomurcuk durulama; (60-iyi mini tepsi soğuk DMEM 10 ul ile dolu) bireysel kuyularda soğuk DMEM&#39;ye her tomurcuk transfer. Bu doku çok yapışkan yapar, dispase yılında mezenşimi kaldırmak için önemli değildir. </li></ol></li></ol> Dağılmış hücreler 2. Kaplama ve Kültür <ol><li> Durulama için 10 ul PBS ile dolu 60-iyi mini kasetlerinden konik kuyuların içine alev-kapiller çekti cam ile tüm embriyolar disseke epitelyaya aktarın. <ol><li> Tripsin% 0.05 a 10 ul transfer tomurcuknd bu 4 dakika süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. 10 ul DMEM +% 10 fetal dana serumu (FCS) ile bir kuyuya tomurcuk aktararak tripsin etkisiz hale getirirler. </li><li> Bir pipet çektirmesi ile çekilmiş ince kılcal damar yoluyla aspirasyon ile hücre süspansiyonu ayrışır. Bu hücreleri ayırmak için yukarı ve aşağı pipetleme sırasında bu aşamada kabarcıkları önlemek için önemlidir. Pankreas organoids optimum 5-15 hücre küçük gruplar başlar ve bu nedenle kısmi ayrılma (Şekil 1) kullanılması tavsiye edilir. </li></ol></li><li> Tek tek işleme nedeniyle farklılıkları en aza indirmek amacıyla bir Eppendorf tüpü içine birkaç embriyolarından hücreleri havuzda toplayın. , 1:3 oranında Matrigel soğutulmuş hücre süspansiyonu seyreltin. Kısım 96 oyuklu bir plaka, 8 ul / oyuk veya görüntüleme için optimize edilmiş bir plaka içinde (aşağıya bakınız) için bu karışımı ile gerçekleştirilmektedir. </li><li> Matrigel kalınlaştırmak için izin veren, 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Seçim ortamı 70 ul ile kuyu doldurun (organoid veya küre, sekmesine bakınles 1 ve 2) ve 37 ° C de% 5 CO2 ve% 95 hava içeren nemlendirilmiş bir ortamda bırakmak </li><li> Her 4. günde orta yerine. Günlük büyüyen pankreas koloniler izlemek ve görüntüleme işlemini belgelemek. </li><li> Daha önce rapor edildiği gibi, 28 çıkar küçük moleküller ya da proteinler, girişim deneyleri için bu aşamada ortamına ilave edilebilir. </li></ol> Tablo 1: organoid ortamı. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> Son ortam içinde konsantre </td><td> Stokunun hacmi </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> % 100 </td><td> % 1 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> Nakavt Serum değiştirme (ek) </td><td> % 100 </td><td> % 10. </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> 14.3 M </td&gt; <td> 0.1 mM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Forbol Miristat Asetat (PMA) </td><td> 16 iM </td><td> 16 nM </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK inhibitörü) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> EGF </td><td> 50 ug / ml </td><td> 25 ng / ml </td><td> 2.5 ul </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan 1 R-spondin </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> - Ya da - </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant Fare R-1 spondin </td><td> 250 ug / ml </td><td> 500 ng / ml </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan FGF1 (aFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 25 ug / ml </td><td> 1.25 ul </td></tr><tr><td> Heparin (Liquemin) </td><td> 2500 U / ml </td><td> 2.5 U / ml </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> Recombinant İnsan FGF10 </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4,412.25 ul </td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td></td><td> 5000 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Küre ortamı. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Malzeme Adı </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> Son ortam içinde konsantre </td><td> Stokunun hacmi </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> % 100 </td><td> % 1 </td><td> 50 ul </td></tr><tr><td> B27 x50 (ek) </td><td> % 100 </td><td> % 10. </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Rekombinant İnsan FGF2 (bFGF) </td><td> 100 ug / ml </td><td> 64 ng / ml </td><td> 3.2 ul </td></tr><tr><td> Y-27632 (ROCK inhibitörü) </td><td> 50 mM </td><td> 10 uM </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td></td><td></td><td> 4845,8 ul </td></tr><tr><td> Toplam </td><td></td><td></td><td> 5000 ul </td></tr></tbody></table> Organoid Geliştirme İlerlemesi 3. Görüntüleme <ol><li> Görüntü organoids günlük veya zaman atlamalı mikroskopi bir floresan time-lapse mikroskop kullanılarak. Zaman atlamalı görüntüleme için, bir XY (Z) otomatik ters floresan mikroskop kullanın. </li><li> 4-çukurlu plakalara veya 2-5 ml ortam ile doldurulmuş olan cam-tabanlı plakalar içerisinde 3 ul&#39;lik Deposit küçük damlacıklar halinde. 10x uzun mesafe hedefi ile görüntü. Not: floresan izleyiciler ifade eden transjenik farenin kullanılabilir. Örneğin Movie 1 gösterileri Pdx1-Ngn3-ER TM-ires-nGFP + farelerden 4 organoids ilk genişleme. Nükleer GFP tek nesneleri ancak benzer ilkeler zar floresan ile hücreleri izlemek için uygulanabilir olarak hücreleri izlemek için sağlar bumT / mG fareler 29 gibi. </li><li> Odak sürükleniyor önlemek ve elle tanımlanmış pozisyonlarda 3 veya daha fazla gün için 1 resim / saat almak için yazılım kontrol otomasyon ayarlamak için tohum hücreleri sonra time-lapse görüntüleme 3 saat başlayın. Her bir konumu için, floresan markör ifade raporlama, diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntü hem de GFP sinyali elde. </li></ol> Histoloji için Organoids 4. Recovery <ol><li> Buz üzerinde 96 oyuklu plaka koyun ve buz gibi soğuk PBS ile değiştirilmesi, orta çıkarın. Bu kısmen Matrigel depolimerize. </li><li> Yavaşça genel yapısını bozmayacak amacıyla 1.000 ul ucu kullanarak çevredeki Matrigel kaldırarak, her organoid aspire. Buz gibi soğuk PBS ile bir kuyuya her organoid aktarın. Buz üzerinde plaka tutun. Matrigel Doğrudan tespit de mümkündür. </li><li> ,% 4 paraformaldehit (PFA) içerisinde 15 dakika boyunca organoid saptamak sukroz içinde dondurularak saklanabilmesi ve jelatin içine gömmek. Her Süreçorganoid önce (Johansson et al., 2007) tarif edildiği gibi 4 cryosectioning ve histoloji için. </li></ol> PCR ve Biyokimya Organoids 5. Recovery <ol><li> Buz üzerinde 96 oyuklu plaka yerleştirin ve orta çıkarın. Hücresel RNA stabilize etmek ve korumak için oyuk başına RNAlater 60 ul ekle. </li><li> Kısmen buz üzerinde depolymerizing her iyi mekanik olarak jel bozar. Genel yapısını bozabilir veya 200 ul ucu ile mekanik jel bozarak (Matrigel ile) tüm iyileşmez için 1.000 ul uç kullanarak bireysel organoids kurtarmak ya. Bir RNAse serbest olmayan yapışkan Eppendorf tüpüne da içerik aktarmak için 1.000 ul ucu kullanın buz üzerinde tutulmalıdır. </li><li> 60 ul RNAlater ile kuyu yıkayın ve aynı Eppendorf tüpüne kalan içerik eklemek. </li><li> 4 ° C &#39;de 500-1000 x g&#39;de 5 dakika boyunca tüpleri Spin </li><li> Sadece 20-30 ul bırakarak, süpernatant kaldırmakbirlikte pelet ile tüp içinde RNAlater. Biyokimya için, mümkün olduğu kadar kuru numune saklayın. </li><li> Hemen RNAlater örnekleri dondurma etmeyin; 4 ° CO / N de mağaza (RNAlater iyice dokuya nüfuz sağlamak için). Doku, uzun süreli depolama için -20 ° C &#39;de muhafaza edilebilir ve daha sonra, doku bozulması ve RNA küçük miktarlarda çıkarılması için işlenebilir. </li></ol>

