Name: Bir Nöronal Hücre Line Neurotoxicity ve nöro ilgilendim Moleküler Pathways Delineate bir aracı olarak Real-Time Empedans tabanlı Cell Analyzer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Öğrenin, empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizörü kullanarak nöronal hücre hatlarında sitoproteksiyonu izlemeyi ve ikinci haberci yolaklarının nöroproteksiyondaki rolünü belirlemeyi. Bu yöntem, nörotoksisite değerlendirmesi için sağlam bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Çalışmada sunulan deneyler için finansal destek, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'nın Marie Heim-Vögtlin programı tarafından sağlanmıştır.
Gerçek zamanlı hücre analizörü verilerindeki istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları taramak için bir dizi değiştirilmiş MATLAB programı geliştirdiği için Bayan Johanna Nyffeler'e ve yardımcı tartışma için Dr. Yama Abassi'ye teşekkür ederiz.

1. Hazırlık <ol><li> 37 ° C&#39;de ve% 5 CO2 ile ayarlanmış bir doku kültürü inkübatörü içinde, gerçek zamanlı hücre analiz cihazının istasyonu yerleştirin. , Steril koşullar altında, bir doku kültürü kaputu tüm hücre kültürü işleme ve farmakolojik tedaviler yürütmek. </li><li> Not: kültür standart koşullar ile karşılaştırıldığında farklı bir sıcaklık ayarı gerektiren Nöronal hücre çizgileri, buna göre ayarlanmalıdır. Zayıf, yapışan hücre hatları için, E-Levha 96 kuyu altındaki altın mikroelektrotla hücre etkileşimi kolaylaştırmak için kaplama maddeleri kullanılır. </li><li> (Uygun bir çözücü içinde nöro-koruyucu maddeler ya da ikinci haberci yollar inhibitörleri - dimetilsülfoksit ya da steril su) 1,000X hazır hücre kültürü tedavisi için farmakolojik bileşimlerin çözelti hazırlayın ve -20 ° C&#39;de saklayın. Aşağıdaki tedavilerinde araç olarak çözücü kullanın. </li><li> DMEM / F1 Kültürü insan nöroblastoma SK-N-SH hücreleri2 ortamının, yaklaşık% 75 bir yoğunluğa 175 cm2 yüzey ile hücre kültürü şişeleri içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) (çoğalma ortamı) ile takviye edilmiştir. Hücre çoğalması ve sitotoksisite tepki hızı açısından deney arasında tutarlılık tespit etmek için (yaklaşık 10 geçitlerin) aralığında bir hücre kanalı sayısı tutun. Alt geçit numaraları tercih edilir. </li><li> PBS ile yapışık SK-N-SH hücre tabakasını yıkayın ve 37 ° C&#39;de 5 dakika boyunca% 0.05 tripsin-EDTA ile tripsinize edin çözeltisi. Santrifüj, 5 dakika boyunca 170 x g &#39;de, hücreler tripsin kaldırın. 10 ml çoğalma ortamı hücreleri tekrar süspansiyon. Scepter hücre sayacı ile hücrelerin sayısı ve çoğalma ortamı ile hücrelerin sulandırarak 300,000 hücre / ml hücre sayısını ayarlayın. </li></ol> 2. Kaplama ve SK-N-SH hücrelerinin çoğalma <ol><li> E-96 Levha her çukuruna 100 ul çoğalma ortamı ilave edin ve oda sıcaklığında dengelenmeye doku kültürü kaputu 30 dakika boyunca bırakın. E-Pla takın37 ° C&#39;de CO2 inkübatöründe gerçek zamanlı hücre analiz istasyonunda 96 te. </li><li> Gerçek zamanlı hücre analiz yazılımını başlatın. Düzeni sayfa kuyular deneye dahil seçin ve düzenleme kutularını hücre tipi, hücre sayısı, isimleri ve hücre tedavisinde kullanılan kimyasal bileşiklerin konsantrasyonları hakkında bilgi girin. NOT: Bu protokolün amaçları için en az 4 replika her tedavi için tavsiye edilir. </li><li> Program yazılım sayfada deneyde, Hücre İndeksi ve her adım için yapılan taramalar arasındaki aralığı ölçüm silme sayısını seçerek dahil &quot;Adımlar&quot; belirler. Adım 1 arka plan ölçümü için önceden belirlenmiş olduğundan, hücre indeksi 96 saat boyunca her 15 dakikada ölçmek ve set Adım 2 &quot;bir adım ekleyin&quot; seçeneğini seçin. NOT: tedaviler için, hangi Hızlı kinetik ile etkiler, beklenen daha kısa aralıklarla süpürür ayarlayın. </li><li> Otomatik olarak önceden belirlenmiş Adım başlatmak için Başlat &#39;1ve ortamın arka empedansı ölçmek. Hücreler, oyuklara ilave edilir