Name: Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Öğrenin, Barrett ösofagus hücrelerinde ilaç tedavisinin protein lokalizasyonu ve hücre yapısı üzerindeki etkilerini immünofloresan boyama ile değerlendirmeyi. Bu yöntem kanser araştırmalarına da uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma St Joseph&#39;in Vakfı (AJF, Lji) ve Amerikan Akciğer Derneği, RG-224607-N (Lji) hibe tarafından desteklenmiştir.

1.. Hücre Hattı Bakım <ol><li> Ölümsüzleştirilmiş insan transkriptaz (TERT) proteini 11 ters İnsan telomeraz kararlı transfeksiyonu ile yüksek dereceli displazi (CP-B, CP-C, CP-D) ve metaplastik (CP-A) hücre çizgileri BE. </li><li> Bakım hücre sığır hipofiz özütü (BPE), epidermal büyüme faktörü (EGF),% 5 fetal sığır serumu (FBS), esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), penisilin-streptomisin-neomycin (PSN) ile takviye edilmiş ortam içinde keratinosit hatları, standart BE Doku kültürü koşulları (37 ° C,% 5 CO2,% 98 nem). </li></ol> 2.. Hücre Kaplama BE <ol><li> 12 çukurlu levha / lamelleri hazırlanması. Cam bir Petri tabağına ve otoklav içine 18 mm lamelleri yerleştirin. Transfer vakum tüpüne bağlanmış bir steril cam pipet kullanılarak 12 çukurlu doku kültürü kabına 18 mm cam lamelleri otoklavda muamele edildi. Steril PBS ve medya ile lamel yıkayın. </li><li> Trypsinize ve ölümsüzleştirdi BE hücreleri saymak. Hücreleri USI saymak, otomatik bir hücre sayacı ya da bir hemasitometre ng. 20,000-40,000 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar kültür ortamı hücreleri seyreltin. </li><li> Her bir 20,000-40,000 hücre / kuyu olmak üzere toplam hücre sayımı için bir lamel içeren içine hücre 1 ml yerleştirin. </li><li> Yavaşça hücreler lamel takmak sağlamak için kuyunun dibine lamel itmek için steril bir pipet kullanın. </li></ol> BE Hücreler 3. İlaç Tedavisi <ol><li> Istenen konsantrasyona ılık (37 ° C) ortam maddesi içinde seçilmiş ilaç seyreltin ve tekrar tekrar tüp tersine çevrilmesi ya da bir girdap şeklinde karıştırıcı kullanılarak iyice karıştırın. Ampirik olarak belirlenir ilaç konsantrasyonları. Lamel üzerine hücre bağlanmasına olanak sağlamak üzere, BE hücrelerin ilk tohumlama aşağıdaki tedavi 24 saat başlayın </li><li> Karşılaştırma ve kontrolü için, kültür ortamı içinde seyreltilmiş,% 0.1 araç (dimetil sülfoksit [DMSO] veya bileşik madde çözündürülmesi için kullanılır) ile BE hücrelerinin ek bir lamel tedavi. Ilacı tanımlamak ve A.Ş. için bir laboratuar kalem ile etiket plakasıbulunulması örnekleri tedavi. 37 ° C,% 5 CO2,% 98 neme ayarlanmış bir hücre kültür inkübatörü içine koyun hücreleri ve istenen zaman noktaları için inkübe edilir. </li></ol> 4. Immunofluorescent Boyama <ol><li> Tespit <ol><li> İlaç tedavisinin İstenilen kuluçka süresinden sonra, ortam aspire ve oda sıcaklığında (RT, 25 ° C) &#39;de 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile hızlı bir şekilde lamelleri yıkayın. </li><li> PBS aspire ve her kuyuya% 4 PFA [% 4 PFA / PBS] ihtiva eden 1 ml PBS ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> % 4 PFA / PBS aspire ve oda sıcaklığında PBS ile lamelleri 3 kez, her biri 5 dakika yıkayın. Arzu edildiği takdirde, 4 ° C &#39;de PBS/0.1% PFA bir hafta deposu lamelleri. </li></ol></li><li> Permeabilization / Engelleme Antikor, hücre içi hedefleri erişmesine izin vermek için sabit PFA permeabilize hücrelerin. Dışı proteinleri yüzüne için, 1x PBS/0.5% BSA çözeltisi ilave saponin olmadan sonraki tüm adımları uygulayın. <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde seyreltilmiş 50 mM NH4CI ile inkübe edilerek arka plan azaltmak ve 5 dakika için bir kere RT PBS ile yıkayın. </li><li> % 0.1 saponin ve% 0.5 sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden PBS içinde, 100-300 ul içinde 30 dakika boyunca BE hücreleri inkübe edin. , Filtre ile sterilize edilmiş% 10 stok saponin seyreltik su içinde hazırlanır ve 4 ° C&#39;de saklandı </li></ol> Not: Bu,% 0.5 BSA ilave nedeniyle lamelleri engelleyerek hücre proteinlere antikorların spesifik olmayan bağlanma önler. Seçenek olarak ise, antikor spesifik olmayan bağlanmaların azaltmak için% 5 oranında seyreltilmiş keçi serumu ile BSA yerine. </li><li> İnsan Odası hazırlanması <ol><li> Islak kağıt havlu ile odasının alt katman tarafından bir kare biyodeney tabak hazırlayın ve üstüne Parafilm bir katman yer. </li><li> Yavaşça forseps ve bir şırınga iğnesi kullanarak Parafilm üzerine yukarı bakacak lamelleri, hücreleri aktarmak. </li><li> Lamelleri belirlemek için bir laboratuvar kalem ile Parafilm işaretleyin. </li></ol></li><li>Primer antikor inkübasyon <ol><li> % 0.5 BSA ve% 0.1 saponin her ikisini ihtiva eden PBS birincil antikor seyreltin. </li><li> Hafifçe laboratuvar doku ile bloke solüsyonu kapalı leke ve primer antikor çözeltisi 100 ul ilave edin. 4 ° C de bir gece BE hücreleri üzerinde birincil antikor inkübe </li></ol></li><li> İkincil antikor Kuluçka <ol><li> Slaytlar, oda sıcaklığında 5 dakika her biri için PBS/0.5% BSA/0.1% saponin ile 3x yıkayın. </li><li> İkincil antikor, birinci antikor, yükseltilmiş edildiği türlerin tanıdığı PBS/0.5% BSA/0.1% saponin bir floresan etiket ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile seyreltilir. </li><li> Her bir lamel seyreltilmiş