<ol><li>Pagliuca, F. W., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+functional+beta-cell%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">How to make a functional beta-cell.</a> Development. 140, 2472-2483 (2013).</li>
<li>Percival, A. C., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li>
<li>Attali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+beta-cell+differentiation+by+the+pancreatic+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Control of beta-cell differentiation by the pancreatic mesenchyme.</a> Diabetes. 56, 1248-1258 (2007).</li>
<li>Johansson, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+control+of+neurogenin3+activity+in+pancreas+progenitors+reveals+competence+windows+for+the+generation+of+different+endocrine+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal control of neurogenin3 activity in pancreas progenitors reveals competence windows for the generation of different endocrine cell types.</a> Dev Cell. 12, 457-465 (2007).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Arch. 446, 553-558 (2003).</li>
<li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Dev Biol. 4, 242-255 (1962).</li>
<li>Miralles, F., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follistatin+regulates+the+relative+proportions+of+endocrine+versus+exocrine+tissue+during+pancreatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Follistatin regulates the relative proportions of endocrine versus exocrine tissue during pancreatic development.</a> Development. 125, 1017-1024 (1998).</li>
<li>Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+ex+vivo+culturing+of+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas.</a> J. Vis. Exp. , 3979(2012).</li>
<li>Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+plays+a+key+role+in+morphogenesis+of+the+pancreatic+islets+of+Langerhans+by+controlling+the+activity+of+the+matrix+metalloproteinase+MMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2.</a> J Cell Biol. 143, 827-836 (1998).</li>
<li>Hope, K., Bhatia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+interrogation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Clonal interrogation of stem cells.</a> Nat Methods. 8, 36-40 (2011).</li>
<li>Sugiyama, T., Rodriguez, R. T., McLean, G. W., Kim, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+markers+of+fetal+pancreatic+epithelium+permit+prospective+isolation+of+islet+progenitor+cells+by+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conserved markers of fetal pancreatic epithelium permit prospective isolation of islet progenitor cells by FACS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 175-180 (2007).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17, 1253-1270 (2003).</li>
<li>Smukler, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+mouse+and+human+pancreas+contain+rare+multipotent+stem+cells+that+express+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The adult mouse and human pancreas contain rare multipotent stem cells that express insulin.</a> Cell Stem Cell. 8, 281-293 (2011).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Sugiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+pancreas+development+from+purified+progenitor+cells+reveals+genes+essential+for+islet+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reconstituting pancreas development from purified progenitor cells reveals genes essential for islet differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 12691-12696 (2013).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. , (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. , (2009).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15, 701-706 (2009).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494, 247-250 (2013).</li>
<li>Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+cultivation+and+characterization+of+adult+murine+prostate+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells.</a> Nat Protoc. 5, 702-713 (2010).</li>
<li>Rock, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12771-12775 (2009).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 10, (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