sonra bu değeri otomatik olarak her bir veri noktasında yazılım tarafından çıkartılır. </li><li> Çoğalma ortamı içinde 300,000 hücre / ml &#39;lik, daha önce 1.5 adım hazırlandı) hücre süspansiyonu kullanmaktadır. / Oyuk hücre toksisitesi / nöro çalışmalar ve iyi hücre çoğalması çalışmaları için 15,000 hücre / için 30,000 hücre. E-Plate çıkarın ve hücre toksisitesi / nöro çalışmaları için göz başına 100 ul hücre süspansiyonu ekleyin ve hücre çoğalma çalışmaları için oyuk başına 50 ul hücre süspansiyonu, 50 ul çoğalması orta ekleyin. Gözenek başına plakalanan hücre sayısı deneysel olarak her bir hücre hattı için optimize edilmesi gerekmektedir. </li><li> Yavaşça hücrelerin bile kaplanması için E-Plate 96 döndürün. Hücreler kuyuların alt eşit yerleşmek izin vermek için oda sıcaklığında doku kültürü kaputu 30 dakika için E-Plate 96 bırakın. </li><li> Gerçek zamanlı hücre analiz istasyonu E-Plate 96 takın ve zamanlama p Adım 2 başlayacakyaş. Plot sayfa ve yazılımın Hücre İndeks sayfasına ham Hücre Endeksi verilerine hücre eğrileri görüntüleyerek deney boyunca Hücre Endeksi değerleri izleyin. </li></ol> 3. Serum Yoksunluk <ol><li> 24 saat hücreleri kaplama sonra, deney duraklatmak ve gerçek zamanlı hücre analiz istasyonuna E-Plakasını 96 kaldırın. DMEM / F12, serum-içermeyen ortam ile 1,000X stoktan ikinci haberci inhibitörleri seyreltin - 200 x son konsantrasyon. Ilgili yolları inhibe etmek için, ikinci haberci yollarının 1 ul önleyicileri 30 dakika geçmeden önce sitotoksisite nörotoksisite / nöro katılımları için test edilecek olan hücrelerin tedavi edin. Istasyonuna E-Plate 96 İade ve deneysel Hücre Endeksi ölçümleri devam. </li><li> 30 dakika sonra tekrar denemenizi durdurabilirsiniz. Dikkatle yapışık hücre tabakasını bozmak için özen bir pipet (veya çok-kanallı pipet) ile e-Plate tam olarak 96 kuyu çoğalması orta kaldırmakKuyunun köşesine pipet kenarını yönlendirerek. 200 ul / serum içermeyen DMEM / F12 ortamında (serum yoksunluğu ortamı) oyuk ilave edin. Hücrelerin mekanik ajitasyon en aza indirmek için, hücre kültür ortamı hızlı bir değişiminin sağlanması. </li><li> Seyreltik bileşikleri nihai konsantrasyon x 200 olacağı şekilde, serum içermeyen DMEM / F12 ortamı ile 1,000X stoktan bunların nöroprotektif etkileri için test edilecek. 1 ul ekle bileşikleri bunların nöroprotektif etkileri, deneysel planına uygun olarak, tek tek oyuklara ikinci haberci yollarının 1 ul inhibitörleri için test edilecek. </li><li> Çoğalma çalışmaları için hücreler ortam içinde değişmez. Oyuk başına 1 ul ile tedavi etmek ve çoğalma ortamı içinde kültüre devam çoğalma ortamı içinde nihai konsantrasyon x 200 1,000X stoktan, test edilecek bileşikler seyreltin. </li><li> Önceden ayarlanmış olarak 96 saat boyunca Hücre Endeksi ölçümleri ile her 15 dk devam deney sürdürün. </li></ol> 4. Veri AANALİZ <ol><li> Nörotoksisite için / nöroproteksiyon veri Plot sayfada &quot;Saat normalleştirmek&quot; &quot;normalize Hücre Göstergesi&quot; seçerek deneyler arasındaki farklılıkları azaltmak ve farmakolojik tedavi veya orta değişiminden önce son kez noktaya Hücre Endeksi normalleştirmek. </li><li> Ilgi deney koşulları için Plot sayfasında kuyuları vurgulayın ve normalize Hücre Endeksi eğrileri çizmek için &quot;Ekle&quot; butonuna tıklayınız. Ya da zamanın bir fonksiyonu olarak normalize Celi Endeksi eğrileri gibi ikinci habercileri inhibisyon nörotoksik / nöro-koruyucu etkinin kinetiğinin dikkate alınmalıdır. </li><li> Çoğalması üzerinde bir etkisi nöro-koruyucu / nörotoksik etkisi olarak yer alıp almadığını değerlendirmek için, zamanın bir fonksiyonu olarak çoğalma ortamı içinde, test edilen ilaç tedavileri için Hücre Endeksi eğriler dikkat edin. </li><li> Sonuçların istatistiksel olarak değerlendirilmesi başlatmak için bir Excel dosyası içine Hücre Endeksi yazılım sayfadaki tüm Cep Endeksi zaman noktaları için deneysel bilgi İhracat <br/&gt; Not: İstatistiksel analizde bir ilk adım p-değeri ile, Welch&#39;in t-testi kullanmak modifiye MATLAB programları bir dizi semilogarithmically çizilen gibi, (ek kod dosyaları olarak verilmiştir) zaman ölçeğinde karşı ters ekseni kullanmaktadır. Bu programlar, bütün gerçek zamanlı bir analiz hücre deney süresi boyunca-p-değerleri tespit edilmesini sağlar ve bu nedenle daha detaylı bir istatistiksel analiz için zaman noktalarının seçimi oldukça kolaylaşmıştır. Programları hakkında ayrıntılı bilgi için ek malzeme bakın. </li><li> Belirli zaman noktalarında farklı tedavi koşullarında Hücre Endeksi değerlerindeki farklılıkların istatistiksel analizi için, dışa aktarılan Excel dosyasından ilgili zaman noktalarında seçin Hücre Endeks değerleri. Istatistiksel yazılım kullanarak bir post-hoc testi varyansın tek-yönlü veya iki yönlü analizi (ANOVA) ile seçilen zaman noktaları için Hücre Endeksi değerleri analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Cavallucci, V., D'Amelio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matter+of+life+and+death%3A+the+pharmacological+approaches+targeting+apoptosis+in+brain+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Des%22%5BJournal%5D)">Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases.</a> Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).</li>
<li>Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBull%2C+S+%22Focus+on+Neurological+Diseases%22">Focus on Neurological Diseases</a>. , Health Protection Agency. (2007).</li>
<li>Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xCELLigence+system+for+real-time+and+label-free+monitoring+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability.</a> Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).</li>
<li>Limame, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+dynamic+cell+viability%2C+migration+and+invasion+assessments+by+novel+real-time+technology+and+classic+endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays.</a> PLoS One. 7 (10), e46536(2012).</li>
<li>Diemert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedance+measurement+for+real-time+detection+of+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death.</a> J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).</li>
<li>Kustermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+label-free%2C+impedance-based+real+time+assay+to+identify+drug-induced+toxicities+and+differentiate+cytostatic+from+cytotoxic+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects.</a> Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-HT2A+serotonin+receptor+agonist+DOI+alleviates+cytotoxicity+in+neuroblastoma+cells%3A+role+of+the+ERK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).</li>
<li>González-Maeso, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallucinogens+recruit+specific+cortical+5-HT%282A%29+receptor-mediated+signaling+pathways+to+affect+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior.</a> Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).</li>
<li>Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+%285-HT%29+induces+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+%28GDNF%29+mRNA+expression+via+the+transactivation+of+fibroblast+growth+factor+receptor+2+%28FGFR2%29+in+rat+C6+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells.</a> J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).</li>
<li>Galante, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+toxicity%2C+conformation+and+morphology+of+typical+initial+aggregation+states+of+A%CE%B21-42+and+A%CE%B2py3-42+beta-amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).</li>
<li>Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+or+target+deprivation-induced+neuronal+death+causes+oxidative+neuronal+accumulation+of+Zn2%2Band+loss+of+NAD%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).</li>
</ol>