antikor, 100 ul ekleyin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikincil antikor inkübe edin. </li></ol></li><li> Yıkama ve Lameller arasında montajı <ol><li> PBS/0.5% BSA/0.1% saponin içinde lamelleri 3 kez, her biri 5 dakika yıkanır. Yıkama tamponu çıkarın ve lamelleri PBS 100-300 ul ekleyin. NOT: Çift karşıtı İçinVücut boyama, tekrar tartışmada belirtilen bilgilere göre istenen ek primer ve sekonder antikor ile 4,4-4,5 adımları tekrarlayın. </li><li> Forseps kullanarak, hafifçe lamel yukarı kaldırın ve bir laboratuvar doku veya kağıt havlu kullanarak PBS kapalı kurulayın. </li><li> Bir cam mikroskop lamı üzerine, hücreler aşağı lamel 4 içeren uygun bir anti-solmaya montaj medya &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 15 ul ekleyin ve lamel ters. </li><li> Bir slayt klasörünün içine slaytlar yerleştirin ve sert ayarlanmış anti-solmaya orta tedavisi için izin oda sıcaklığında gece boyunca direkt ışıktan kuluçkaya, üreticinin talimatlarına göre. , Anti-solma ve orta set edildikten sonra, mikroskopik slaytlar kadar 4 ° C ya da -20 ° C ya da saklanabilir. </li></ol></li></ol> Lameller 5. Mikroskobik Görselleştirme Lekeli hücreler konfokal mikroskopi veya ikisinden biri aracılığıyla görüntülü olabilir EĞER yetenekli dik mikroskope. Konfokal mikroskopi ayrık derinliklerde yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlar rağmen, dik bir mikroskobik hızlı kullanışlı görüntü üretme yeteneğine sahiptir. Kısaca ifade etmek için, bir görüntüleme yöntemi standart sundu mikroskobu kullanılarak hücreler boyandı. Genel olarak, görüntü flöresin izotiyosiyanat (FITC) veya benzeri bir florofor (yani, yeşil floresan protein) için, Texas Red ve DAPI, bu florofor ayırt edebilen filtresi olan bir mikroskop gerektirir. Uyumlu florosforlar belirlemek için protokol başlamadan önce mikroskop edin. <ol><li> Standart IF Mikroskop üzerinde görüntüleme <ol><li> -20 ° C ya da 4 ° C&#39;de saklanan slaytlar / lamelleri çıkarın ve oda sıcaklığına ısınmaya bırakın. Mikroskop ve cıva ark lambası güç. </li><li> Lamel mikroskop sahneye amaca dönük ile mikroskop lamı yerleştirin. Bir yağ batırma objektifi kullanımıyla ilgili olarak, bir örtücü camın üzerine immersiyon bir damla ekleyin. </li><li> DAPI filtreyi seçin ve kapağını açın. </li&gt; <li> Görüntü görünene kadar okülerler bakarken hedefi odaklanın. Bütün hücreler DAPI ile leke olacaktır yana, çekirdekleri kolayca gözlemlenebilir olmalıdır. </li><li> Ilgili görüntü işleme yazılımı kullanarak görüntüleri toplayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrett%27s+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma%3A+time+for+a+new+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li>
<li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Barrett%27s+esophagus+in+the+US%3A+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li>
<li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex%2C+stage%2C+and+age%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).</li>
<li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Barret%27s+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin%3A+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett%27s+adenocarcinoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase%2C+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett%27s+esophagus+cell+lines%3A+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Thoracic+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li>
<li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic%2C+Barrett%27s+cell+line+%28BAR-T%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Esophagus%22%5BJournal%5D)">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li>
<li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461(2011).</li>
<li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+benign+Barrett%27s+epithelial+cells%2C+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li>
<li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+lifespan+of+Barrett%27s+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit%3A+a+useful+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li>
<li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett%27s+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li>
<li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60%28c-Src%29-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+%CE%B2-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li>
<li>Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin%2FCatenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li>
<li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li>
<li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li>
<li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Biz, bu hücreler üzerine hedefleyen terapilerin fizyolojik etkilerini açıklık karşı BE IF hücrelerin uygulanması için bir yöntemi ana hatlarıyla. Biz BE hücrelere karşı bu işlemlerin kullanılmasını tarif etmiş bulunmakla birlikte, bu metodlar da farklı hücre tipleri 13,17,18 çeşitli için geçerli olduğunu bulduk. Bundan başka, bu işlemler, belirli hedefler için lekeleme optimize etmek için çeşitli yollarla değiştirilebilir. Biz uygun IF üzerine doğrudan bir etkisi vardır bir parame...

