Name: Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: Öğrenin davranan bal arılarında iki farklı beyin bölgesinden eşzamanlı uzun vadeli kayıt tekniğini. Bu yöntem, koku kodlama ve bellek oluşumu mekanizmalarını anlamak için nöronal işlemeyi araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, elektrot yerleştirme tarafının izlenmesini sağlayan Isabelle Reus'a, LabView programlaması için Tobias Rosenbaum'a, veri analizleri ve yardımcı tartışmalar için Anneke Meyer'e teşekkür eder. Elektrot geliştirmenin erken aşamasında tartışma ve pratik yardım için Randolf Menzel'e teşekkür ederiz. Ayrıca, Brian Smith'e MS-B ile doktora sonrası ilişkisi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SPP 1392, Ro1177/5-2) tarafından WR'ye desteklenmiştir.

1.. Elektrot Binası (Şekil 1) <ol><li> Ticari çok kanallı amplifikatör sistemleri 1,2,25 elektrot arayüz kartı uygun bir elektrot adaptörü üretimi. <ol><li> 18 Pin bağlayıcı tabanına yapıştırılmış küçük bir pleksiglas tabak kullanın. </li><li> Pleksiglas plaka üzerine vidalı 3 ayrı lehim pabuçları için izole tel 3 kısa adet (Şekil 1 A1-A3) ile taban bağlayın. </li><li> Bir cam kılcal kolayca hareket edebilir ve bir vida ile yerinde tutulabilir hangi Plexiglas plaka içine bir yiv (Şekil 1 B1) takın. </li><li> Bir minutien pimi kullanılarak yaklaşık 5 mm cam kılcal uzatın. </li><li> Istikrar ve destek garanti minutien pimi ve cam kapiller boyunca mikro elektrot tel takmak. </li></ol></li><li> Çok kanallı mikro tel üretimi (Ryuichy Okada 32,33 den alınmıştır) <ol><li> Dizisi 3. mikro teller (poliüretan kaplı bakır tel, 15bunlar yanyana yerleştirilen bir şekilde (Şekil 1 B2) um çapında). </li><li> (Elektrot ucu) (Şekil 1 B3) birlikte tutkal onları kısmen telleri boyunca düşük erime diş balmumu ince bir film tabakası (50 ° C) yaymak için bir 12 V lehim iğne kullanın. Bu bölümde elektrot adaptörü ile mikro telleri bağlamak için daha sonra kullanılabilir olacak gibi unglued birkaç santimetre (elektrot ucu) bırakın. </li></ol></li><li> Elektrot adaptöre çoklu kanal mikro teli bağlayın <ol><li> Sahibinden cam kılcal çıkarın ve elektrot ucu minutien iğne ile sabitleyin. Mikro-elektrot (Şekil 1 B3) paralel bir konuma getirin. </li><li> Düşük erime diş balmumu kullanarak minutien pin elektrot ucu Tutkal ve (küçük oklar 1 B3 Şekil) minutien pin ve elektrot sonunda 2-3 cm çıkıntılı, ucunda mikro elektrot kesti. </li><li> Kılcal sl Kaymaightly geri elektrot adaptörü içine. (Şekil 1 B4) bunu düzeltmek için vidayı kullanın. </li><li> Yalıtımın erimesini (Şekil 1 B4) olmak üzere yaklaşık 360 ° C arasında bir sıcaklığa sahip bir lehim tabancası kullanarak lehim pabuçları için üç tellerin gevşek uçları Lehim. Lehimleme sonra yeterli elektrik kontağı (~ 300 kOhm) olduğundan emin olun. </li><li> Headstage elektrot arayüz kartına elektrotlar (master) birini mount ve ayrı bir adaptör üzerinde diğer çok kanallı elektrot (köle) düzeltin. Ana elektrot (Şekil 1 C1) slave kanallarını bağlayın. Ayrıca, ana elektrot tabanına başvuru yanı sıra kas elektrotlar (Şekil 1 C2) lehim. </li></ol></li></ol> 2.. Arı Hazırlama (Şekil 2) Bu tarif edilen deneylerde, omurgasız bir hayvan olan bal arısı (Apis mellifera),ve bu nedenle kullanım için özel etik izin kullanılır gerektirmez. <ol><li> Başkaları 34,35 gösterildiği gibi sabah kovan girişinde balarısı silaj (A. mellifera) yakalayın. </li><li> Immobilizasyon (5-10 dk) kadar ezilmiş buz üzerinde arılar soğuk ve baş maruz bir şekilde (Şekil 2 A) standart bir pleksiglas sahibinin veya metal tüp içinde bir tane. En aza indirmek için baş hareketleri, düşük erime diş mumu (~ 50 ° C) kullanabilir ve bileşik göz ve boyun çevresinde esas sahibine dikkatlice başlığı düzeltmek. </li><li> Flagellumu dokunmadan baş kapsülü (Şekil 2 B) anten SCAPI sabitleşmek düşük erime balmumu kullanın. Antenin kamçı ileri işaret edilmesi gerekmektedir. Arı serbestçe burnumun taşıyabilirsiniz emin olun. </li><li> Kesintisiz bir görünüm ve başın üst erişimi sağlamak için baş kapsülü tıraş. </li><li> Saturati kadar bir% 30 sukroz çözeltisi ile arı Beslemebeyin dokusu ve hayvanın iyi canlılığı (Şekil 2 C) yeterli nemlendirilmesini sağlamak için. </li><li> Dikey olarak bileşim gözün sınırları boyunca ve yatay olarak antennal bazlar yukarıdaki gibi ocelli altında dikkatli olun ve insizyon kütikül gevşek parça (Şekil 2 B) çıkarın. </li><li> Dikkatle hipofaringeal bezleri kenara ve net bir görünüm ve ekleme (Şekil 2E, 2F) elektrot önce beyne erişim sağlamak için trakea çıkarın. </li></ol> 3.. Elektrot Yerleştirme Şekil 2&#39;de gösterilen örnek durumda, tek bir elektrot l-ALT, m-ALT 2 amaçlayan diğer bir amaçlayan konumlandırılmıştır. Özellikle işaretlerini kullanarak, diğer hedef bölgelerde, örneğin MB AL ve çıkış bölgeleri 1, hem de mümkündür. <ol><li> (Ilgilenilen bölgesinde mikromanipülatörler kullanarak elektrotlara yerleştirin <strong&gt; Şekil 2G ve 3A). M-ALT yerde AL ve mediale MB dikey lobundan arasındaki elektrot hedeflemek için. Mediolateral ALT PNS dallanma noktasının üzerinde olma ekleme siteyi olun. Yaklaşık 180 um (Şekil 2E) bir derinliğe sahip, beyin içine elektrod çıkıntı yapar. Elektrot dikey lob ve AL orta yan tarafı arasında bir hayali çizginin ortasında yanal protocerebrum (LH) altında l-ALT PN kayıt için burası. Yaklaşık 300 um (Şekil 2E) bir derinliğe sahip elektrot yerleştirin </li><li> Manikür küçük bir kesikten taraftaki bileşik göz içine referans (gümüş tel, yaklaşık 25 mikron çapında) takın. Yanal ocelli altındaki kas projeksiyon bölgeye başka bir gümüş tel yerleştirin. NOT: Gerekirse arının öğrenme davranışı i katılır kas M17, kayıt yüksek zamansal hassasiyetle izlenebilirn arı 36 burnumun uzantısı yanıt (PER) olarak 25 tarif. </li><li> Sağlam, beyin ve kafa kapsül içindeki elektrotlar demirlemek kurumasını beyin engeller, iki bileşenli silikon (Şekil 2H) ile beyin yukarıdaki tüm alanı kapsayacak. Not: kayıtlar güne kadar saatlerce sürebilir ve arılar, örneğin klasik bir klima prosedür (Şekil 2H) sırasında kaydedilebilir ya da farklı kokuların geniş bir paneli ile stimüle edebilir. </li></ol> 4. Veri Toplama ve önişlemesi <ol><li> Aşağıdaki gereksinimleri karşılayan uygun toplama yazılımı kullanın: min 25 kHz örnekleme oranı; analog 1,25 veya elektrot kanallar arasında dijital 2 çapraz farklılaşması; bant başak olayları ayıklamak için 8.000 Hz 300 Hz arasında geçiş filtresi. </li><li> Templ örneğin, tek birim aktivitesi elde etmek için mevcut çivi sıralama yazılımı kullanarakSpike2 yazılımı (Şekil 3) dahil olarak eşleştirme tekniklerini yedik. </li><li> Daha fazla analiz için (Şekil 4) veya Temel Bileşen Analizi (PCA) için nüfus vektörleri hesaplamak için (Şekil 5) piyasada mevcut yazılımını kullanarak koku yanıtları ortalama tek bir birim hesaplamak için ayıklanır birimlerinin zaman damgalarını kullanın. Ayrıca tek bir birim ve nüfus yanıt gecikme analiz etmek son yayınları 1,2,25 karşılaştırın lütfen. </li></ol> 5.. Bağıl Elektrot Pozisyon Görselleştirme (Şekil 4) <ol><li> Alexa 568 veya Alexa önce kayıt deneyler için 0.5 M potasyum klorid solüsyonu içinde eritildi 488 hydrazide% 5 hydrazide% 5 ya da bir çözelti içine elektrotlar ipuçları batırın. </li><li> Arı Ringer çözeltisi ile beyin durulayın, deneylerden sonra dikkatlice elektrotları ve kaplama silikon kaldırmak, bezleri ve trakea çıkarın ve tetramethylrhodami minik kristaller eklemekn, dekstran ya da anterogradely ALTS etiket AL içine 1.0 M potasyum asetat içinde çözülmüş,% 5 solüsyonu ekleyin. Karanlıkta aşağıdaki adımları uygulayın. </li><li> Boya içine alındı ​​ve bir 30-45 dakika daha arı Ringer çözeltisi ile üç kez beyin yıkanmasından önce, aksonal yolları (30-45 dakika) (Şekil 4A) boyunca çıkıntı nöronlar tarafından taşınacak izin verin. </li><li> Immobilizasyon kadar buz üzerinde arı soğuk ve dikkatle kafa kapsülden beyin kaldırmak. % 4 formaldehit ihtiva eden bir 0.1 M PBS çözeltisi içinde durulama beyin sabitleştirmek ve 4 ° C de bir gece tutmak </li><li> 0.1 M PBS (her biri 10 dk) &#39;de beyni, iki kez yıkamadan önce en az 12 saat bekleyin. </li><li> % 0.2 &#39;in 20 dakika boyunca 3 kez yıkayın beyin Triton artan bir alkol serisi (% 30,% 50,% 70,% 90,% 95,% 100 etanol 3x, 20 dakika içinde dehidrasyon önce 0.1 M PBS içinde seyreltilmiş X-100 her adım). </li><li> Bir mikroskop lamı ve s metilsalisilat de susuz beyin gömBir kapak slayt ile eal. </li><li> Bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın ve bir harmonik Bileşik Planı Apochromat objektif (10X 0.4 NA daldırma) kullanarak her 2-5 mikron optik bölüm olarak beyin tarayın. 