In vitro fonksiyonel beta hücrelerinin büyük ölçekli üretim hala 1 etkisizdir. Bu zorlu bağlamda, gelişim biyolojisi çalışma fonksiyonel beta hücrelerinin farklılaşması için gerekli olan tam sinyalleri deşifre yardımcı olabilir. Bu protokol, in vitro embriyo pankreas progenitörlerin bakım, genişleme ve farklılaşması için izin verir. Bu, diğer endokrin hormon eş bildirilmemektedir insülin üreten beta hücrelerinin oluşumunu içeren, Pdx1 yüksek düzeyde, insülin olgun ve işlenmiş insülin 28...

Organ kültür vivo araştırmalarda karmaşık ama son derece alakalı arasındaki boşlukları ve hücre çizgi modellerin uygun ama yaklaşık simülasyon köprü kullanışlı bir model sağlar. Pankreas durumunda, endokrin ve ekzokrin hücreleri taklit hücre çizgileri bulunmaktadır transforme edilir, ancak pankreas progenitörlerin mükemmel eşdeğer herhangi bir hücre hattı yoktur. Yetişkin Bütün pankreas kültüre olamaz; izole edilmiş endokrin adacık hücresi çoğalması olmadan birkaç hafta muhafaza edilebilir ve doku dilimleri birkaç saat 5 için in vitro olarak tutulabilir. Embriyonik pankreas kültürü yaygın gelişimini incelemek için sadece kullanılır olmuştur, ama aynı zamanda 8 işler görüntüye, epitelyal-mezenkimal etkileşimleri 4,6,7 araştırmak veya kimyasal onlarla 9 ile müdahale. İki organ kültürü yöntemleri ağırlıklı olarak kullanılır: İlk conve fibronektin kaplı plakalar 2, üzerinde pankreas tomurcukları kültürleme oluşurGörüntüleme amacıyla nient; İkinci seçenek kültürüne en morfogenetiğine korur hava-sıvı arayüzü 3,4 de filtrelerde organ olduğunu. Çok faydalı olmasına rağmen, bu yöntemler, düzleşme belli bir dereceye kadar yol; normal gelişimi ile karşılaştırıldığında ve başlangıç ​​popülasyonu pankreas hücreleri ve mezenkimal hücreler her türlü içeren karmaşık olduğu gibi progenitörlerin genişleme çok sınırlıdır. Kültür yeteneği ve dağınık birincil hücreleri genişletmek soy ilişkileri incelemek ve izole hücre tiplerinin 10 içsel özelliklerini ortaya çıkarmak için değerlidir. Sugiyama ve ark. 11. pankreas atalarıdır ve besleyici katmanlar kültürde 3-5 gündür bazı fonksiyonel karakterleri korunur endokrin atalarıdır korumak olabilir. Atalarıdır doğası / kök hücrelerin rağmen neurospheres 12 ve 13 mammospheres benzer Pancreatospheres, yetişkin adacık ve duktal hücrelerinden genişletilmiştirBu küreler oluşturmak olduğu açık değildir. Buna ek olarak, fizyolojik gelişimi ile aksine, bazı pancreatospheres nöronlar 14,15 ihtiva etmiştir. Küreler yakın zamanda embriyonik pankreas atalarıdır 16,17 ve iyi progenitör genişleme ve sonraki farklılaşma ile pankreata 18 yenileyici üretilir ama morfogenetiğine özetlemek başarısız olduğu görülmüştür. Minyatür organları içine kendi kendini düzenleyebilir ve genellikle dağınık tanımlanan hücrelerden 3 boyutlu modeller son gelişti ve bu bağırsak 19,20, 21, mide, karaciğer 22, prostat 23 ve nefes borusu gibi birden fazla organların gelişimi veya yetişkin devir taklit adres 24. Optik bardak 25, 26 ya da bağırsak, beyin 27 olduğu gibi, bazı durumlarda, gelişme morfolojisi ve farklılaşması, ES hücrelerinden in 3D değinmeyecek edilmiştir. Burada, biz desOnlar farklılaştırmak ve öz-örgütlenmeyi bir 3D Matrigel iskele ayrışmış multipotent pankreas atalarıdır genişletmek için bir yöntem cribe.