Geçerli video-makale için yayın masrafları &quot;ACEA Biyobilimlerdeki&quot; tarafından desteklenmiştir.

Geçerli protokol sürekli olarak, etiket içermeyen koşullar altında, nöronal hücre hatlarında bileşiklerin nöro-koruyucu / nörotoksik etkilerini değerlendirmek için ve etkisi dahil ikinci haberici yoluna daha iyi anlamak için, gerçek zamanlı bir analiz hücre yararını sunar. Sitotoksisite ve hücre çoğalması üzerindeki ilaçların etkilerini incelemek için gerçek zamanlı hücre analiz cihazının programı genel kabul görmüş olsa da, sadece birkaç çalışmalarda nöronal ilgili hücre tipleri kullanmıştı...

Nöronal hücre ölümü, birçok beyin-1 ile ilişkili bozuklukların patofizyolojisinde önemli bir rol oynar. In vitro toksisite deneyleri güvenilir ve yüksek verimlilik kullanılabilirliği nörotoksisitenin mekanizmaları daha iyi anlamanıza ve ilaç geliştirme 2 terapötik aday olarak nöro molekülleri seçmenize yardımcı için çok önemlidir. Bununla birlikte, en yaygın olarak kinetik çözülmesine izin veren tek bir zaman noktasında nörotoksisite / değerlendirmek için nöro-nitro nörotoksisite assays.They olarak kullanılan bir çok sınırlamalar mevcuttur; çoğu zaman sinyal yollarına müdahale ve aynı hücre popülasyonunda ek çalışmalar sınırlamak ve genellikle bir iş gücünü gerektirir ve pek çok durumda mekanik bir bilgi sağlar yok olabilir veya bir etiket sonda kullanma. Bu çalışmada gerçek zamanlı ve altında, nöronal hücre hattında nöro-toksisiteyi ve nöro-belirlemek için, gerçek zamanlı bir empedans tabanlı hücre analiz yararlılığını göstermek etiketsizkoşulları etkilenmesinde rol ikinci haberci yollara analizi yoluyla aşağı mekanizmaları içgörü sağlamak ve. Önceki çalışmalar, standart teknikler ile karşılaştırıldığında, 3,4,5,6 sitotoksisite gibi hücre hatları, hücre çoğalması üzerindeki etkisini belirlemek için, gerçek zamanlı hücre analiz geçerliliğini teyit etmiştir. Örneğin, bir iyi bir korelasyon bazal koşullar altında çoğalması ve HeLa hücrelerinde 3, iki farklı toksik paradigmaların ardından çeşitli zaman noktalarında standart hücre canlılığı, WST-1 deneyinin okumalar ve hücre endeksi değerleri arasında gözlenmiştir. Celi Endeksi ölçümleri ile ve standart olarak kullanılan sülforodamin B (SRB) 4 deney sırasında mikrotübül dengeleyici paklitaksel ile tahrik A549 ve MDA-MB-231 hücreleri çoğalması ve sitotoksisitesinde çok benzer sonuçlar göstermiştir. Ölümsüzleştirilmiş hipokampal nöronlarının nöronal hücre hattı HT-22 Hücre indeksi ölçümlerinin yetenekleri t doğrulanmıştıro yaygın olarak kullanılan 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl) karşı, hücre proliferasyonunu, glutamat sitotoksisitesinin ve sitoproteksiyonunu 2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) deneyi 5 algılar. Aynı çalışmada MTT deneyi sonuçları ve Hücre Endeksi ölçümleri de pan-kaspaz inhibitörü Qvd 5 ile büyüme faktörleri yoksunluk ve sitotoksisite kurtarılması sonrasında nöronal progenitör hücrelerin çoğalması, sitotoksitesi ölçme pozitif ilişkilidir. Vandetanib (vasküler endotel büyüme faktörü reseptör ve epidermal büyüme faktörü reseptörü inhibitörü) ile NIH 3T3 hücrelerinde olduğu sitotoksisitesi, hücre endeksi değerleri ya da nötr kırmızı alım deneyi 6 ölçülen benzer sonuçlar göstermiştir. Son zamanlarda, serotonin 2A nöro-koruyucu etkisini değerlendirmek için gerçek zaman hücre analiz sistemi kullanılmaktadır (5-HT2A) alıcı agonisti (±) -2,5-dimetoksi-4-iodoamphetamine hidroklorür, nöronal bir hücre hattında (DOI) ( SK-N-SH hücreleri) ve Seco katılımı açısından tarandıgözlenen nöro-7 kimyasal inhibisyon etkinin izlenmesi sayesinde nci mesaj yolakları. İlginç bir şekilde, 5-HT2A reseptör yaygın ve farklı bir ikinci haberci yolları 8 hem de aktive edebilmektedir (Doi ve lisurid, sırasıyla gibi) ve halüsinojen nonhallucinogenic hem agonistler hem de vardır. Sunulan tekniğin avantajları, gün içerisinde hücre sağkalım üzerine gerçek zamanlı bilgi toplamak için nörokoruma çoğalması etkilerin olası katkısını değerlendirmek için, ve optimal zamanı seçmek için, ikinci-haberci yollar dahil belirginleştiren için izin vardır Aynı hücre popülasyonu üzerinde ek uç nokta çalışmaları için. Mevcut protokolde iş akışının şematik bir diyagramı Şekil 1&#39;de sunulmuştur.