Barrett yemek borusu (BE) özofagus yassı epitel, normal ve gastroözofageal reflü hastalığı (GERD) 1 kaynaklanan mide içeriklerine kronik maruz kalmanın bir sonucu olarak bir metaplastik değişimdir. BE GÖRH karşılık olarak bir koruyucu mekanizma olduğu düşünülmektedir, bununla birlikte BE varlığı özofagus adenokarsinomu (EAC), belirgin bir şekilde düşük hayatta kalma 1 taşıyan bir hastalığın artan riski verir. Şu anki tahminler Amerikan nüfusunun kadar 5.6% BE olduğunu göstermektedir BE genellikle asemptomatik olduğu gibi, ancak BE çoğunluğu 2 tanı konulmamış düşünülmektedir. GÖRH ve EAC hem de görülme oranları sürekli büyüme 3 Görüldüğü gibi, bu bilgilerin potansiyel EAC BE ilerlemesini önlemeye yönelik tedavi yaklaşımları sağlayabilir özellikle, EAC BE ilerlemesinde rol oynayan moleküler mekanizmaları anlamak için önemli bir hale gelmiştir. 1 mevcut paradigması ile sonuçlanmıştır. Kronik inflamasyon, yaralanma ve mide içeriğinin uzun süre maruz kalma sonucu genotoksik hasar EAC neoplastik ilerlemesini teşvik BE lezyon seçici baskı. Genetik değişikliklerin bir dizi sırasında EAC ilerlemesi ile, BE tespit edilmiştir. Ancak, buna rağmen hücre sinyal kesin değişiklikler ve hücre yapısı ve işlevi üzerine daha sonraki etkileri konusunda anlayış farklı olmaması. Özellikle hedeflenen terapötik bileşiklerin etkisini araştıran, hücre sinyal etkilerini incelemek için yararlı araçlar vitro hücre çizgileri bulunmaktadır ölümsüzleştirilmiş. Immortalized hücre çizgilerinin son ticari durumuna bu gibi çalışmalar için izin verir. Gibi yaygın olarak kullanılan canlılığı tahlilleri gibi yüksek verimlilik gösteren deneyler, hücre çoğalması ve su üzerine hedefli tedavilerin etkisini değerlendirmek değerli olmasına rağmenrvival 4-6, bu deneyler, hücre morfolojisi üzerine hücre sinyal etkilerinin araştırılması için yararlı değildir. Immünofloresan boyama (IF) hücrelerin morfolojik, büyüme ve hayatta kalma özellikleri ve söz konusu proteinler üzerine hedefli tedavilerin etkilerinin araştırılması için bir yararlı bir tekniktir. Bizim laboratuvar ilaç tedavisi 7 için olası bir kemopreventif tedavi ve biyogöstergesini çizen umuduyla BE hücre hatları üzerine bir klinik mevcut ilacın etkilerini değerlendirmek için EĞER kullanarak, ölümsüzleştirdi BE hücre hatlarına doğru bu yöntemleri benimsemiştir. Benzer şekilde, EAC bu tekniklerin uygulanması, BE ve ölümsüzleştirdi özofagus hücre hatları EAC ilerlemesi 8-10 BE ile ilgili kritik bulgular tanımlamıştır. Hedeflenmiş tedaviler ile tedavi edilebilir hücrelerin analizi hücre yapısı ve protein yerelleştirme değişiklikleri karakterizasyonu için izin değeri vardır IF buluruz. Burada, bizim yöntemler sunmak IF c ölümsüzleştirilmemiş BE hücrelerinilaç tedavisi haracterize.