568 nm dalga boyu için tetramethylrhodamin dekstran ve elektrot konumu için 488 nm&#39;lik bir dalga boyu kullanılarak doku harekete geçirir. </li><li> Rekonstrüksiyon yazılımına (örneğin. AMIRA veya Fiji) (Şekil 4) ile 3D görüntü yığınlarından gelen lekeli beyin yapıları ve elektrot yolları yeniden. </li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bu makalede, üretim ve özel tasarlanmış çok kanallı mikro tel elektrotların kullanımını gösterir. Tarif edilen elektrotlar bir birim ve (ayrıntılar için bkz 1,2,25) bir numune içinde gecikme ölçümleri ve farklı nöron ve farklı neuropils diğer geçici yanıt özellikleri için özellikle yararlıdır nüfus aktivitesini kayıt için uygundur. Ayrıca biz kalıcı güne kadar saat sürecek bal arıları davranıyor istikrarlı, uzun süreli kayıtları izin mikro tel elektrotları nasıl uygulanacağını göstermiştir. Ekstrasellüler çoklu birim kayıtları mekansal bilgi ile birlikte yüksek zamansal çözünürlük elde etmek için olumlu bir araç haline geldi. Bizim durumumuzda, bu paralel nöronal yolları 2 ya da iki farklı neuropils 1. ya vardır. Çoklu nöronlar paralel tek nöron düzeyinde ve yüksek zamansal çözünürlükte kayıt ve analiz edilebilir. Çoklu-birim rekor41 - bulgular ilk böceklerin 39 da daha sonra memelilerde 38 uygulandı ve edilmiştir. Önemli ilerleme dışı çoklu kanal kayıt teknikleri 42,43 geliştirilmesi ve iyileştirilmesi ile elde edilmiştir. Bu, örneğin, yeni elektrotlar 44 veya roman başak sıralama ve kümeleme algoritmaları 45 geliştirme içerir. 48 - hücre-dışı çok üniteli bir kayıt teknikleri genel yöntemler de 46 tarif edilmiştir. Bu videoda gösterilen kendini inşa elektrotlar ayrıca daha elektrot başına microwires veya mikro teller uçları arasındaki ölçülebilir sürekli mesafeleri kazanmak için bükülmüş olabilir ekleyerek adapte edilebilir. Her iki prosedür, ancak, esneklik azaltılması ve elektrot kalınlığı artan yol açacaktır. Yaygın şahin güve, keçiboynuzu ve hamamböceği 40,49 gibi çok daha büyük böcekler dışı kayıtlar için kullanılan silikon sondalar karşılaştırıldığında - </sup&gt; 51 tarif edilen mikro tel elektrotlar esnek, daha küçük olan ve potansiyel beyin hareketleri ile kolayca başa çıkabilir ve bu nedenle, güvenilir bir şekilde daha geniş bir davranış gösterir repertuar arı ve karıncalar gibi küçük sosyal böceklerde kullanılabilir. Tanımlanan mikro teller, yuvarlak esnek ve daha küçük ve hedefi uzun çalışma için ise açık bir avantajdır çevredeki dokuya dolayısıyla daha az zararlı iken çoğu silikon sondalar, onların ekleme kanal boyunca akson ve sinir dokusunun kesilmesi gibi yapıları keskin incik var bir sağlam ve davranışlar hayvan vadeli plastisite. Mikro tel elektrotlar diğer bir avantajı da düşük maliyetli üretim ve kolay kullanımıdır. Bunun yerine dikkatle pahalı silikon sonda temizlik elektrot telleri taze, bu nedenle tıkanıklık olmaması sorunları önce beyin ekleme için kesilir ve. Bundan başka, her iki farklı neuropiles 1 o eklenen aynı hazırlanmasında birden fazla mikro tel elektrot kullanmak mümkündürr yolları 2 biz burada göstermek gibi. Bu yaklaşım, farklı nöral işleme düzeylerde tepki gecikmeleri ve etkileşimler gibi zamansal yönlerini analiz etmek ve karşılaştırmak için özellikle olumludur. Biz bir hücre dışı kayıtlı sinyal başına tek hücre aktivitesini yansıtmadığını bilincindeyiz. Her zaman, elektrot ucu etrafında gerilim etkinliğinin bir bileşiktir. Bir elektrot içinde iki komşu kablo mikro kanallar fark her zaman hesaplanan sinyalinin kaynağını tam olarak belirlemek için. Böylece tek ünite aktivitesini ayıklamak için kullanılan başak sinyalleri için kaynak her zaman bir ya da kolayca ayırt başak dalga şekilleri sonuçlanan diğer elektrot kanala ya da çok yakındı. Uzağa gelen sinyaller, komşu neuropils kas aktivitesi veya etkinlik gibi, karşılaştırılabilir şekilleri ve genlikleri çağrıştıran, aynı anda hem elektrotlar ulaşmak ve bu prosedür ile atılır. Spike2 şablon uygun teknik kullanılarak,Biz aynı değildir tek ünite aktivitesini elde etmek çok emin, ama tek bir nöron aktivitesi için çok yakındır. Ancak, başak sıralama sorunu hücre içi kayıt teknikleri kullanılarak önlenebilir. Keskin elektrotlar veya yama pipet ile ya tek hücre kayıtları, tek bir nöronun fizyolojik özellikleri hakkında derinlemesine bilgi sağlar. Bununla birlikte, küçük bir böcek nöronların büyüklüğü ve nöritlere (arı PNS 52 için, örneğin., En az 1 um), sadece kısa vadeli kayıtları yönetilebilir. Ayrıca, hücre içi kayıtları invaziv olabilir ve muhtemelen zamansal sınırlamalar için bir başka nedendir hücreyi zarar olabilir. Böceklerde in vivo hücre içi kayıtları nadiren bir saat dayanmak. Tek bir tespit nöronun, ventral çiftleşmemiş maxilar nöron # 1 (VUMmx1) dan hücre içi kaydedilen Martin Hammer 53 öncü çalışmaları için yeterli bir zaman penceresi. O l olabilirdoğrudan ödül yoluna mürekkep aktivitesini. Juliane Mauelshagen 54 hücre bir tespit mantar vücut dış nöron aktivitesini kayıtlı, klasik koşullanma sırasında pedunculus dış nöron # 1 (PE1). Onlar Kenyon Hücreler elektriksel stimülasyon sonra LTP bulduğumda aynı nöron Menzel ve Manz 55 odağı oldu. Ancak, Okada ve arkadaşları 56 ekstraselüler kayıtlar sırasında Pe1 tanımlanması için hücre iyi karakterize spike desen (çift ve üçlü ani) kullanabilirsiniz. Her iki yöntemin her bir kombinasyonundan sonra tespit nöronlar ve dışı uzun süreli kayıtlar hücre içi kayıtları gelecekteki araştırmalar için güçlü bir araç olabilir. Ancak, zamansal tepki ilişkileri ve / veya hatta plastik değişiklikleri analiz etmek güne kadar birçok saat boyunca farklı işleme seviyelerde aynı anda birden fazla hücre (adet) kaydetmek için keskin elektrotlar kullanan ineredeyse imkansız. 62 - ilk kalsiyum görüntüleme kalsiyum duyarlı boyalar kullanarak balarısı 57,58 yaklaşımları ile koku yanıtların mekansal desen analizi 59. erişilebilir. Ancak, birçok durumda kalsiyum duyarlı boyalar tekrar arının ömrü ve analiz hücrelerin içsel özellikleri sınırı invaziv manipülasyonlar yoluyla beyin dokusu tanıtılacak olması. Bu sorun, genetik tanıtıldı kalsiyum sensörleri 63,64 kullanarak meyve sineği gibi diğer model organizmalar aşılır. Büyük olasılıkla koku tepkilerin geçici özelliklerini etkileyen kalsiyum tampon olarak hareket edebilir Ancak, genel olarak, kalsiyum algılayıcılar başka sınırlamalar taşıyabilirler. Kalsiyum görüntüleme veya hesaplamalı yaklaşımlar ile birlikte eşzamanlı hücre içi kayıtları görüntüleme uygun zamansal çözünürlük 65,66 işler kanıtlayabilirim. Bununla birlikte, görüntüleme işlemi kendi zamansal çözünürlüğü olan rather sınırlıdır. 2-Foton-Görüntüleme hızlı dizileri 68 elde etmek mümkün olabilir ancak optik toplama sistemleri genellikle, 5-20 Hz 67 bir zamansal çözünürlüğe sahip CCD-görüntüleme kullanın. Ancak, artan örnekleme oranı her zaman uzamsal çözünürlük kaybı ile birlikte gider. Ayrıca honeybee kullanılan kalsiyuma duyarlı boyalar da elde etme süresi 69 azaltan ağartma, geçer. Böceklerde diğer fizyolojik kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında bizim esnek çoklu-kanal mikro-tel elektrotlar tek ünite ve arılar davranıyor nüfus nöronal aktivitenin uzun süre erişim sağlamak. Biz farklı kayıt siteler arasında zamansal kodlama yönlerinin analizini kolaylaştırır aynı hayvan, farklı işleme aşamalarında bu elektrotların ikisini nasıl kullanılacağını gösterdi. Araştırma sorunu ve burada gösterdiği elektrot binanın temel yöntemi böcek modele bağlı olarak kolayca genişletmek edilirmümkün ve / veya adapte edilebilir. Örneğin, bu çok kanallı elektrotları oluşturmak için üç adet tek teller fazla kullanmak düşünülebilir. Buna ek olarak, kayıt sitelerinin sayısı genişletilmiş ve ikiden fazla ya da yolları neuropils zamansal açıdan gözlemlemek mümkündür edilebilir. Temennimiz bu yöntem pek çok bilim adamı ilham kaynağı olacak ve küçük beyinleri gelişmiş nöronal işleme anlayışına olumlu katkı olacaktır.