<table><tbody><tr><td>xCELLigence&nbsp; RTCA SP sistem paketi</td><td>ACEA Biosciences</td><td>No: 00380601030</td><td>, RTCA Analizörü, RTCA SP İstasyonu ve RTCA Kontrol Ünitesinden oluşur</td></tr><tr><td>E-plaka 96</td><td>ACEA Biosciences</td><td>No: 05232368001</td><td>RTCA SP İstasyonuna yerleştirilen hücreleri kültürlemek için</td></tr><tr><td>SK-N-SH hücreleri</td><td>ATCC (LGC Standartları ile ortaklaşa)</td> <td>HTB-11</td><td>İlgilenilen başka bir yapışık nöronal hücre hattı ile değiştirilebilir</td></tr><tr><td>DMEM / F12&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16140-063</td><td>Proliferasyonu takviye eder, ancak serum yoksunluğu ortamı değil</td></tr><tr><td>Doku kültürü şişesi T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.302</td><td>Daha sonra E-Plaka 96 üzerine kaplanacak olan hücrelerin kültürlenmesi için</td></tr><tr><td>%0.05 Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300-054</td><td>Doku kültürü şişelerinde kültürlenen hücrelerin triplizasyonu için</td></tr><tr><td>Scepter 2.0 hücre sayacı</td><td>Merck Millipore PHCC20060</td><td></td><td>Otomatik hücre sayacı</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Hücreleri yıkamak için</td></tr><tr><td>(&plusmn;)Hücre kültürü tedavisi için -DOI hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D101</td><td>5-HT2A agonisti</td></tr><tr>Hücre kültürü tedavisi için<td>LY-294002 hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9908</td><td>PI3-K inhibitörü&nbsp;</td></tr><tr>Hücre <td>kültürü tedavisi için 5-HT2A agonistik aktiviteye sahip</td> <td>Lisuride maleat</td><td>Tocris Bioscience</td><td>4052</td> Bileşik</tr><tr><td>LY-294002 ve lisuride maleatın çözülmesi için</td> <td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td></tr></tbody></table>

bir nöronal hücre line neurotoxicity ve nöro ilgilendim moleküler pathways delineate bir aracı olarak real-time empedans tabanlı cell analyzer

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Birçok beyin ile ilgili bozukluklar kendi patofizyolojisinde rol nöronal hücre ölümünü var. Uyuşturucu ve nöro / nörotoksisitenin moleküler mekanizmaları anlamak ve potansiyel ilaç gelişimini kolaylaştırabilir yardımcı olacağını çıkıyor aşağı yollar nöroprotektif veya nörotoksik etkilerini incelemek için in vitro modellerinde geliştirilmiş. Ancak, birçok mevcut in vitro toksisite deneyleri büyük sınırlamaları var - çoğu değil zaman ders ve etkisi kinetiğini gözlemlemek için izin, tek bir zaman noktasında nörotoksisiteyi ve nöro değerlendirmek. Ayrıca, gerçek zamanlı olarak nöro katılan aşağı sinyal yollar hakkında bilgi toplamak için fırsat büyük önem olurdu. Mevcut protokolde, etiket içermeyen ve gerçek zamanlı iklimlendirme altında, nöronal hücre hattında serotonin 2A (5-HT2A) reseptör agonistlerinin nöro-koruyucu etkisini araştırmak üzere bir reel-zamanlı empedans tabanlı hücre analiz kullanılmasını tarif ederempedans ölçümleri kullanarak iyonları. Ayrıca, ikinci haberci yollarının inhibitörleri nöro-koruyucu etkisinin dahil alt molekülleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir. Ayrıca hücre proliferasyonu üzerinde bir etkiye sahip bir gözlenen nöro-koruyucu etkisine katkıda olup olmadığını belirlemek için bu tekniğin programı açıklanmaktadır. Sistem, kuyuların alt yüzeyi üzerinde altın mikro-elektrot diziler alternatif hücre sensör olarak işlev gören ihtiva e-Plakalar olarak adlandırılır özel mikroelektronik plakalar kullanır. Empedans okuma yapışık hücreler, hücre canlılığı, morfolojisi ve yapışma sayısına göre modifiye edilir. Hücre Endeksi olarak adlandırılan bir boyutsuz parametre elektrik empedans ölçümleri elde edilir ve hücre durumunu temsil etmek için kullanılır. Genel olarak, gerçek zamanlı empedans tabanlı hücre analiz fazla katkı, gerçek zamanlı, nöro-korumanın ve nörotoksisite etiketsiz değerlendirmesi, haberci ve ikinci yollar katılımının değerlendirilmesine izin verirtedavi ilaçlarını seçilmesi için in vitro nöro-koruyucu potansiyel bileşiklerin ayrıntılı ve yüksek verim değerlendirmesi.

<html> , Serum yoksunluğu, gerçek-zaman hücre analiz sürekli izlenebilir Celi endeksi değerlerine azalmaya yol açar Nörotoksik uyarıcı hücrelere sunulan teknik ve spesifik nörotoksik uyaran ve testlerde kullanılan hücre türüne bağımlı olan dinamikleri ile gerçek zamanlı olarak takip edilebilir Celi endeksi değerleri bir azalmaya yol açmaktadır. Şekil 2 &#39;de artış göstermektedir SK-N-SH hücreleri bir plato (yeşil hat) ve mahrumiyet ortamı (kırmızı çizgi) se...

Geliştirilmiş in vitro nörotoksisite testleri, yeni nöroprotektif bileşiklerin tanımlanmasına yardımcı olacaktır. Nöronal hücre hatlarında sitotoksisite ve sitoproteksiyonu belirlemek ve ikinci haberci yolakların katılımını tanımlamak ve böylece nöroproteksiyon mekanizması hakkında bilgi kazanmak için gerçek zamanlı empedans tabanlı bir hücre analizörünün faydası sunulmaktadır.