<table><tbody><tr><td>CP-A (Metaplastik Hücre Hattı)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4027</td><td></td></tr><tr><td>CP-B (Yüksek Dereceli Displastik Hücre Hattı)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4028</td><td></td></tr><tr><td>CP-C (Yüksek Dereceli Displastik Hücre Hattı)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4029</td><td></td></tr><tr><td>CP-D (Yüksek Dereceli Displastik Hücre Hattı)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4030</td><td></td></tr><tr><td>Keratinosit-SFM (1x), Sıvı Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>% 0.25 Tripsin-EDTA (1x), Fenol Kırmızı&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Nitelikli, HI</td><td>Life Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>PSN antibiyotik karışımı</td><td>Life Technologies</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>PBS - Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>DAPI ile Pro-long Altın Antifade Reaktifi&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Dairesel Cam Lamel 18 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-183-86</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-katenin Birincil Antikor (Tavşan)</td><td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>9562S</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (Keçi Anti-Tavşan)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>10 cm TC ile işlenmiş PS kabı, steril</td><td>ABD Bilimsel</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu TC ile muamele edilmiş PS plakası, steril</td><td>USA Scientific</td><td>5666-5180</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini - Fraksiyon V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>SKI-606 (Bosutinib)</td> <td>Selleck Chemicals</td><td>S1014</td><td></td></tr><tr><td>Kare Biyotahlil Kabı</td><td>Thermo Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>82024-546</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kullanımlık Pastör Pipetleri, Çakmaktaşı Cam</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Nexcelom Mini Hücre Sayacı</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellometre Sayma Odaları</td><td>Nexcelom</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Apotome mikroskobu&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

barrett Özofagus hücrelerinin karakterizasyonu için bir immunofluorescent yöntemi

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

Özofagus adenokarsinom (EAC) genel sağkalım az% 17 oranı ve EAC sıklığı son iki yılda önemli ölçüde arttı vardır. EAC primer risk faktörlerinin biri Barrett yemek borusu (BE), kronik mide ekşimesi tepki olarak normal yemek borusunun skuamoz bir metaplastik değişimdir. EAC arasındaki köklü bağlantı rağmen, moleküler olayların ilerlemesini içeren özellikle değiştirilmiş sinyal yollarının sorgulama EAC anlaşılamamıştır BE. Bu büyük ölçüde bu hastalıkların incelemek için uygun in vitro modellerde uygun eksikliğinden kaynaklanmaktadır. Son zamanlarda, BE ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri BE arasında, in vitro çalışmalar için izin ticari olarak temin edilebilir hale gelmiştir. Burada, tedavi edici bileşiklere maruz kaldıktan sonra hücre sinyal ve yapısının in vitro karakterizasyonu sağlayan, BE ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinin immünofloresan boyama için bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniklerin uygulanması hel doyurmayap EAC ilerlemesine BE katılan mekanizmalar içgörü geliştirmek ve tedavi ve EAC önlenmesi için potansiyel yollar sağlamaktadır.

