Sudan Viral Konsantrasyon için Küçük Bir Ses Prosedürü

Aşağıdaki deneyin genel amacı, başlangıçta virüs konsantrasyonlarını optimize etmek için tasarlanmış küçük ölçekli bir teknik kullanarak sudan virüs geri kazanımını optimize etmektir. Adenovirüsü sudan konsantre etmek için en iyi elektropozitif filtrenin cam selüloz filtre olduğu tespit edilmiştir. İkincil elüsyon için ise, adenovirüsü filtre yüzeylerinden elüe etmede celite ikincil konsantrasyon tekniğinin en iyisi olduğu kanıtlanmıştır. Ortaya çıkan bu teknik, test edilen tüm filtre ve elüsyon kombinasyonları arasında gözlemlenen en yüksek yüzde geri kazanım oranlarına dayanarak, musluk suyundan en fazla adenovirüsü geri kazanmaktadır.

Bu tekniğin büyük ölçekli hacim konsantrasyonu gibi mevcut yöntemlere karşı temel avantajı, daha küçük örnek hacimleri kullanmasıyla çok sayıda konsantrasyon değişkeninin hızlı ve kolay bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanımasıdır.

Bu protokol için hazırlık yaparken, mililitre başına 10 ila 100.000 MPN konsantrasyondaki 0,22 mikron filtrelenmiş viral solüsyon da dahil olmak üzere gerekli tüm solüsyonları hazır bulundurun.

Bir litre steril musluk suyu ölçerek başlayın. Suyu, içinde manyetik karıştırma çubuğu bulunan iki litrelik bir behere aktarın. Suyu karıştırırken 0,7 gram sodyum tiyosülfat ekleyin ve tamamen çözülmesini bekleyin. Ardından, bir molar asit veya baz stok çözeltilerini damla damla ekleyerek pH değerini 7 ile 7,5 arasına ayarlayın. Sonraki aşamada, suyu virüsle spiking işlemine tabi tutun. Hazırlanmış virüs çözeltisinden tam bir mililitre ekleyin. Beherin ağzını steril bir folyo ile kapatın ve virüsün suyla karışması için 10 dakika bekleyin.

Bu sırada, Millipore filtreyi hazırlayın. Öncelikle, filtreyi paketinden çıkarın ve üst hazne ile alt süzgeç arasında sıkıca oturduğundan emin olun. Ardından, filtredeki mantar malzemenin bir litrelik yan kollu erlenin ağzına tam olarak oturduğunu kontrol edin. Şimdi filtrenin üst haznesini çıkarın ve bir penset yardımıyla, 47 mm elektropozitif filtre diskini filtre süzgecinin üzerine düzgünce yerleştirin. Son olarak hazneyi tekrar takın ve saat yönünün tersine çevirerek yerine kilitleyin.

Steril bir mezür kullanarak 100 mililitre katkılı musluk suyunu ölçün. Ardından suyu, iki litrelik balonun üzerindeki hazırlanmış filtre yuvasına aktarın. Filtre içindeki elektropozitif disk, pileli cam-selüloz veya nano-alümina cam fiber olabilir. Kalan suyun filtreden geçmesi için hafif vakum uygulanabilir.

Şimdi, filtre yuvasını 250 mililitrelik yan kollu bir erlene taşıyın. 100 mililitre sığır özütü ölçün ve yavaşça filtrenin üzerine dökün. Özütün yavaşça geçmesine izin verin ve kalan kısmı çekmek için hafif bir vakum uygulayın.

Ardından, iki ikincil konsantrasyon seçeneğinden herhangi biri ile devam edin.

Virüsü celite kullanarak konsantre etmek için, virüs içeren 250 mililitrelik erlen içeriğini bir manyetik karıştırıcıya aktarın. Bir manyetik karıştırma çubuğu kullanarak küçük bir girdap oluşturun. Ardından, 100 mililitre sığır özütüne 0,1 gram celite tozu ekleyin. Celite'nin dağılmasını bekleyin ve çözeltinin pH değerini ayarlamak için hazırlık yapın. 0,1 molar hidroklorik asit damla damla ekleyerek pH değerini 4,0'a düşürün.

Ardından çözeltiyi 10 dakika boyunca karıştırın. Karıştırma işlemi sürerken 47 mililitrelik ön filtreyi iki litrelik bir erlene takın. Şimdi 100 mililitrelik sığır özütü-celite karışımını ön filtreden geçirin. İşlemi tamamlamak için hafif bir vakum uygulanabilir.

Ardından, bir filtre gövdesi çıkış ucuna metal bir tüp klipsi takın. Klipse steril 15 mililitrelik bir polipropilen toplama tüpü yerleştirin ve ardından filtreyi balona yeniden monte edin.

Şimdi virüsü, pH dokuz olan 5 mL 1X PBS ile Celite partiküllerinden elüe edin. PBS'nin çoğunun yerçekimi ile 15 mL'lik tüpe damlamasına izin verin ve kalıntıları hafif bir vakumla çekin. Virüsü organik flokülasyon kullanarak konsantre etmek için, virüs içeren 250 mL'lik balon jojenin içeriğini bir manyetik karıştırıcı üzerine aktarın. Bir manyetik balık kullanarak küçük bir vorteks oluşturun. Bir molar hidroklorik asidi damla damla ekleyerek çözeltinin pH değerini 3,5'e ayarlayın. Ardından karışımı yarım saat boyunca karıştırın. Daha sonra çözeltiyi steril bir 250 mL'lik konik santrifüj tüpüne aktarın. Çözeltiyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 2.500 g'de santrifüjleyin. Santrifüj sonrası, tüpleri taşırken peletin bozulmamasına dikkat edin. Süpernatantı dikkatlice dekante edin ve peleti pH dokuz olan 5 mL PBS içinde yeniden süspande edin. Peletin tamamen çözündüğünden emin olun. Ardından, resüspansiyonu 4 °C'de 10 dakika boyunca 4.000 g'de santrifüjleyin. Şimdi konsantre virüsü içeren süpernatantı toplayın. Pelet atılabilir.

Bu protokol optimize edilirken, üç tip celit karşılaştırılmıştır. Daha büyük gözenekli celit, hem ADV 40 hem de ADV 41 için daha düşük geri kazanım oranlarıyla sonuçlanmıştır.

Filtrelerden ADV partiküllerini toplamak için hangi değerin en etkili olacağını belirlemek amacıyla, filtre elüsyonu 7,5 ile 12 arasındaki pH değerlerinde test edilmiştir. En yüksek geri kazanım, pH 10'daki sığır özütü ve selit ile birlikte kullanılan cam-selüloz filtreden elde edilmiştir. ADV 40 ve ADV 41 ile aynı sonuç alınmıştır.

pH 10'daki sığır eti özütü, organik flokülasyondan daha üstün olduğunu kanıtlamıştır.

Optimize edilmiş yöntem, %25 tripsin ilavesi ve sığır ekstraktının %0,1 sodyum polifosfat ile takviye edilmesiyle karşılaştırılmıştır. Her iki işlem de ADV geri kazanımını anlamlı düzeyde artırmamıştır.

Bu teknik uzmanlaşıldığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde 45 dakika içinde tamamlanabilir.