Bir Nöronal Hücre Line Neurotoxicity ve nöro ilgilendim Moleküler Pathways Delineate bir aracı olarak Real-Time Empedans tabanlı Cell Analyzer

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

Bu prosedürün genel amacı, koruma sürecinde ikinci haberci yollarının rolünü belirlemek için bir nöronal hücre hattının gerçek zamanlı sitoproteksiyonunu izlemek amacıyla empedans tabanlı bir teknik kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle bir nöronal hücre hattının empedans tabanlı gerçek zamanlı bir hücre analizöründe proliferatif koşullar altında kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, potansiyel olarak ilgili.Hücre hattı nöroprotektif işlemlere tabi tutulmadan önce, ikinci haberci yolakları farmakolojik olarak inhibe edilir. Ardından, nöronal hücre hattının durumu, farklı deneysel koşullar altında gerçek zamanlı bir hücre analizörü kullanılarak takip edilir. Son olarak, ikinci haberci yolaklarının nöronal hücrelerin sitoproteksiyonundaki gerçek zamanlı rolünü değerlendirmek için istatistiksel analiz kullanılabilir.Bu tekniğin son nokta nörotoksisite analizleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, nöronal hücre hatlarında nöroproteksiyon ve nörotoksisitenin gerçek zamanlı olarak ve etiketsiz koşullar altında değerlendirilmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, potansiyel nöroprotektif bileşiklerin in vitro ortamda daha yüksek kapasiteli değerlendirmesine katkıda bulunarak ve nöroproteksiyonda yer alan moleküler mekanizmalara dair içgörü sağlayarak, moleküler nörobiyoloji alanındaki hızlı soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Adheren bir nöronal hücre hattı tabakasını yıkayarak başlayın. Örneğin burada, insan nöroblastoma S-K-N-S-H hücreleri PBS ile yıkanmış, ardından hücreler 37 °C'de beş dakika boyunca tripsine tabi tutulmuştur.Santrifüjasyon yoluyla tripsini uzaklaştırın ve ardından hücreleri 10 mililitre proliferasyon ortamında yeniden süspande edin. Hücreleri saydıktan sonra, daha fazla proliferasyon ortamı kullanarak hücreleri mililitre başına üç x 10⁵ hücre konsantrasyonuna seyreltin, ardından bir doku kültürü davlumbazında oda sıcaklığında bir EPL 96'nın her kuyucuğunu 100 mikrolitre proliferasyon ortamı ile dengeleyin. 30 dakika sonra, EPL 96'yı 37 °C'deki bir karbondioksit inkübatöründeki gerçek zamanlı hücre analizör istasyonuna yerleştirin ve gerçek zamanlı hücre analizör yazılımını başlatın.Ardından yerleşim sayfasında, deney için uygun kuyucukları seçin ve birinci adım önceden ayarlanmış olduğundan, hücre tipi, hücre sayısı ile ilgilenilen kimyasal bileşiklerin isimlerini ve konsantrasyonlarını zamanlama yazılımı sayfasındaki düzenleme kutularına girin. Arka plan ölçümü için, adım ekle seçeneğini belirleyin ve ikinci adımı, hücre indeksini 96 saat boyunca her 15 dakikada bir ölçecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, birinci adımı başlatmak ve medyanın arka plan empedansını ölçmek için başlat düğmesine tıklayın.