İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Bu prosedürün genel amacı, yüksek verimli dopaminerjik nöron farklılaşmasını indüklemektir. Laboratuvar ortamında. Bu, önce insan P pluripotent kök hücrelerinin tek hücreli bir adezyon kültürünün hazırlanmasıyla gerçekleştirilir.

İkinci adımda, hücre kültürü ortamı, taban plakası progenitörlerini indüklemek için nöron indüksiyon ortamına geçirilir. Daha sonra, dopaminerjik nöronlar olgunlaşma ortamında kültürlenir. Ve son olarak, tek hücreli dopaminerjik nöron progenitörleri, poli L ornitin laminat fibronektin plakaları ve olgunlaşma ortamı üzerinde 30 gün boyunca kültürlenir.

Sonuç olarak, immünofloresan mikroskobu, önemli dopaminerjik nöron belirteçlerinin ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik, nöro asit protokolünde mevcut nöro küreye göre daha büyük bir avantaja sahiptir. Daha yüksek verimlilikle daha homojen çift nöral popülasyon oluşturabilir.

Geçişten dört gün sonra, ortamı hücre kültürlerinden aspire edin. Hücreleri oyuk başına bir mililitre Accutane ile ayırın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçka sırasında, altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir mililitre jelatin ekleyin ve ardından plakayı taze hazırlanmış matri jel kaplı plakalarla birlikte inkübatöre yerleştirin.

Hücreler yarı yüzer hale geldiğinde, tek bir hücre süspansiyonu yapmak için onları birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe çekin ve üç dakika santrifüjleyin. 258 Gs ve oda sıcaklığında, peleti serumla takviye edilmiş uygun miktarda insan pluripotent kök hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve iki milimolar nihai konsantrasyona thi vivin ekleyin.

Daha sonra, jelatin kaplı plakalardaki hücreleri 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede bire bir oranında inkübe edin. Metamfetamin besleyicileri çıkarmak için hücreleri 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Bunları, serum ile takviye edilmiş insan pluripotent kök hücre ortamında seyreltin ve hücreleri tekrar döndürdükten sonra sayın, hücreleri mililitre konsantrasyonda 180.000 hücreye kadar thias Ivan ile MT.SR bir ortamda yeniden askıya alın.

Daha sonra matrijeli kaplanmış plakalardan aspire edin ve oyuk başına iki mililitre hücre dağıtın. 48 saat. Hücreleri matrigel plakalarına yeniden kapladıktan sonra.

Ortamı her bir oyuktan aspire edin ve hücreleri bir kez PBS ile yıkayın. Daha sonra, SB 4 31, 50 42 ve L DN 1 9 3 1 8 9 ile takviye edilmiş iki mililitre KSR farklılaşması ekleyin, 20. gündeki tabloda belirtildiği gibi ortamı her gün D sıfırdan D 20'ye değiştiren hücrelere, farklılaşma ortamını aspire edin ve hücreleri beş dakika boyunca 37 santigrat derecede oyuk başına bir mililitre 37 santigrat derece acutus ile ayırın. Kuluçka sırasında, inkübatörde poli L orin laminin fibronektin plakalarını ısıtın.

Daha sonra Resus'tan sonra, ayrılan hücreleri tek bir hücre süspansiyonuna süspanse ederek, hücreleri nöro bazal ortamda seyreltin. Saydıktan sonra, hücreleri döndürün ve peleti mililitre konsantrasyonunda 1 milyon hücre olan farklılaşma ortamı olan B 27'de yeniden süspanse edin. Daha sonra fibronektini poliol orin laminin fibronektin plakalarından aspire edin.

Bunları PBS ile iki kez yıkayın ve her birine 400 mikrolitre hücre aktarın. Son olarak, ilk 24 saatten sonra ortamı değiştirin ve daha sonra, bağlanmamış ölü hücreleri çıkarmak için deneysel son noktaya kadar her gün bir değiştirin. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, yeniden kaplanmış tek hücreli insan pluripotent kök hücre kültürleri, farklılaşmanın ilk 48 saati boyunca kümeler halinde genişleyecek ve yaklaşık% 70'e ulaşacaktır.

Farklılaşmadan sonra, hücreler üç ila dört gün gibi kısa bir sürede tam birleşme elde eder. 20. günde, farklılaşmış hücreler küçük kümeler halinde bağlanır ve büyür. Sonraki beş gün boyunca, kümeler içinde çok daha yoğun ve morfolojik olarak bozulmamış aksonlar ve nöritler ortaya çıkar ve kümeler arasında bazı bağlantılar oluşturur.

11 günlük farklılaşmadan sonra, insan pluripotent kök hücreleri verimli bir şekilde zemin plakası öncülerine dönüştürülebilir. Bu görüntülerde gösterildiği gibi, hücrelerin hemen hemen tamamı zemin plakası öncüsünü ifade eder, hücre belirteçleri iç içe geçer ve tilki A iki ve üzerindedir. Hücrelerin% 90'ı Corin O OTX iki ve LM X bir A'yı eksprese eder.Daha fazla farklılaşmadan sonra, taban plakası öncü hücreleri, TUJ bir ve TH'yi eksprese eden dopaminerjik nöronlarda uzmanlaşır. Bu dopaminerjik nöronlar, GK ikiyi eksprese ettikleri ve kalbindin için negatif oldukları için dokuz özdeşliğe sahiptir İmmüno boyama deneyleri ayrıca GFAP astrositlerinin olmadığını ve çok az GABAerjik nöron olduğunu gösterir, bu da farklılaşmanın yalnızca dopaminerjik nöron soyuna özgü olduğunu gösterir.

Bu prosedürü test ederken, günlük hücre kültüründe tutarlılığı korumak ve ortamın doğru malzemelerle taze olarak hazırlandığından emin olmak önemlidir.