Tarif edilen prosedürlerin uygulanması ile elde edilen sonuçların bir örneği, Şekil 1A-D &#39;de gösterilmiştir. CP-D ve CP-C BE hücreleri ile Lameller Src ailesi inhibitörü, SKI-606, ya da araç (DMSO) içinde 1 uM ile 24 saat boyunca muamele edilir ve protein, β sinyal adherens Kavşak ve Wnt için yukarıda belirtilen prosedürler kullanılarak boyandı P-katenin. Hücre çekirdeğinin etiketleme DAPI (mavi) ile etiketleme ile gerçekleştirilir ise β-katenin görselleştirilmesi, yeşil bir flüorofor bağlanmış bir ...

Barrett Özofagus moleküler sürücüleri geliştirilmiş bilgi için fark edilebilir bir ihtiyaç vardır. Immunofluorescent boyama hücre morfolojisi üzerine hücre sinyal etkilerini anlamak için yararlı bir tekniktir. Biz, Barrett yemek borusu hücrelerinde terapötik tedavi değerlendirmek için immünofloresan boyama kullanımı için basit ve etkin bir protokol sunmaktır.

Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ilaç tedavisinin BE hücrelerindeki hücre yapısı ve protein lokalizasyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmektir. Bu işlem, cam lameller üzerinde büyütülen BE hücrelerinin, standart hücre kültürü koşullarında seçilen bir ilaç ile inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım olarak, işlem görmüş be hücreleri, protein yapısını ve lokalizasyonunu koruyan bir fiksatif ile inkübe edilir.Ardından, seçilen hedef proteindeki değişiklikleri floresan mikroskobu ile görüntülemek amacıyla, fikse edilmiş BE hücreleri sırasıyla primer ve floresan işaretli sekonder antikorlarla inkübe edilir; immunofloresan boyamanın görselleştirilmesine dayanarak, ilaç uygulamasının BE hücrelerindeki protein lokalizasyonunu ve hücre yapısını nasıl değiştirdiğini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem Barrett özofagusu hakkında bilgi sağlayabilse de, kanserli ve normal hücreler dahil olmak üzere diğer sistemlere de uygulanabilir. Bu prosedüre, 18 mm'lik lamelleri cam bir Petri kabına yerleştirip otoklavlayarak başlayın.Ardından, otoklavlanmış lamelleri vakum tüpüne bağlı steril bir cam pipet kullanarak 12 kuyucuklu bir doku kültürü plağına aktarın. Bundan sonra lamelleri steri

an-immunofluorescent-method-for-characterization-barretts-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kolorektal kanser (CRC) uygulanabilir tek bir hücre üretmek için, daha sonra yüzey antijenleri (DotScan ÇHS mikroarray) tanıyan özelleştirilmiş antikor mikrodizinlerinde yakalanır ayrıştırılmasıyla için bir prosedür nitelendirdi. Mikroarray bağlı hücrelerin alt popülasyonlarda floresan boya ile monoklonal antikorlar kullanılarak floresans çoklama profilli olabilir.

Kolorektal Kanser Hücre Yüzey Protein Profil Antikor Mikroarray ve Floresans Multiplexing

Bu video, serbest yüzen fare jejunum kriyokesitlerinde bağırsak tutam hücrelerini görselleştirmek için immünofloresan tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bağırsak villusları içinde, luminal uçta yeşil floresansın genişletilmiş bir kırmızı kökçük kütlesi ile birlikte lokalizasyonu, tutam hücrelerinin varlığını gösterir.

Jejunum Kriyoseksiyonlarında Tutam Hücrelerini Görselleştirmek için İmmünofloresan Tabanlı Bir Yöntem

Kaynak: Ear, P. H., et. al. İnce Bağırsak Nöroendokrin Tümör Sferoidlerinin Kurulması ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ince bağırsak nöroendokrin tümör sferoidlerinin immünofloresan boyamasını göstermektedir. Sferoidler sabitlenir, geçirgen hale getirilir ve bloke edilir ve daha sonra birincil ve ikincil antikorlarla inkübe edilir. Floresan mikroskobu altında monte edilmeden ve görüntülenmeden önce leke çekirdeklerine bir boya eklenir.