Şimdi EPL'yi çıkarın ve 100 µL nöroblastoma hücre süspansiyonu ekleyin. Her bir deney kuyucuğundaki EPL 96'yı, kuyucukların eşit şekilde kaplanması için nazikçe çalkalayın ve ardından hücrelerin çökmesini sağlamak için plakayı doku kültürü davlumbazında oda sıcaklığında yarım saat bekletin; ardından EPL 96'yı gerçek zamanlı hücre analizör istasyonuna geri yükleyin ve ikinci adıma başlayın. Deney boyunca hücre indeksi değerlerini izlemek için, grafik sayfasındaki hücre eğrilerini ve hücre indeksi sayfasındaki 24 saatlik ham hücre indeksi verilerini görüntüleyin.Hücreler ekildikten sonra deneyi durdurun ve plakayı gerçek zamanlı hücre analiz istasyonundan çıkarın. Her bir kuyucuğa, taze seyreltilmiş ilgili inhibitörlerden bir mikrolitre ekleyin; ardından EPL 96'yı yeniden yükleyerek 30 dakika sonra deneysel hücre indeksi ölçümlerini yeniden başlatın, deneyi tekrar durdurun ve yapışık hücre tabakasını bozmamak için pipet ucunun kenarını kuyucuğun köşesine yönlendirerek proliferasyon besiyerini her bir kuyucuktan hızlı ancak dikkatli bir şekilde uzaklaştırın. Ardından hemen her bir kuyucuğa 200 mikrolitre serum yoksunluğu besiyeri, taze seyreltilmiş ilgili nöroprotektif bileşiklerden bir mikrolitre ve uygun kuyucuklara ilgili ikinci haberci yol inhibitörlerinden bir mikrolitre ekleyin.Ardından, verileri analiz etmek için daha önce ayarlanmış şekilde 96 saat boyunca her 15 dakikada bir hücre indeksi ölçümlerine devam edin; deneyler arasındaki varyasyonu azaltmak için şimdi grafik sayfasındaki normalize edilmiş hücre indeksi ve normalize edilmiş zaman fonksiyonlarını seçerek hücre indeksini, hücre kültürüne yapılan modifikasyonlardan önceki son zaman noktasına normalize edin. Grafik sayfasında ilgilenilen deneysel koşullara ait kuyucukları vurgulayın ve normalize edilmiş hücre indeksi eğrilerini çizdirmek için ekle'ye tıklayın.Ardından, farklı tedavi koşulları altındaki hücre indeksi değerlerinin belirli zaman noktalarındaki farklarının istatistiksel analizi için, hücre indeksi yazılım sayfasındaki tüm hücre indeksi zaman noktalarına ait deneysel verileri bir hesap tablosu dosyasına aktarın. Aktarılan hesap tablosu dosyası içindeki ilgili zaman noktalarına ait hücre indeksi değerlerini seçin. Son olarak, seçilen zaman noktaları için hücre indeksi değerlerini, istatistiksel yazılım kullanarak tek veya çift yönlü varyans analizi ve ardından bir post hoc testi ile analiz edin. Hücrelere uygulanan nörotoksik uyaranlar, hücre indeksi değerlerinde bir azalmaya yol açar; burada, S-K-N-S-H hücreleri proliferasyon ortamında büyütüldüğünde hücre indeksindeki artış ve hücrelerin serum yoksunluğu ortamına geçirilmesinin ardından hücre indeksindeki düşüş ve ardından yeni daha düşük seviyelerde stabilize olması bu grafiklerde gösterilmektedir.Hücreler serum yoksunluğu içeren besiyeri ile beslendiğinde eklenen 5 µM DOI ve 20 µM IDE şeklinde iki serotonin 2A reseptör agonistinin nöroprotektif etkisi gözlemlenebilir. Nöroproteksiyon çalışmalarında önemli bir soru, hücre proliferasyonu üzerindeki bir etkinin, bileşiğin hücre sağkalımı üzerinde gözlemlenen etkisine katkıda bulunup bulunmadığıdır. Bu grafikte, 5 µM DOI uygulamasının SKNS hücre proliferasyonu üzerinde etkisinin olmadığı gösterilmektedir; bu da proliferasyonun gözlemlenen nöroprotektif etkiye katkıda bulunmadığını ortaya koymaktadır.Bu son grafikte, 10 µM fosfatidilinositol 3-kinaz inhibitörü LY 2 9 4 0 0 2 ile tedavinin hücre sağkalımı üzerindeki etkisi ve serumdan yoksun bırakılmış SK NSH hücrelerinde DOI'nin nöroprotektif etkisi gözlemlenebilir. LY 2 9 4 0 0 2, serum yoksunluğu aşamasında DOI'nin nöroprotektif etkisini önlemiş, ancak aynı zamanda kendisinin de bazı toksik etkiler sergilediği görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, gerçek zamanlı bir hücre analizörü kullanarak nöronal bir hücre hattında CTO korumasının nasıl takip edileceği ve korumada ikinci haberci yolakların rolünün nasıl belirleneceği konusunda kapsamlı bir anlayış kazanmış olmalısınız.

