Bir Nöronal Hücre Line Neurotoxicity ve nöro ilgilendim Moleküler Pathways Delineate bir aracı olarak Real-Time Empedans tabanlı Cell Analyzer

Bu prosedürün genel amacı, koruma sürecine ikinci haberci yolların katılımını tanımlamak için bir nöronal hücre hattının gerçek zamanlı sito korumasını takip etmek için empedans tabanlı bir teknik kullanmaktır. Bu, ilk olarak empedans tabanlı bir gerçek zamanlı hücre analizöründe proliferatif koşullar altında bir nöronal hücre hattının kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, potansiyel olarak alakalı.

İkinci haberci yollar, hücre hattını nöroprotektif tedavilere tabi tutmadan önce farmakolojik olarak inhibe edilir. Daha sonra, nöronal hücre hattının durumu, farklı deneysel koşullar altında gerçek zamanlı bir hücre analizörü kullanılarak takip edilir. Sonuç olarak, istatistiksel analiz, nöronal hücrelerin sito korumasında ikinci haberci yolakların gerçek zamanlı katılımını değerlendirmek için kullanılabilir.

Bu tekniğin son nokta nörotoksisite testleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, Tito korumasının ve tito toksisitesinin nöronal hücre hatlarında gerçek zamanlı olarak ve etiketsiz koşullar altında değerlendirilmesine izin vermesidir. Bu Yöntem, potansiyel nöroprotektif bileşiklerin in vitro olarak daha yüksek verimli değerlendirmesine katkıda bulunarak ve nöroproteksiyonda yer alan moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlayarak moleküler nörobiyoloji alanındaki hızlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, burada, insan nöroblastomu S-K-N-S-H hücreleri PBS ile kullanılır ve ardından hücreleri 37 santigrat derecede beş dakika boyunca tripsin ile kullanılır.

Tripsini santrifüjleme ile çıkarın ve ardından hücreleri 10 mililitre proliferasyon ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri saydıktan sonra, hücreleri daha fazla proliferasyon ortamı ile mililitre konsantrasyonunda üç kez 10 ila beşinci hücreye seyreltin, daha sonra oda sıcaklığında bir doku kültürü davlumbazında bir EPL 96'nın her bir oyuğu 100 mikrolitre proliferasyon ortamı ile dengeleyin. 30 dakika sonra, EPL 96'yı 37 santigrat derecede bir karbondioksit inkübatöründeki gerçek zamanlı bir hücre analiz istasyonuna yerleştirin ve gerçek zamanlı hücre analizörü yazılımını başlatın.

Daha sonra yerleşim sayfasında, deney için uygun kuyucukları seçin ve hücre tipini, hücre numarasını ve ilgilenilen kimyasal bileşiklerin adlarını ve konsantrasyonlarını, birinci adım önceden ayarlandığı için program yazılımı sayfasındaki düzenleme kutularına girin. Arka plan ölçümü için bir adım ekle'yi seçin ve ikinci adımı, hücre indeksini 96 saat boyunca her 15 dakikada bir ölçmek için ayarlayın. Ardından, birinci adımı başlatmak ve ortamın arka plan empedansını ölçmek için başlat'a tıklayın.

Şimdi EPL'yi çıkarın ve 100 mikrolitre nöroblastom hücre süspansiyonu ekleyin. Her deneysel kuyucuğa, kuyucukları eşit şekilde kaplamak için EPL 96'yı hafifçe döndürün ve ardından hücrelerin yarım saat sonra yerleşmesini sağlamak için plakayı doku kültürü başlığında oda sıcaklığında inkübe edin, EPL 96'yı gerçek zamanlı hücre analizörü istasyonuna geri yükleyin ve ikinci adıma başlayın. Deneme boyunca hücre dizini değerlerini izlemek için, çizim sayfasında hücre eğrilerini ve hücre dizini sayfasında ham hücre dizini verilerini 24 saat görüntüleyin.

