Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilaç tedavisinin BE hücrelerinde hücre yapısı ve protein lokalizasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu, cam örtü kızakları üzerine büyütülen BE hücrelerinin standart hücre kültürü koşullarında seçilen bir ilaçla inkübe edilmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, tedavi edilen be hücrelerini, protein yapısını ve lokalizasyonunu koruyan bir fiksatif ile inkübe edin.

Daha sonra, sabit be hücreleri, seçilen hedef proteindeki değişiklikleri floresan mikroskobu ile görselleştirmek için birincil ve floresan olarak işaretlenmiş ikincil antikorlarla sırayla inkübe edilir, bu da hücrelerinin ilaç tedavisinin immünofloresan boyamanın görüntülenmesine dayalı olarak protein lokalizasyonunu ve hücre yapısını nasıl değiştirdiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem Barrett özofagusu hakkında bilgi sağlayabilse de, kanser ve normal hücreler dahil olmak üzere diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu işleme 18 milimetrelik lamel kapakları bir cam Petri kabına yerleştirerek başlayın ve otoklavlayın.

Daha sonra otoklav kapak fişlerini bir vakum tüpüne bağlı steril bir cam pipet kullanarak 12 oyuklu bir doku kültürü kabına aktarın. Bu yıkamadan sonra, kapak steril PBS ve ortam ile kayar. Sonraki tripsin.

Ölümsüzleştirilmiş hücreler, otomatik bir hücre sayacı veya bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayar, daha sonra kültür ortamındaki hücreleri mililitre başına 20.000 ila 40.000 hücre konsantrasyonuna seyreltir. Ardından, bir kapak fişi içeren her bir oyuğa bir mililitre hücre yerleştirin. Kuyucuk başına toplam 20.000 ila 40.000 hücre sayısı için, hücrelerin kapak kızağına yapışmasını sağlamak için kapak kızağını kuyunun dibine hafifçe itmek için steril bir pipet ucu kullanın.

BE hücrelerini tedavi etmek için, seçilen ilacı, tüpü tekrar tekrar ters çevirerek veya bir girdap karıştırıcı kullanarak istenen konsantrasyon karışımına 37 santigrat derece Ortamda seyreltin. Hücrenin kapağa bağlanmasına izin vermek için BE hücrelerinin ilk oturmasından 24 saat sonra tedaviye başlayın Karşılaştırma ve kontrol arasında ayrım yapmak için önceden etiketlenmiş ilaç ve araçla tedavi edilmiş numune plakalarını bir laboratuvar kalemi ile kaydırın. Kültür ortamında seyreltilmiş %0.1 araç ile ek bir örtü kayması uygulayın.

Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit ve% 98 nemde bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Şimdi, ilaç tedavisinin istenen inkübasyon süresinden sonra, ortamı aspire edin ve kapak fişlerini oda sıcaklığında bir XPBS ile hızlı bir şekilde yıkayın. Daha sonra PBS'yi aspire edin ve her bir oyuğa% 4 PFA içeren bir mililitre PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Ardından, %4'lük P-F-A-P-B-S'yi aspire edin Kapak fişlerini oda sıcaklığında PBS ile her seferinde üç kez beş dakika yıkayın. Kapak fişlerini bir hafta boyunca PBS'de ve istenirse dört santigrat derecede %0.1 PFA'da saklayın. Antikorun hücre içi hedeflere erişmesine izin vermek için sabit PFA hücrelerini geçirgen gözlere maruz bırakın, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde seyreltilmiş 50 milimolar amonyum klorür ile inkübe edin.

Daha sonra oda sıcaklığında PBS ile bir kez beş dakika yıkayın. Bu, antikorların hücresel proteinlere spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için arka planı azaltacaktır. BE hücrelerini% 0.1 troponin ve% 0.5 BSA içeren 100 ila 300 mikrolitre PBS'de 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, haznenin altını ıslak kağıt havlularla kaplayarak ve üstüne bir kat parfüm koyarak kare bir biyotahlil kabı hazırlayın. Kapak fişlerini belirlemek için Parfümü bir laboratuvar kalemiyle işaretleyin. Kapak kayma hücrelerini yukarı bakacak şekilde forseps ve bir şırınga iğnesi kullanarak nazikçe param üzerine aktarın.

Şimdi, hem %0.5 BSA hem de %0.1 saponin içeren PBS'deki birincil antikoru seyreltin, bloke edici çözeltiyi nazikçe kurulayın. Bir laboratuvar dokusu kullanarak, 100 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin ve be hücrelerini gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün.

Slaytları oda sıcaklığında her seferinde beş dakika boyunca %0,5 BSA ve %0,1 troponin içeren PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, %0.5 BSA ve %0.1 ponent içeren PBS'de bir floresan etiketi ile konjuge edilmiş ikincil antikoru seyreltin. Her bir örtü kaymasına 100 mikrolitre seyreltilmiş antikor ekleyin ve hücreleri iki saat sonra oda sıcaklığında iki saat inkübe edin.

Kapak fişlerini her seferinde %0,5 BSA ve %0,1 troponin içeren PBS'de üç kez beş dakika yıkayın. Yıkama tamponunu çıkarın ve kapak fişlerine 100 ila 300 mikrolitre PBS ekleyin. Kapak kayışını forseps ile nazikçe kaldırın ve bir laboratuvar mendili veya kağıt havlu kullanarak PBS'yi kurulayın.

Ardından, kapak kızağına DPI içeren uygun bir Antifa montaj ortamından 15 mikrolitre ekleyin. Ters çevrilmiş kapak kızağını, hücreler aşağı bakacak şekilde bir cam mikroskop lamına yerleştirin. Ardından, slaytları bir slayt klasörüne yerleştirin ve Antifa ortamının kürlenmesini sağlamak için gece boyunca oda sıcaklığında doğrudan ışıktan uzak tutun.

Antifa ortamı ayarlandıktan sonra, slaytlar mikroskobik görselleştirmeye kadar dört santigrat derece veya eksi 20 santigrat derecede saklanabilir. Bu adımda, saklama slaytlarını eksi 20 santigrat derece veya dört santigrat dereceden çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmalarına izin verin. Mikroskobu ve cıva ark lambasını açın.

Kapak lamı objektife bakacak şekilde bir mikroskop lamını mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, DAPI filtresini seçin ve deklanşörü açın. Görüntü görünene kadar göz parçalarından bakarken objektife odaklanın.

Tüm hücreler dpi ile boyandığı için çekirdekler kolayca gözlemlenmelidir. Uygun görüntü işleme yazılımını kullanarak görüntüleri toplayın, bu şekilde CPC ve CPD ile kapak fişleri araç veya SRC inhibitörünün bir mikromolar kısmı ile tedavi edildi. SKI 6 0 6 24 saat boyunca hücreler daha sonra sabitlendi ve boyandı.

Tarif edilen protokole göre, yeşil ile gösterilen beta katenin, spesifik bir antikor ve LOR 4 88'e bağlı ikincil bir antikor kullanılarak görselleştirilirken, çekirdek mavi ile gösterilen DPI ile boyandı. Beta-kateninin çekirdekten hücre zarına olan konumundaki değişime dikkat edin. SKI 6 0 6 ile tedaviyi takiben.

Bu videoyu izledikten sonra, protein lokalizasyonunu veya hücre yapısını araştırmak için Barrett özofagusunu immünofloresan olarak nasıl boyayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.