Bal arısı gibi diğer birçok böcekler ağır olfaction güveniyor. Diğerlerinin arasında bu yönelim, çiftleşme, conspecifics ile iletişim ve yiyecek aramak için koku ipuçlarını kullanın. Onların iyi oluşturulmamıştır koku sistemi çiçek koku uyanlarla ilişkili öğrenme davranışları zengin bir repertuar katkıda bulunmaktadır. (- 5 incelemesi 3 bakınız) Bu davranışlar kolayca kontrollü laboratuvar koşullarında ele alınabilir. Nöron nispeten küçük numaralar ile onların &quot;mini beyinleri&quot; (krş. 6) balarısı koku kodlama eğitim ve nöral aktivitenin izlenmesi sırasında öğrenme için de uygun bir model organizma yapar. Böcekler hem de memelilerde koku alma sistemi (7,8 inceleme için bakınız) büyük ölçüde benzer organizasyonunu göstermektedir. Bal arılarında yılında anten 10,11 boyunca sensillae bulunan yaklaşık 80.000 reseptör nöronlar 9 neur içine çevre koku uyaran çevirmekÖnal sinyali. Olfaktör reseptör nöronlardan gelen aksonlar omurgalı koku ampul karşılaştırılabilir bir glomerüler organizasyona sahiptir antennal lobu (AL), innerve. AL 4000 yerel internöronlar (LN) ile birbirleri ile bağlantılı yaklaşık 164 glomerül içerir (inceleme için 12). Özellikle balarısı o LN yamalı yanal bağlantı sağlamak ve farklı subpopülasyonunun element ve configural koku kodlama özelliklere 13,14 sahip olduğu son zamanlarda kanıtlanmıştır. AL medial ve lateral antennal lob yolu (m-ve l-ALT sebebiyet veren bir ventral ve dorsal hemi lobun bölünerek gösterilmiştir; eskiden m-ve medial-lateral antennal lob protocerebral l-APT olarak adlandırılan ) 15-17 cezbet. İşte böcek beynin bir birleşik adlandırılması için yeni bir çaba tarafından tanıtılan yeni bir sistem terminoloji 18 kullanılacaktır. Her iki ALT basılı (l-ve m-ALT) 410 (l-ALT) veya 510 (m-ALT) uniglomerular Proje ya da kombinection nöronlar (PN), sırasıyla 15,16,19. Her iki yollarında PNS son zamanlarda (inceleme için 17,20 bakınız) paralel 2 kod koku gösterilmiştir ve hem yolları synaptically Kenyon Hücreleri (KC), mantar gövde (MB) anapara nöronlar ile farklı bağlantıları oluşturur. 23 - Her MB yaklaşık 172.000 kcs 21 içerir. MB uyarıcı entegrasyon, öğrenme ve hafıza oluşumunda rol oynadığı bilinmektedir. Vertica veya alfa-lob ve yatay veya beta-lob 22,24: keratinosit karsinom axo dentritler iki ana çıkış bölgeleri var pedinkülde (mantar kök) oluşturur. MB çıkışı sadece yaklaşık 400 dış nöronların (EN) 24 yakınlaşıyor. Koku bilgi işleme sorumlu çoğunlukla dikey lobun 22 ventral innerve ens. Son zamanlarda, bu alanda kaydedilen Ens&#39;i koku ödül ilişki 25 kodlayan gösterilmiştir. Olarak Temporal29 - böcekler gibi omurgalıların koku alma sistemi içinde cevapların dağılımı potansiyel kodlama ilke 26 gibi önemli ve anlamlı bir yönü haline gelmiştir. Aynı anda yüksek temporal çözünürlük farklı sitelerden birden nöronlar kayıt yapabilmek için, biz arı koku sisteminde farklı hedef bölgelere tanıtıldı özelleştirilmiş çok kanallı tel elektrotlar kullanılarak çift çoklu birim kayıt tekniklerini kurulmuştur. Bu yaklaşım tek nöronların ve ya paralel koku yolları, ikili koku yolunun 2 veya farklı sonraki neuropils 1 arasında var nöronların popülasyonlarının düzeyinde balarısı koku sisteminde zamansal işleme, analiz ve karşılaştırma için bize sağlar. Son zamanlarda elektrotlar farklı bir yapılandırma kullanarak çekirge koku alma sistemi 30 benzer bir deneysel yaklaşım ile plan-değişmeyen koku tanıma 31 için zamanmekansal kodlama mekanizmasını analiz başardık. ThBize, kurulan ikili kayıtları eşzamanlı nöronal aktivite profilleri hakkında mekansal bilgi toplama etkinleştirin. Kalsiyum görüntüleme elde geniş uzamsal örnekleme göre bu yöntem sadece iki noktalar kaydedilmesini sağlar. Bununla birlikte, kalsiyum görüntüleme tekniklerine göre avantajı ise, geleneksel CCD görüntüleme ya da 2-ya da foton görüntüleme satın tarafından temin edilemeyen bir eylem potansiyeli kayıtlarında, yüksek zamansal hassas olduğunu. Burada tarif edilen hücre dışı bir sürekli olarak implante elektrotlar ve elektrot sürüklenme kaçınarak, beyin ve kafa kapsül göre sabitlenir. Bu keskin hücre içi elektrotların kullanımı ile karşılaştırıldığında açık bir avantajdır. Hücre içi kalsiyum kayıtları ve görüntüleme kıyasla diğer bir avantajı, çok saatler güne kadar değişen uzun bir gözlem sinir zamandır. Bu öğrenme ve bellek oluşumu sinirsel araştırmak için önemli bir ön koşuldur. Çok ek faydalarbirim kayıtları ayrıca tartışma bölümünde özetlenmiştir. Bu metodolojik genel olarak özel tasarım tel elektrotlar imalat prosedürü, gösterilir 32,33 uyarlanan ve balarısı beyinde uzun süreli çoklu birim kayıtları için uygundur. Buna ek olarak, bu tür elektrotların sürekli olarak aynı anda kaydetmek üzere bal arısı koku alma sistemi içinde iki farklı kaydına implante nasıl bir örnek L-ve çok stimülasyon protokolleri izin vermek için, uzun süre boyunca m-ALT 2 gösterilmiştir. Kayıt pozisyonların doğrulanması için kayıt sitelerin boyama ve sonrası kayıt görselleştirme için bir örnek ve protokol sağlanır.