Hücreleri kapladıktan sonra, deneyi duraklatın ve plakayı gerçek zamanlı hücre analizörü istasyonundan çıkarın. Her bir kuyucuğa taze seyreltilmiş ilgilenilen inhibitörlerden bir mikrolitre dağıtın, ardından EPL 96'yı yeniden yükledikten sonra 30 dakika sonra deneysel hücre indeksi ölçümlerine devam edin, deneyi tekrar duraklatın ve proliferasyon ortamını her bir kuyucuktan hızlı ama dikkatli bir şekilde çıkarın, yapışan hücre tabakasını bozmamak için pipet ucunun kenarını kuyunun köşesine yönlendirin. Daha sonra hemen her bir oyuğa 200 mikrolitre serum yoksunluk ortamı, bir mikrolitre taze seyreltilmiş nöroprotektif ilgilenilen bileşikler ve uygun kuyucuklara ilgilenilen ikinci haberci yol inhibitörlerinden bir mikrolitre ekleyin.

Ardından, verileri analiz etmek için daha önce ayarlandığı gibi 96 saat boyunca her 15 dakikada bir hücre indeksi ölçümlerine devam edin, şimdi hücre indeksini hücre kültüründe yapılan değişikliklerden önceki son zaman noktasına normalleştirmek için çizim sayfasında normalleştirilmiş hücre indeksi ve normalleştirilmiş zaman fonksiyonlarını seçin. Deneyler arasındaki çeşitliliği azaltmak. İlgilenilen deneysel koşullar için çizim sayfasındaki kuyuları vurgulayın ve normalleştirilmiş hücre indeksi eğrilerini çizmek için ekle'ye tıklayın.

Ardından, belirli zaman noktalarında farklı tedavi koşulları altında hücre indeksi değerlerindeki farklılıkların istatistiksel analizi için hücre indeksi yazılım sayfasından tüm hücre indeksi zaman noktaları için deneysel verileri bir elektronik tablo dosyasına aktarın. Dışa aktarılan elektronik tablo dosyasındaki ilgili zaman noktalarındaki hücre dizini değerlerini seçin. Son olarak, seçilen zaman noktaları için hücre indeks değerlerini bir veya iki yönlü varyans analizi ile analiz edin, ardından bir post hoc test yapın İstatistiksel yazılım kullanarak hücrelere nörotoksik uyarılar hücre indeks değerlerinde bir azalmaya yol açar, burada S-K-N-S-H hücreleri proliferasyon ortamında büyütüldüğünde hücre indeksinde bir artış ve hücre indeksinin düşmesi ardından yeni düşük seviyelerde bir stabilizasyon Hücrelerin serum yoksunluk ortamına geçirilmesi bu grafiklerde gösterilmiştir.

İki serotonin iki a reseptör agonistinin nöroprotektif etkisi beş mikromolar, DOI ve 20 mikromolar IDE eklendiğinde hücreler serum yoksunluğu ile beslendiğinde, besiyeri gözlenebilir. Nöroproteksiyon çalışmalarında önemli bir soru, hücre proliferasyonu üzerindeki bir etkinin, hücre sağkalımı üzerinde gözlenen bileşik etkisine katkıda bulunup bulunmadığıdır. Bu grafikte, beş mikromolar DOI tedavisinin SKNS hücre proliferasyonu üzerindeki etkisinin eksikliği gösterilmiştir, bu da proliferasyonun gözlenen nöroprotektif etkiye katkıda bulunmadığını düşündürmektedir.

Bu son grafikte, fosfatidil başlangıç üç kinaz inhibitörü LY 2 9 4 0 0 2'nin 10 mikromolar ile tedavisinin hücre sağkalımı üzerindeki etkisi ve DOI'nin serumdan yoksun SK NSH hücreleri üzerindeki nöroprotektif etkisi gözlemlenebilir. LY 2 9 4 0 0 2, serum yoksunluğu aşamasında DOI'nin nöroprotektif etkisini önledi, ancak aynı zamanda kendi başına bazı toksik etkiler de gösterdi. Bu videoyu izledikten sonra, gerçek zamanlı bir hücre analizörü kullanarak bir nöronal hücre hattında CTO korumasını nasıl takip edeceğinizi ve ikinci haberci yolaklarının korumaya katılımını nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.