real-time-impedance-based-cell-analyzer-as-tool-to-delineate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, bir hücresel empedans testi aracılığıyla yapışık hücrelerin çoğalması da dahil olmak üzere hücresel olayların gerçek zamanlı izleme sürecini gösteriyoruz. Burada, yapışık hücreler, elektrotlar arasındaki akım akışını kısıtlayan ve empedansı artıran yalıtkan görevi görür.

Hücresel süreçlerin gerçek zamanlı olarak izlenmesi için hücresel empedans tabanlı analiz

Kaynak: Mudduluru, G., et. al. Kanser Hücresi Göçü ve İstilasının Empedans Tabanlı Gerçek Zamanlı Ölçümü. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, glioblastoma hücre istilasını ve göçünü ölçmek için empedans tabanlı bir testi göstermektedir. Hücreler hücre dışı matrisi bozar, mikro gözenekli zarlardan geçer ve elektrotlara yapışarak empedans oluşturur. Bu gerçek zamanlı analiz, kanser araştırma uygulamaları için istilacı potansiyellerini yansıtıyor.

Beyin Kanseri Hücre İstilasının Empedans Tabanlı Ölçümleri

Bu protokol Electric Cell-substrat Empedans Algılama, hücre eki, çoğalması, hareketliliği ve farmakolojik ve toksik uyaranlara hücresel yanıtların ölçümü için yapışık hücrelerin empedans spektrumu kaydetmek ve analiz etmek için bir yöntemi incelemektedir. Endotelial geçirgenliğin ve hücre-hücre ve hücre-yüzey kontaktların değerlendirilmesi tespiti vurgulanmıştır.

Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

Bu el yazması, bir saha taşınabilir elektrikli hücre-substrat empedans sensöründe kullanılmak üzere Gökkuşağı alabalığı solungaç epitel hücreleri ile akışkan biyoçiplerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır.  Sensörle hızlı bir içme suyu toksisitesi testi yapmak için protokol de açıklanmıştır.

Hazırlık ve Test zehirlilik için hızlı değerlendirme İçme Suyu Örnekleri için RTgill-W1 Hücreleri ile akışkan bioçipler Empedans tabanlı

Burada, aktive edilmiş T hücreleri ile etkileşim üzerine endotel hücre bütünlüğü ve geçirgenliği üzerindeki sonuçlara odaklanarak, empedans hücre spektroskopisini kullanan kan-beyin bariyerinin in vitro bir murin modelini açıklıyoruz.

bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Empedans Spektroskopisi kullanarak kan-beyin bariyerinin Model: T Hücre-endotelyal hücre Etkileşim Üzerine Bir Odak

Kanser, farklı organlara metastaz yeteneği nedeniyle ölümcül bir hastalıktır. Kanser hücrelerinin çeşitli tedavi koşulları altında göç ve işgal yeteneğini belirlemek terapötik stratejilerin değerlendirilmesi için çok önemlidir. Bu protokol glioblastoma kanser hücre hattının gerçek zamanlı metastatik yeteneklerini değerlendirmek için bir yöntem sunar.

Empedans tabanlı Gerçek Zamanlı Kanser Hücre Göçü ve İstilası Ölçümü

İnvaziv hücre alt popülasyonlarını gerçek zamanlı olarak tespit etmek ve yakalamak için bir yaklaşım açıklıyoruz. Deneysel tasarım, hücrelerin elektrik empedansındaki değişiklikleri izleyerek Gerçek Zamanlı Hücresel Analiz kullanır. Kompleks dokulardaki invaziv kanser, immün, endotel veya stromal hücreler yakalanabilir ve ko-kültürlerin etkisi değerlendirilebilir.

Ko-kültürlerden İnvaziv Hücre Alt Popülasyonlarının Gerçek Zamanlı Tespiti ve Yakalanması

Burada, insan hücrelerinde Zika virüsü enfeksiyonunu ve replikasyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için çok kolay ve basit bir yöntem olarak hücre bazlı elektriksel empedansın (CEI) kullanımını gösteriyoruz. Ayrıca, CEI testi antiviral bileşiklerin değerlendirilmesi için yararlıdır.

Zika Virüsü İnhibitörlerini Gerçek Zamanlı Olarak Değerlendirmek için Hücre Tabanlı Elektriksel Empedans Platformu

Burada empedans tabanlı biyosensörleri kullanma tekniğini gösteriyoruz: beyin endotel bariyer gücünü ölçmek için ECIS ve cellZscope. Beyin endotelinin in vitro modeline çeşitli uyaranlar eklemenin hazırlanmasını ve tekniğini detaylandırıyoruz. Bulguları ölçüyor, kaydediyor ve temsili bir analiz yapıyoruz.

Kanser Hücreleri ve Sitokinlere Yanıt Olarak İki Empedans Tabanlı Biyosensör ile Beyin Endotel Bariyer Bütünlüğündeki Değişikliklerin Ölçülmesi

Biz nöron morfolojisi analiz etmek için bir bilgisayar programı geliştirdik. Mevcut iki açık kaynak kodlu analiz araçları ile birlikte, program Sholl analiz yapar ve neurites, şube noktaları ve neurite ipuçları sayısını belirler. Analizler neurite morfolojisi yerel değişiklikler görülebilir şekilde yapılmaktadır.

Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Öğrenin, empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analizörü kullanarak nöronal hücre hatlarında sitoproteksiyonu izlemeyi ve ikinci haberci yolaklarının nöroproteksiyondaki rolünü belirlemeyi. Bu yöntem, nörotoksisite değerlendirmesi için sağlam bir platform sunar.

Bir Nöronal Hücre Line Neurotoxicity ve nöro ilgilendim Moleküler Pathways Delineate bir aracı olarak Real-Time Empedans tabanlı Cell Analyzer (Video) | JoVE Journal

Bir Nöronal Hücre Line Neurotoxicity ve nöro ilgilendim Moleküler Pathways Delineate bir aracı olarak Real-Time Empedans tabanlı Cell Analyzer

Daha fazla video keşfet