<table><tbody><tr><td>Parafin yağı</td><td>Fluka</td><td>76235</td><td></td></tr><tr><td>Kokular</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>%4 Formaldehit</td><td>ThermoScientific</td><td>28908</td><td>Metanol içermez</td></tr><tr><td>Triton X</td><td>BioChemica</td><td>A1388</td><td></td></tr><tr><td>Metilsalisilat</td><td>Roth</td><td>4529.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamin dekstran, 10.000 MW (Mikroyakut)</td><td>Invitrogen</td><td>D7162</td><td>karanlık tutmak</td></tr><tr><td>Alexa 488 hidrazid</td><td>Invitrogen</td><td>A-10436</td><td>karanlık tutmak</td></tr><tr><td>Alexa 568 hidrazid</td><td>Invitrogen</td><td>A-10437</td><td>karanlık tutmak</td></tr><tr><td>Arı Zil Çözeltisi</td><td>bakınız Brill et al.2</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poliüretan kaplı bakır tel</td><td>Elektrisola</td><td>15 &mikro; m çap & P155 izolasyon</td><td></td></tr><tr><td>Diş Balmumu&nbsp;</td><td>Densply Detrey</td><td>64103015S1</td><td>orta erime noktası</td></tr><tr><td>Dental Balmumu</td><td>Flexaponal&nbsp;</td><td>124-202-00</td><td>düşük erime noktalı Balmumu</td></tr><tr><td>KWIK SIl</td><td>WPI</td><td>03L</td><td></td></tr><tr><td>18 Pimli Soket</td><td>Conrad Elektronik</td><td>189634-62</td><td></td></tr><tr><td>Sıcak eritme tutkalı</td><td>Conrad Elektronik</td><td>827673</td><td></td></tr><tr><td>Lehimleme iğnesi</td><td>Conrad Electronics</td><td>830283</td><td>12 V</td></tr><tr><td>Lehimleme terminali pabucuğu&nbsp;</td><td>Conrad Elektronik</td><td>531901</td><td></td></tr><tr><td>Glaselektrotlar</td><td>WPI</td><td>1B100F-3</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26002-20</td><td>V2A 0,2 x 12 mm</td></tr><tr><td>Değiştirilebilir headstage</td><td>Tucer Davis Technologies</td><td>SH16</td><td></td></tr><tr><td>Headstage bağlantı modülü</td><td>NPI</td><td>INT-03M</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör Modülü</td><td>NPI</td><td>PDA-2F</td><td></td></tr><tr><td>Veri Toplama panoları</td><td>National Instruments</td><td>NI-6123, Ni-6143</td><td></td></tr><tr><td>Acquisition Yazılımı</td><td>National Instruments</td><td>Lab View 8.2</td><td>özel tasarım</td></tr><tr><td>Spike-Sorting&nbsp;</td><td>CED&nbsp;</td><td>Spike 2 v7.11</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>R2008B</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Leitz</td><td></td><td>manuel</td></tr><tr><td>AG-teller</td><td>WPI</td><td>AGT05100</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Leica</td><td>TCS SP2 AOBS</td><td></td></tr><tr><td>AMIRA</td><td>Mercury Bilgisayar Sistemleri&nbsp;</td><td>2/5/2000</td><td></td></tr></tbody></table>

davranan bal arısı iki nöronal İşleme dönemlerinde eşzamanlı uzun vadeli kayıtlar

Simultaneous Long-term Recordings at Two Neuronal Processing Stages in Behaving Honeybees

Memeliler ve böcekler hem de nöronal bilgiler farklı yüksek ve düşük seviyede beyin merkezlerinde işlenir. Bu merkezler yakınsak ve ileri besleme ve geri besleme kabloları dahil olmak üzere farklı anatomik bağlantıları yoluyla birleştirilir. Ayrıca, aynı menşe bilgisi kısmen farklı ve bazen aynı beyin alanlara paralel yollar aracılığıyla gönderilir. Bu kablo stratejileri ve birbirlerine özellikle geçici bağımlılıkları evrimsel yararları yanı sıra sayısal avantajları anlamak için, bu yüksek zamansal çözünürlükte Aynı müstahzar içindeki değişik yolları veya neuropiles tek nöron eş zamanlı erişim için gereklidir. Burada iki müteakip neuropiles 1, antennal lobun (AL), ilk koku işleme aşamasında ve mantar gövdesinin (MB), daha yüksek dereceden entegrasyon merkezi invo multi ünite aktivitesini kaydetmek için eşsiz bir hücre dışı uzun süreli erişim göstererek bal arıları üzerinde yoğunlaşmaköğrenme ve bellek oluşumu, ya da MB ile AL bağlayacak iki paralel nöronal yolları 2 lved. Ikinci bir örnek olarak seçilmiştir ve tam bir şekilde tarif edilecektir. Destekleyen video inşaat ve esnek çok kanallı teli kalıcı ekleme gösterilmiştir. Mikro telidir kanalları İkili diferansiyel amplifikasyon ölçüde gürültüyü azaltır ve sinyalin kaynak yakın elektrot ucunun konumu ile ilişkili olduğunu doğrular. Kullanılan tel elektrotlar mekanik esneklik sağlar: istikrarlı, uzun vadeli invazif kayıtlar çok saat boyunca, geleneksel olarak ilave ve hücre içi vivo kayıt teknikleri ile karşılaştırıldığında açık bir avantaj olan gün kadar.