<table><tbody><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Stok -20 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum replasmanı (takviye)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Stok -20 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3148-25ML</td><td>Stok 4 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>Phorbol Myristat Asetat (PMA)</td><td>Calbiotech</td><td>524400-1MG</td><td>Stok -20 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>Y-27632 (ROCK inhibitörü)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>ab120129</td><td>Stok -20 ° C'de tutuldu. Dikkat! Kararlılık/kaynak sık karşılaşılan bir sorun kaynağıdır.</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9644-2MG</td><td>Hisse Senedi -80 &° C'de Tutuldu; C</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan R-spondin 1</td><td>R& D</td><td>4645-RS-025/CF</td><td>Stok -80 > C</td></tr><tr><td>Rekombinant Fare R-spondin 1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td>Stok -80 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF1 (aFGF)</td><td>R& D</td><td>232-FA-025</td><td>Stok -80 &°C'de tutuldu; C - beta hücre üretimini artırmak için içermez</td></tr><tr><td>Heparin (Liquemin)</td><td>Drossapharm</td><td></td><td>Stoku 4 & °C'de tutulur; C</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF10</td><td>R& D</td><td>345-FG-025</td><td>Stok -80 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>Stok -20 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>B27 x50 (ek)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Stok -20 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF2 (bFGF)</td><td>R& D</td><td>233-FB-025</td><td>Stok -80 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Hisse Senedi -20 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>Tripsin %0.05Gibco</td><td></td> <td>25300-054</td><td>Stok 4 &°C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>RNAlater - RNA stabilize edici reaktif</td><td>Qiagen</td><td>76104</td><td>RT Dispase'de saklayın</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4818-2MG</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 1.25 mg / ml. Stok -20 °C'de tutuldu; Sulandırma</td></tr><tr><td>için C BSA</td><td>Milipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/item/81-068-3">81-068</a></td><td>Sitokinlerin yeniden yapılandırılması için&nbsp; - stok -20 &°C'de tutulur; C</td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu (FCS)</td><td>Gibco</td><td>16141079</td><td>Stoku -20 °C'de tutuldu; C</td></tr><tr><td>60 kuyulu MicroWell tepsileri</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0815-100EA</td><td></td></tr><tr><td>4 oyuklu plakalar</td><td>Thermo Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>95 oyuklu plakalar F alt</td><td>Greiner Bio</td><td>6555180</td><td></td></tr><tr><td>Glas alt plakalar</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık cam mikropipetler</td><td>Blaubrand</td><td>708745</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobu</td><td></td><td></td><td>Hücre & # 174; görüntüleme istasyonu (motorlu, ters çevrilmiş Olympus IX81 standı), bir Hamamatsu ORCA ER B7W kamera ve Ludin Cube ve Box. ile donatılmıştır.
Leica DFC365 FX kamera ve AF6000 Expert/Matrix yazılım komut arayüzü ile donatılmış, Ludin Cube and Box ile çevrili Leica DMI6000 B standı.</td></tr><tr><td>Objektif</td><td></td><td></td><td>: Olympus, UPLAN, FL, NA, 0.30, hava 9.50 mm, 10X uzun mesafe; 
Leica HC PL FLUOTAR NA 0.30 hava 11.0 mm 10X uzun mesafe</td></tr></tbody></table>