İnce Barsak Nöroendokrin Tümör Sferoidlerinin İmmünofloresan Kullanılarak Karakterizasyonu

Vital-boya geliştirilmiş floresan görüntüleme (VFI) glandüler morfolojisi vurgulamak ve distal özofagus neoplasia'nm (yüksek dereceli displazi ve kanser) belirginleştiren eksojen topikal floresan kontrast ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme epitel birleştiren vivo tekniğin bir roman.

Vital-boya Geliştirilmiş Floresan Imaging kullanılarak Barrett Özofagus içinde Neoplazi tanısı

Miyofibroblast fenotipine sahip murin ve insan özofagus stromal hücrelerinin primer kültürlerini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Kültürlenmiş hücreler iğ şeklinde morfolojiye sahiptir, α-SMA ve vimentin eksprese eder ve epitelyal, hematopoietik ve endotel hücre yüzey belirteçlerinden yoksundur. Karakterize edilmiş stromal hücreler, epitelyal-stromal etkileşimlerin fonksiyonel çalışmalarında kullanılabilir.

Fare ve İnsan Özofagus gelen miyofibroblastların izolasyonu

Bu yazının üretimi, karakterizasyonu ve normal birincil insan özofagus fibroblast ve de-cellularized domuz iskele içinde ekilmiş skuamöz epitel hücrelerinden hazırlanan bir dokuya işlenmiş 3D özofagus yapı potansiyel kullanımlarını açıklar. Sonuçlar normal insan yemek borusunda benzer olgun tabakalı epitel oluşumunu göstermektedir.

3D Doku mühendisliği İnsan Özofagus Mukozal Modeli Üretimi, Karakterizasyonu ve Potansiyel Kullanımları

Multiparametre floresan immünohistokimyası, tümör mikro ortamındaki bağışık hücre popülasyonlarının sayısını, göreceli dağılımını ve lokalizasyonunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu el yazması oropharyngeal kanserdeki T hücresi alt popülasyonlarını analiz etmek için bu tekniği tanımlamaktadır.

Arşiv Formalin Sabitlenmiş, Parafin Gömülü İnsan Orofaringeal Skuamöz Hücreli Karsinoma Örneklerinde T-hücresi Subpopülasyonlarının Dört Renkli Floresan İmmunohistokimyası

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Organoid-fibroblast ko-kültürleri, in vivo kök hücre nişini incelemek için bir model sağlar. Burada, özofagus organoid-fibroblast ko-kültürleri için bir protokol tanımlanmıştır. Ek olarak, fibroblast-organoid etkileşimini görselleştirmek için tüm montaj görüntülemesi kullanılır.

Özofagus Fibroblastlarının Organoid Ko-Kültürler Kullanılarak Fonksiyonel Karakterizasyonu ve Görüntülenmesi

Bu protokol, tümör ilerlemesinin farklı aşamalarını temsil eden özofagus organoid modellerinin oluşturulmasını ve histolojik analizini açıklamaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların normalden kanserli dokulara geçiş sırasında hücresel morfoloji, mekansal organizasyon ve moleküler belirteç ekspresyon modellerindeki değişiklikleri incelemelerini sağlar.

Özofagus Organoidlerinin Kurulması ve Histolojik Analizi: Normal Dokulardan Kanserli Dokulara İlerlemenin Modellenmesi

Bu protokol, özofageal skuamoz hücreli karsinomlu (ESCC) hastadan kanser organoidlerini, karsinomla ilişkili fibroblastları (CAF'ler) ve tümör ilişkisiz fibroblastları (CF) aynı anda izole etme yöntemini tanımlar. Bu hasta eşleştirilmiş materyallerin kullanımı, hastalar arası değişkenlikten kaynaklanan sorunları önleyebilir ve ESCC araştırmaları için uygun bir deneysel platform sağlayabilir.

Aynı Özofagus Kanseri Hastasından Tümör Organoidlerinin, Karsinomla İlgili Fibroblastların ve Karşıt Fibroblastların Oluşturulması

Öğrenin, Barrett ösofagus hücrelerinde ilaç tedavisinin protein lokalizasyonu ve hücre yapısı üzerindeki etkilerini immünofloresan boyama ile değerlendirmeyi. Bu yöntem kanser araştırmalarına da uygulanabilir.

Barrett Özofagus Hücrelerinin Karakterizasyonu için bir Immunofluorescent Yöntemi

Daha fazla video keşfet