&quot;Mevcut protokol bireysel arıları içinde iki farklı işleme aşamalarında eş zamanlı kayıtlar sağlar ve ayrıca örneğin yoluyla öğrenme ve hafızanın altında yatan mekanizmaları test etmenize olanak sağlar., Ölçülü bal arıları içinde klima PER.&quot; Bu nöronal işleme zamansal yönlerini analiz etmek için bir ön koşuldur. Farklı bilimsel yaklaşımlar arının koku alma sisteminin nöronal ağı çözülmeye için yöntem kolaylıkla uyarlanabilir. Örneğin, bu yöntem honeybee ikili koku yolunun, l ve m-ALT PNS (Şekil 5) içinde PNS zamansal işleme analiz etmek için, (i) kullanılır. Şekil 5A aynı anda m-ALT bir PN ile kaydedilen bir l-ALT PN bir örneği on deneme ortalaması olarak verilen ve renk kodlu ısı komplo olarak beş farklı koku konsantrasyonları açısından tepki gücü ve gecikmeyi göstermektedir edilir. 11 l-ve 13 mA ile yedi arıların bir ortalamaLT PNS (Şekiller 5B, 5C) tepki gücü hem de cevap gecikme hem de belirli bir dereceye kadar, odorant konsantrasyonunu yansıttığını göstermektedir. Artan Odorant konsantrasyon ile cevap gecikmesi (Şekil 5B, 5C) azalırken, böylece bu örnekte PNS tepki gücünü artırmak. Bu sonuç oldukça sınırlı ve analiz koku verici madde için geçerlidir, ama yine AL 37 son hesaplama modelleri ile uyumludur. Arının AL koku konsantrasyonu kodlama lineer olmayan hesaplamaları yatan ya da diğer kodlama özellikleri hala gelecekte analiz edilmesi gerekir temelini olsun. Ayrıca yöntem, (ii) iki daha sonraki işlem aşamalarında, AL ve MB-çıktı (Şekil 6) en nüfus aktiviteye zamansal açıdan karşılaştırmak için kullanılabilir. Temel bileşenler analizi (PCA) koku hesaplama uzun ve PN düzeyde tüm koku tanıtımı dayanmak olduğunu göstermektedir oysa ENSette ve kapalı yalnızca koku nüfus aktivitesi (Şekil 6) olarak temsil edilmiştir s. PN aktivite hala (krş. Film 1) gelişmekte olan zaman böylece EN nüfus bir zaman noktasında zaten maksimal aktivitesini ulaştı. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig1highres.jpg" width="400" /> ... Şekil 1. Üç kanallı mikro-tel elektrotları İmalat A1) üç tellerin uçları Pozisyonlar 11, 13 ve 16 A2) Dört lehim pabuçları bir pleksiglas plastik taban plakası üzerine vidalanır bir IC pin konnektör lehimli; Bir minutien pim daha sonra plastik levha. A3) plastik levha, bir IC pim bağlantısı ve her telin serbest ucu üstüne yapıştırılır bağlanmış bir cam boru ucuna sokulur En iyi lehim birine lehimlenmiştir pabuçlar. &lt;İnce bakır teller ile elektrot tutucu donatmak strong&gt; B1), kılcal sahibinin baz daha sonra cihazı hizalanması özel yapılmış sabittir) bir kez daha. B2 dışarı alınmalıdır. . Üç bakır mikro teller B3) paralel mikro teller diş balmumu ile yapıştırılır ve kılcal yerde (uzun oklar) geri koymak her ucunda oluk boyunca hizalanmış ve yapışkan bant ile sabitlenir; yapıştırılmış mikro teller daha sonra bakır teller üç gevşek uçları, böylece elektriksel temas içine getirilmesi üç üst lehim pabuçları lehimlenmiştir diş balmumu ve uçları (kısa oklar) kesilir. B4) ile kılcal bağlıdırlar IC pimli konektör. C1) tam olarak monte iki elektrot, bu amaç için, tek bir headstage. C2) ile kullanılmak bir elektrot (sol, slave) ve pimler doğru (diğer elektroda yalıtılmış kablo ile bağlanır için birbirine bağlanabilir direk) er, burada kafa aşamasına bağlıdır; headstage bağlı elektrot da bir kas (M17) ve referans elektrot (Ref) girdi toplayabilirsiniz. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2,. Hazırlanması ve arı beyin içine sürekli elektrot yerleştirme. A) arı buz üzerinde hareketsizleştirme sonra Plexiglas tutucu içine sokulmaktadır. Flagellum (FL) ve Scapus (SC) ile anten kafa) B. Gösterilir ve antenler diş balmumu kullanılarak tespit edilir. C) baş kapsülü traş edilir ve arı) şekerli su. D ile beslenen kafa kapsülü açıldı. E) beyin üstünden bezleri ve trakea çıkarılmasından sonra, farklı neuropiles ve başlıca yerler kolayca ayırt edilebilir. Alts yörüngeleri ile birlikte gösterilirelektrotlar yerleştirilir bir işareti. (MB: Mantar vücut, AL: Antennal lob, OL: Optik lob, α: Alfa lob veya dikey lob, ALT: antennal lob yolları, E1: m-ALT kayıtları için elektrot yerleştirme tarafı, E2: l-ALT için elektrot yerleştirme yan kayıtları). F) Başvuru (Ref) ve kas elektrotlar (M17) sonra manikür veya bileşik göz. G) tel elektrotlar uygun siteler. H de beyin içine sokulur) küçük deliklerden baş kapsülü içine sokulur iki bileşenli silikon kullanarak yerine elektrotlar sabitleme, arı hala PER gösterir ve klimalı (örn.., şeker su kullanarak). <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" width="500" /> Iki nöral yolları ve tek ünite ekstraksiyon (başak sıralama). Bir de Şekil 3.. Ekstrasellüler kayıt </strong&gt; deney düzeneği) şematik çizim. Arı bir pleksiglas tutucuya sabitlenmiş durumdadır. Koku stimülasyon bir cam tüp ile sağlanmaktadır. İki elektrot sap maruz arı beyinden kayıt edilmiştir. B) bir konsantrasyonda su çözeltisi içinde bal bir 500 msn koku uyarılması için her iki yolları ile ilgili uyarıcı yanıt gösteren l-ve m-ALT PNS (yeşil ve mor izleri) gelen eş zamanlı kayıtları 1:100, en 33 ° C. Her çizilen çizgi A Bar&#39;da elektrot lehim pabuçları renk kodlu etiket olarak farklılaşmış kanallarını temsil eder: tek aksiyon potansiyelleri kriteri ve renk kodlu 50 mV C) başak sıralama işlemlerinden sonra.. Sıralanan birimlerinin Yerleşimi dalga ayrılmasını göstermektedir. D) Spike aralık histogram yeterli başak sıralama kanıtı olarak sıralanmış birimlerinin ayrılması kalitesini gösterir. Ünitenin refrakter dönem içinde herhangi bir başak olduğunu unutmayın. E) İki Defa (E1, E2)birbirine sıralanmış birimlerinin mesafeyi gösterir, temel bileşen analizi ile sıralı biriminin 3D kümeleme. Çemberler uzayda SD ve benzer) Renk kodlu birimleri tek yolu kayıt üç kanalları büyütme görünür aksiyon potansiyelleri tasvir ana bileşen uzay F kümelerin önemli bir farklılaşma gösterir 2.5 kat Mahalanobis mesafeyi belirtir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig3highres.