dağınık fare embriyonik progenitörlerin gelen vitro pankreas organogeneziste

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

Pankreas, glukoz homeostazını düzenleyen ve sindirim enzimlerini salgılayan önemli bir organdır. Pankreas embriyogenezi üzerine yapılan araştırmalar, kök hücrelerden pankreas hücreleri üretmek için protokollerin geliştirilmesine yol açmıştır 1. Tüm embriyonik organ, gelişimin 2-4 birçok aşamasında kültürlenebilir. Bu kültür yöntemleri, ilaçları test etmek ve gelişimsel süreçleri görüntülemek için yararlı olmuştur. Bununla birlikte, organın genişlemesi çok sınırlıdır ve organ düzleştiği için morfogenez aslına uygun olarak özetlenemez. 
Ayrışmış fare embriyonik pankreas progenitörlerinin verimli bir şekilde genişlemesini sağlayan üç boyutlu (3B) kültür koşulları öneriyoruz. Kültür ortamının bileşimini manipüle ederek, ya başlangıç durumlarında genişleyen pankreas progenitörlerinden oluşan içi boş küreler ya da daha olgun genişleyen progenitörlere ilerleyen ve endokrin, asiner ve duktal hücrelere farklılaşan ve embriyonik pankreasa benzemek için kendiliğinden kendi kendini organize eden karmaşık organoidler üretmek mümkündür. 
Burada, in vitro sürecin doğal pankreas gelişiminin birçok yönünü özetlediğini gösteriyoruz. Bu kültür sistemi, hücrelerin başlangıçtaki karmaşıklığını birkaç progenitöre indirgeyerek bir organ oluşturmak için nasıl işbirliği yaptığını araştırmak için uygundur. Pankreasın 3 boyutlu mimarisini yeniden üreten ve bu nedenle epitel yapılarının polarizasyonu ve dallanma dahil olmak üzere morfogenezi incelemek için yararlı olan bir modeldir. Sertlik ve hücrenin gerginliği üzerindeki etkiler gibi nişin mekanik ipuçlarına verilen yanıtı değerlendirmek de uygundur.

3D Matrigel&#39;de ayrışmış ve seribaşı E10.5 dorsal pankreas atalarıdır pankreas gelişimini özetlemek. Atalarıdır en kolay floresan gazetecilere takip edilebilir. Bizim durumumuzda (Şekil 2) Neurog3 4 etkinleştirmeden tamoksifen yokluğunda ve böylece Pdx1 promoteri (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (Film 1) tarafından kontrol edilen bir nükleer GFP proteini eksprese eden transgenik bir fare kullanılmıştır. Organoid orta ile küçük hücre kümeleri ...

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Bu prosedürün genel amacı, ilişkili multipotent pankreas progenitörlerini, farklılaşabilecekleri ve kendi kendilerini organize edebilecekleri 3 boyutlu bir Matrigel iskelesinde genişletmektir. Bu işlem, öncelikle embriyonik gün 10,5 fare embriyolarından pankreasın izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise mezenşimin uzaklaştırılması ve epitelin tek hücrelere ve küçük kümelere ayrıştırılmasıdır.Son adım, hücreleri matrigel içinde süspande etmek ve genişleme için polimerize jeli inkübe etmektir. Bu süreç nihayetinde, canlı olarak veya deney sonunda mikroskopi ile görüntülenebilen, fare embriyonik pankreasını andıran, kendi kendine organize olan dallanmış pankreatik organoidlerin oluşumuna yol açar. Bu tekniğin, tüm pankreas eksplantasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, iyi tanımlanmış ve daha az karmaşık bir hücre popülasyonu ile başlanmasıdır.Pankreatik progenitörler, 3D hücre kültürlerinde 2D kültürlere göre daha iyi korunur. Bu yöntem, hücre-hücre etkileşimi veya hücrenin matriks ile etkileşimi gibi alandaki bazı kritik sorulara yanıt bulmamıza yardımcı olabilir. Bu durum, nihayetinde polarizasyonun nasıl ortaya çıktığının ve dolayısıyla hücre çeşitliliğinin

in-vitro-pancreas-organogenesis-from-dispersed-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Pankreas gibi atalarıdır insülin ifade koloniler içine ayırt etmek için izin veren üç boyutlu clonogenic tahlil açıklanmıştır. Bu yöntem, metilselüloz, Matrigel ve büyüme faktörleri içeren yarı-katı medya yararlanır, tek atalarıdır çoğalırlar ve...