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. Post-kayıt görselleştirme ve kayıt konumuna 3D-rekonstrüksiyon. Bir antero maksimum yoğunluğu hizalama ile z ekseni boyunca orto-dilimlerinin A) Projeksiyon görünüşüdürve MB ve LH AL çıkıntı uniglomerular projeksiyon nöronlarının retrograd dolgu. Hücre içi tracer Microruby (tetramethylrhodamin dekstran) kayıt deneylerden sonra AL sokulmuştur. Alexa olan iki elektrot bir boyama maksimum yoğunluğu hizalama ile z ekseni boyunca orto dilimlerin AL kanıtı uygun PN lekeleme. B) projeksiyon görüntüsü içindeki lekeli glomerül m-ALT (E1, ok için elektrot yerleşimini gösteren 488 hydrazide ) ve l-ALT (E2, ok). İzleyici Alexa hydrazide 488, elektrot çevresindeki dokuya göç ve elektrot yerleştirme sitesi boyar. AL belirgin boyama birlikte balarısı koku alma sisteminin (şematik bir bakış ile yüzeysel bir eser lekeli hedef hücreler (PNS). C) 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve A, B (sağ taraf gelen elektrot ekleme site), Not sol l-ve m-ALT yörüngeleri göstergesi yan). Sadece uniglomer, Notular PN yolları gösterilmiştir. AN: antennal sinir, AL: antennal lob, LH: yan boynuz, MB: mantar gövde, E1, E2: elektrot ekleme siteleri, m-ALT: medial antennal lob yolu, l-ALT: yanal antennal lob yolları, c: kaudal, r: rostral, m: medial, l:. yanal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51750/51750fig4highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51750/51750fig5highres.jpg" width="300" /> Koku yoğunluğu kodlama Şekil 5,. Örnek çift koku yol içinde. A) ısı araziler tek l-ALT (yeşil tepkisini göstermektedir) ve tek m-ALT PN (Mor) koku verici madde tepki olarak tek bir honeybee aynı anda satın (10 -6 1:100 1 ilâ) koku Artan konsantrasyonlarda heksanal. Her satırı on deneme stimülasyonu bir ortalamaulation. Ateşleme hızı 7 kaydedildi arılar 11 l-ve 13 m-ALT PNS. B) Nüfus tepki gecikme çıkarılır spontan aktiviteye ilişkin ateşleme oranı göreceli yoğunluk değişim olarak gösterilir. Her arı hem sistemince PNS aynı anda kaydedildi. Nüfus cevap gecikmesi hem sistemince PNS koku konsantrasyonu artan azalan bir gecikme gösterir. 99 msn de antenlerden de koku tepki başlangıçlı electroantennograms aracılığıyla kaydedildi ve PN tepki gecikmeleri çıkarılır. Tepkiler gecikme ölçümleri için çok zayıftır ve bu nedenle, tepki gücü artmaktadır koku artan konsantrasyon ile B&#39;de olduğu gibi aynı PNS ateşleme hızı. C) nüfus yanıt alınmadı düşük konsantrasyonlarda unutmayın. L-ALT daha güçlü bir tepki kuvvetini gösterir. B, C, ortalama ve SD verilmiştir. <img alt="Şekil 6," fo:content-width = &quot;5in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51750/51750fig6highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Şekil 6,. Bal arısı en koku yolu boyunca iki daha sonraki işlem aşamalarında nüfus aktivitesi ile karşılaştırılması. Veriler 1-heksanol ve 2-oktanon. A) ile uyarıldı 20 hayvanlarda kaydedildi her satır yanlış renk kodlu bir çıkıntının ortalama ateşleme hızı temsil eder nöron (PN) 1-heksanolün 10 koku tekrar karşısında hesaplanmıştır. Koku sunum 0 zamanda başlar ve üç saniye. B sürdü) A&#39;da olduğu gibi aynı gösterir) ama mantar vücut dış nöronların (EN) için. A &#39;de gösterilen matris) 1-hekzanol ile koku uyarılması sırasında bir PN nüfus vektörü olarak görülebilir. Biz 2-oktanon ile koku uyarılması sırasında nüfus vektörü aynı tür hesaplanır ve zamansal boyut. C tutarak bir temel bileşen analizi hem vektörleri (PCA) kullanılan) ilk üç temel bileşen (PC1, 2 ve 3) idiantennal lob çıkışında PN grup etkinliği olarak koku ayırma göstermek için birbirlerine karşı çizilmiştir. Koku başlamasından önce zaman siyah işaretlenir. 1-heksanol ile uyarma üç saniye boyunca mavi aktivitesi gösterilmiştir. 2-oktanol ile uyarılması esnasında aktivitesi kırmızı gösterilir. Ayrıca, 1-hekzanol (açık mavi) ve (pembe) 2-octanonen kümesi koku sonra aktivitenin 1.5 saniye (post) göstermektedir. PN topluluk düzeyinde çok farklı yörüngeler çağrıştıran hem de kokuları &quot;sabit nokta&quot; outlasts bütün koku uyarımı döneminde yerleşmek unutmayın. Koku ofset sonra yörüngeleri koku uyarımı olmadan geri temel aktiviteye taşıyın. D) Aynı analiz mantar vücut çıkışında faaliyeti temsil EN topluluk düzeyinde yapıldı. PN aktivitesine kıyasla kokuları daha az belirgin yörünge çağrıştırıyor. Ayrıca bir &quot;sabit nokta&quot; gözlemlenebilir değildir. Başlangıçta koku kaynaklı yörüngeleri intekoku hala mevcut olsa da başlangıç ​​etkinliği ile rmingle. Ofset yalnızca, koku ilave bir yörünge uyandırdı. <a href="/files/ftp_upload/51750/Movie_R3_Brill_et_al._JoVE.avi" target="_blank">. Movie 1</a> Zaman PN-nüfus vektörü (solda) ve EN nüfus vektörü temel bileşen analizi sonra bir koku uyarılan yörünge değerlendirilmesini çözüldü. (. hakkı; cp Şekil 6) üst kısımları ilk üç temel bileşeni (PC1 içerir 2 ve 3) birbirlerine karşı çizilmiştir. Daha altta olan paneller zaman içinde PC1, 2 ve 3&#39;ün değerlendirilmesini göstermektedir. Koku stimülasyon gri çubuk ile işaretlenir. Tüm paneller senkronize edildi. EN nüfus etkinlik PN nüfus etkinlik öncesi biraz başlayacağını unutmayın, contraintuitive gibi görünüyor ama bir fenomen bağlantısı ve önceki 1 tartışılmıştır ilgili katmanları, özellikleri ile açıklanabilir.

İki farklı beyin neuropiles veya iki farklı anatomik yolları eşzamanlı dışı uzun süreli kayıtları arıları kuruldu. Bu kayıtlar farklı beyin bölgelerinde tek nörona yanı sıra davranıyor hayvanda topluluk düzeyinde karşısında nöronal işleme zamansal açıdan soruşturma izin.

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

In both mammals and insects neuronal information is processed in different higher and lower order brain centers. These centers are coupled via convergent ...

Bu prosedürün genel amacı, davranış gösteren bal arılarında iki bağımsız nöronal işleme aşamasına uzun süreli erişim sağlayarak koku kodlamasını ve bellek oluşumunu incelemektir. Bu işlem, öncelikle yalıtılmış bakır mikro tellerden ve özel yapım tutuculardan düşük maliyetli çok kanallı elektrotlar monte edilerek gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, floresan boya ile işlem görmüş iki elektrodun açığa çıkan beyne yerleştirilmesi için baş kapsülünün bir bölümü çıkarılarak canlı bir bal arısının hazırlanmasıdır.Üçüncü adım, floral kokular ve feromonlar ile stimülasyon uygularken, olfaktor yolaktaki iki bağımsız nöropil veya traktattan kayıt yapmaktır. Daha sonra, beyin diseke edildikten sonra, hedef nöronları geri doldurmak (backfill) amacıyla anten lobuna farklı bir floresan izleyici enjekte edilir. Ardından, geri doldurulmuş yollar ve elektrot izleri, nöronal mimarinin üç boyutlu bir rekonstrüksiyonunu oluşturmak için görselleştirilir.Nihayetinde, anten lobu ve mantar cismi gibi farklı işleme seviyelerindeki iki nöron popülasyonu arasındaki koku kodlama ilişkileri, bu teknikler kullanılarak daha iyi anlaşılabilir. Dolayısıyla, bu tekniğin mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok kanallı elektrotlarımızın çok küçük olması ve kombinasyon halinde kullanılabilmesidir; bu da sabitlendikten sonra beynin farklı bölgelerinden eş zamanlı kayıt yapabilmemiz anlamına gelir. Esnek teller, davranış sergileyen hayvanlarda birkaç saat boyunca stabil bir kayıt imkanı sağlar.Bu yöntem, hayvanların çevrelerinden koku bilgilerini nasıl aldıkları, algıladıkları ve nihayetinde işledikleri gibi nöropatoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu çift kayıt tekniği, koku kodlamasının altında yatan mekanizmaya ve genel olarak nöronal ağlara dair içgörü sağlayabilir. Ayrıca, omurgasızlar veya etkilenme ve nörobiyoloji ile ilgili diğer model organizmalara da uygulanabilir.Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır çünkü mushroom body'nin internal lobu veya vertical lobu gibi yalnızca morfolojik işaret noktalarını kullanarak bal arısı nöronlarını tanımlamak için yoğun bir eğitim gereklidir. Bu protokol için, standart bir elektrot arayüz kartına uygun bir elektrot adaptörü yapın. İlk olarak, yalıtılmış üç kısa tel parçasını 18 pinli bir konnektöre lehimleyin.Ardından, pleksiglas plaka şeklinde bir parça kesin ve en uzun kenar boyunca sığ bir kanal açın. Sonrasında, pleksiglas plakaya lehimleme terminalleri vidalayın ve plakayı konnektörün üzerine yapıştırın. Daha sonra, üç kısa tel kullanarak tabanı terminallere bağlayın.Ardından, bir cam kapilari plexiglass plakanın oluğuna yerleştirin. Kapilari kaydırılabilir olmalı ve bir vida ile sabitlenmelidir. Hassas bir iğne kullanarak, cam kapilariyi dışarıya doğru yaklaşık beş milimetre uzatın. Kapilari ve iğne, elektrot mikro tellerini desteklemek ve stabilize etmek için kullanılacaktır.Ardından, üç mikro teli konumlandırın. Daha iyi erişim sağlamak için yapışkan bant yardımıyla, cam kapiler 12 voltluk bir havya ucu yapıştırıcısı kullanılarak çıkarılabilir. Teller, LMP dental mum ile birlikte, tellerin son üçte birlik kısmına yapıştırılmaz.Şimdi bu çok kanallı mikro tel düzeneğini elektrot adaptörüne bağlayın. Uzatılmış cam kılcal boruyu mikro tellere paralel olarak konumlandırın. Bu bağlantıyı, üst üste binen cam kılcal boru ve minitür pin boyunca dental mum ile sabitleyin.Ardından elektrot tellerini, minutyen pinden iki ila üç santimetre ve elektrot ucundan iki ila üç santimetre dışarıda kalacak şekilde kesin. Sonra, kapiler tüpü elektrot adaptörüne yerleştirin ve her şeyi sabitlemek için bir vida kullanın. 360 °C'de.Kabloların uçlarını kulakçıklara dik olacak şekilde lehimleyin. Ardından, bir kilohertz'de empedanslarının yaklaşık 300 kilo ohms olduğunu kontrol ederek yeterince güçlü bir elektriksel temas olduğundan emin olun. Şimdi, ikinci elektrot adaptörünün kanallarını ana elektroda bağlayın ve referans ile kas elektrotlarını ana elektrot tabanına lehimleyin.Son olarak, ana elektrodu kafa katı (head stage) arayüz kartına monte edin. Bal arıları buz üzerinde soğutulup immobilize edildikten sonra, ikinci elektrodu ayrı bir adaptöre sabitleyin. Ardından, arıyı baş kısmı açıkta kalacak şekilde standart bir pleksiglas tutucuya sabitleyin.Isıtılmış dental mumu gözlerin tabanına ve baş ile toraks arasındaki bağlantı noktasına uygulayarak başı sabitleyin. Mum kullanarak antenlerin baş kapsülü üzerindeki scape kısmını hareketsiz hale getirmeye devam edin. İleriye doğru bakması gereken flagellum'a mum uygulamaktan kaçının.Pro Bois sıkışma olmadan serbestçe hareket edebilmelidir. Hareket edebildiğini kontrol edin. Şimdi, erişilebilirliği artırmak için baş kapsülünü tıraşlayın.Ardından arıya tüketebileceği kadar %30 sükroz verin. Bu işlem; iyi bir hazırlık, canlılık ve doku nemi sağlar. Şimdi bir mikro skalpel kullanarak, göz sınırına paralel olarak dikey ve anten tabanlarının üzerinden yatay şekilde kesin.O hücresi gözünün altını kesmeye devam edin ve gevşek kütikülü temizleyin. Hipofaringeal bezler ve trake, yana çekilmelidir. Bu işlem, elektrodun yerleştirilmesi için yolu temizleyecektir.İşleme, 35 mikronluk bir gümüş tel olan referans elektrodun yerleştirilmesiyle başlayın. Öncelikle, ipsilateral bileşik göze küçük bir kesik atın. Ardından elektrodu buradan içeri itin.Ardından, ikinci teli lateral O hücresi gözünün altındaki kas projeksiyon bölgesine yerleştirin. Elektrot konumlarını daha sonra görselleştirmek için, elektrotları 0,5 molar potasyum klorür ve %5 Alexa Hydrocyte 4 88 çözeltisine üç dakika boyunca daldırın. Sonra, mikromanipülatörleri kullanarak iki elektrodu beyin içerisine konumlandırın.Mantar vücudunun anten lobunu ve dikey lobunu belirleyerek yönünüzü tayin edin. Burada elektrotların biri 180 mikron derinlikteki lateral anten lobu traktusunda, diğeri ise yaklaşık 300 mikron derinliğe yerleştirilmiş medial anten lobu traktusundadır.Elektrot yerleşimlerini iki bileşen kullanarak sabitleyerek tamamlayın. Silikon, beynin üzerindeki tüm alanı kaplayarak dokuların kurumasını da önleyecektir. Ardından, hücre dışı kaydedilen sinyalden ünite aktivitesini çıkarmak için kayıt işlemine geçin.Mevcut spike sıralama yazılımını kullanın. Farklılaştırılmış elektrot kanallarını kullanın. Tekli spike olaylarını açıklayan farklı dalga formu kombinasyonlarını tespit etmek için üç elektrot kanalının tamamına aynı anda şablon eşleştirme tekniklerini uygulayın.Ve son olarak, uygun birim ayrımı için kontrol sağlayın. Kaydedilen üç farklılaşmış elektrot kanalının tekli spike olayları üzerinde temel bileşen analizi yapın. Kayıtlar tamamlandıktan sonra silikonu ve elektrotları arıdan dikkatlice çıkarın.Ardından, beyni bee ringer çözeltisi ile durulayın ve bezleri ile trakeyi çıkarın. Daha sonra bir mikropipet kullanarak anten lobuna, bir molar potasyum asetatta çözünmüş %5 micro ruby enjekte edin. Bu işlem, lobun yolları için anterograd bir işaretleme sağlayacaktır.Bundan sonraki tüm adımları maksimum karanlıkta gerçekleştirin. Beyni bee ringers çözeltisiyle üç kez daha durulayın ve boyanın 30 ila 45 dakika boyunca inkübe olmasına izin verin. Arıyı buzdolabında soğutarak immobilize edin.Ardından beyni izole edin. Beyni, dört santigrat derecede ve hafif ajitasyonla, 0,1 molar PBS içindeki %4 Para aldehit ile gece boyunca fikse edin. Bunu, standart dehidratasyon ve şeffaflaştırma protokolleri ile takip edin. Anten lobundaki projeksiyon nöronları micro ruby izleyici ile geri doldurulduktan sonra, bu nöronların Z ekseni boyunca orto kesitlerden projeksiyon görünümü oluşturulmuştur.İki elektrot üzerindeki Alexa Hydrocyte 4 88 boyası, elektrotların medial anten lobu traktusuna ve lateral anten lobu traktusuna yerleşimini göstermektedir. Boyanan hedef hücrelerin ve elektrot yerleşim bölgelerinin 3D rekonstrüksiyonu, iki anten lobu traktusunun izlediği yörüngelerin şematik bir çizimini oluşturmak için kullanılmıştır. Arıya farklı koku konsantrasyonları ile stimülasyon uygulanırken iki anten lobu traktusundan eş zamanlı kayıt yapılması, zamansal işlemenin araştırılması amacıyla kullanılmıştır. Aktivite, sonraki işleme aşamalarında değerlendirilmiştir.Anten lob projeksiyon nöronları ve ekstrinsik nöronların popülasyon vektörlerine uygulanan temel bileşen analizi, projeksiyon nöronlarındaki koku yanıtının uzadığını ve uyarandan daha uzun sürdüğünü göstermektedir. Buna karşılık, ekstrinsik nöron popülasyonunda yalnızca "koku açık" ve "koku kapalı" tipleri temsil edilmiştir. Dolayısıyla, aktivitenin zamanla değişimine bakıldığında, sağdaki ekstrinsik nöron popülasyonu, projeksiyon nöron popülasyonu koku kaynaklı aktivitesini geliştirmeye başlamadan hemen önce koku ayrıştırma aktivitesi göstermektedir.Koku stimülasyonu gri ile işaretlenmiştir. Uzmanlaşıldığında, bir elektrot oluşturmak yaklaşık 30 dakika sürer. Arının hazırlanması ve elektrotların hedef bölgelere yerleştirilmesi, düzgün bir şekilde gerçekleştirildiğinde bir yarım saat daha sürer.Bu prosedürü uygularken, her adımın ustalık kazanılana kadar çok fazla pratik ve sabır gerektirdiğini unutmamak önemlidir. Elektrot kablolarını bağlantı noktalarına lehimlerken ve hedeflenen beyin bölgesinden kayıt alırken özellikle dikkatli olunmalıdır. Bu işlem, bal arısı beyin anatomisinin gelişimi sonrası hakkında sağlam bir bilgi birikimi gerektirir.Bu teknik, nöropatoloji ve böcek koku alma duyusu alanındaki araştırmacıların, davranış sergileyen bal arılarındaki farklı nöronal yolaklar ve beyin merkezlerinin aktiviteleri arasındaki kesin zamansal ilişkileri keşfetmelerini sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, iki beyin bölgesinden ve davranış sergileyen bal arılarından eş zamanlı kayıt yapmak için çok kanallı mikro tel elektrotların nasıl oluşturulacağı ve kullanılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ayrıca, kayıt elektrotlarınızın kesin konumlarını görselleştirebilmeniz gerekir.