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

Çalışmada insan embriyonik kök hücreleri pankreas farklılaşma uyarması yönlendirilmiş bir farklılaşma yaklaşım anlatılmaktadır. Büyük önem insülin salgılayan hücrelerin içine pankreas ataları edilen insan embriyonik kök hücre bulma olduğu endotel hücre ko-kültür aracılık olgunlasmasi.

İnsan Embriyonik endotel hücre Co-kültür aracılık Olgunlaşma Bir Yönetmen Farklılaşma Yaklaşım Pankreas insülin üreten hücreler için Kök Hücre

Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir...

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

Izole etmek için bir protokol, insan fetal pankreas hücrelerden türetilen kültür ve görüntü adacık hücre kümeleri (SKK) tarif edilmektedir. Yöntem, doku kültür mono-tabaka olarak veya agrega olarak süspansiyon halinde ve proliferasyon belirteçler ve pankreatik hücre hayati kararlar için resimdeki ÜAK'lerin oluşturmak için gerekli adımları göstermektedir.

İnsan Fetal Pankreas Hücre Kümeleri İzolasyon, Kültür ve Görüntüleme

Kendini yenileme ve erişkin fare pankreas izole progenitör hücrelerin farklılaşmasını tespit etmek için in vitro koloni deneylerde icat edilir. Bu analizlerde, pankreas ataları metilselüloz içeren yan-katı bir ortam içinde 3-boyutlu bir uzayda hücre kolonileri yol açar. tek hücreler ve bireysel koloniler karakterizasyonu taşıma protokolleri açıklanmıştır.

In Vitro Colony Tahliller Tri-güçlü Progenitör Hücreleri karakterize Yetişkin Fare Pankreas İzole

Burada, serbest dalgalı e10.5 ayrışmış pankreas ataları ve ilişkili Mezenşim 3D fare pancreatoids ifade insülin üretmek için bir iletişim kuralı mevcut.

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

Burada, pankreas/oniki parmak bağırsağı homeobox protein 1+ insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) ayırt etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı mevcut (PDX1+) hücreleri pankreas soy nesil için alan koloni sigara türü monolayer büyüme üzerinde tek hücre ayrışmış. Bu yöntem homojen hPSC elde edilen hücreleri, genetik manipülasyon üreten ve eleme için uygundur.

Verimli üretimi, pankreas/oniki parmak bağırsağı Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/pankreas ataları hPSCs yapışma kültürlerde üzerinden

Bu protokol, insan diş pulpası kök hücrelerini (hDC'ler) pankreas soylarına in vitroolarak ayırt etmek için iki farklı indüksiyon protokolü arasında bir karşılaştırma sunar: bütünleştirici protokol ve bütünleştirici olmayan protokol. Bütünleştirici protokol daha fazla insülin üreten hücre (IPC) üretir.

Tüp bebek pankreas soylarına doğru İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin İndüksiyonu

Mevcut protokol, düzlemsel tek katmanlı insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen pankreas progenitörlerinde PDX1 ve NKX6.1 transkripsiyon faktörlerinin birlikte ekspresyonunu arttırmak için geliştirilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Bu, taze matrisin yenilenmesi, hücre yoğunluğunun manipüle edilmesi ve endodermal hücrelerin ayrışmasıyla elde edilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinin 2D Kültür Sisteminde Pankreatik Beta Hücre Öncüllerine Farklılaşması

İnsan kök hücresinden türetilen pankreas kök hücresi adacıklarının immunodefisive farelere in vivo implantasyon ve sonraki analizler için kas içi nakli için minimal invaziv bir protokol sunuyoruz.

Farelerde İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilen Pankreas Endokrin Hücrelerinin Intramusküler Nakli

Öğrenin fare embriyonik pankreas progenitörlerini 3D Matrigel kültüründe genişletme ve dallanmış organoidlere farklılaştırma yöntemini. Bu teknik canlı görüntüleme ve fonksiyonel manipülasyon için gelişmiş bir model sunar.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

Daha fazla video keşfet