simultaneous-long-term-recordings-at-two-neuronal-processing-stages

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Arılar iştahlı bir koku alma öğrenme paradigması (PER-condition) klimalı olabilir. Uyaranlara gibi kokular kullanarak, aynı anda Kalsiyum Görüntüleme koku uyarılmış mantar vücut nöron aktivitesini ölçmek için kullanılır kaydedilir hangi davranış bir yöntem...

In vivo Ca 2 + - Bal Arısı Koku Öğrenme sırasında Mantar Vücut Nöronlar Görüntüleme

Biz sistemik ilaç uygulama tarafından bal arıları iştahlı bir koku alma klima paradigma (Apis mellifera) bir davranış farmakoloji yöntemi nasıl uygulanacağını göstermektedir. Bu yöntem, soruşturma mekanizmalarının altında yatan basit ve güvenilir bir şekilde öğrenme ve bellek oluşumu sağlar.

Bal arısı burnumun Extension Tepki Klasik Koşullanma Davranış Farmakoloji ( Apis mellifera)

Belirlenen Nöronlar ve Beslenme Davranışı Kalsiyum sinyaller aynı anda kayıt Drosophila melanogaster</em

Olfaktör ipuçları böcekler birçok farklı davranışlar arabuluculuk, bileşikler ve uçucu yüzlerce onlarca oluşan genellikle kompleks karışımlarıdır. Böcek anten lob çok kanallı bir kayıt ile gaz kromatografisi kullanarak, biyolojik olarak aktif bileşiklerin belirlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Böcek antennal Lob Gaz Kromatografisi-Multi-ünite Recordings (GCMR) kullanarak Olfaktör Uçuculuk tanımlanması

Biz omurgasız koku yolunun ilk üç aşamada koku-uyarılmış yanıtlar karakterize etmek ekstraselüler çoklu ünite kayıt tekniği varyasyonları göstermektedir. Bu teknikler kolayca başka sinir sistemlerinin topluluk etkinliği incelemek için adapte edilebilir.

Locust Sinir Aktivitesi Karakterize Multi-ünite Kayıt Yöntemleri (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfaktör Devreler

Bu protokolü biz durumu dokunsal uyaranlara karşı bal arıları koşulmuş ve ince çaplı anten örnekleme deseni kinematik analiz için bir 2B hareket yakalama tekniği tanıtmak nasıl gösterir.

Dokunsal İklimlendirme Ve Bal Arısı yılında antennal Örnekleme Stratejileri Hareket Analizi (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Bal arısı işçiler, yaşlanma sosyal davranışları ziyade kronolojik yaşına bağlıdır. Burada çok farklı yaşlanma desenleri ile işçi-tipleri elde edilmiş ve hücresel yaşlanma için analiz edilebilir göstermek.

, Yavaşlatıldı Hızlandırılmış ve Ters Honey Bee Model Yaşlanma ile Örneklerin Alınması

Bal arısı (Apis mellifera) için geliştirilen Proboscis Extension Response (PER) koşullandırma protokolü, birçok böcek türünde birkaç farklı öğrenme mekanizmasını incelemek için ekolojik olarak ilgili ve kolayca ölçülebilir bir araç sağlar.

Bir burnumun Extension Tepki Böcekler Davranış Plastisitesi incelenmesi için protokol: Basic, Biyomedikal Uygulama ve Tarımsal Araştırma

Yeni uyaran-tepki dernekler Öğrenme sonuçta bireysel nöronların başak çıkışını değişiyor yansıyan sinirsel süreçlerin geniş bir yelpazede yürütmektedir. Burada, hayvanlar, elde söndürmek ve tek bir deneysel oturumda içinde bir şartlı yanıt yeniden almak ise tek nöron aktivitesinin sürekli kaydı için izin veren bir davranış protokol açıklar.

Serbestçe Öğrenmenin üç aşamalı karşısında Güvercinler Hareketli gelen tek nöronların &#39;Aksiyon Potansiyelleri kayıt

Bu yazının serbest uçan arılar için basit non-invaziv yöntemler yanı sıra ölçülü arıların kesin lokalize tedavi izin daha invaziv varyantları da dahil olmak üzere, bal arıları için farmakolojik ajanların uygulanması için çeşitli protokoller açıklanır.

Ölçülü ve Serbest uçan Bal Arısı Nörofarmakolojik Manipülasyon,<em&gt; Apis mellifera</em

Burada sunulan protokol, eşzamanlı elektroensefalografi (EEG) ve gerçek zamanlı olarak davranışsal değerlendirme hakkında bilgi sağlar. Bu protokolde yer alan tüm adımları, özellikle öğrenme ve hafıza alanlarında, nörobilimin birçok alanındaki araştırmacılar için cazip bir çözüm olarak tartıştık.

Hipokampal nörogenezi incelemek için bir araç olarak kablosuz elektrofizyoloji ve hafıza davranış testinin eşzamanlı izlenmesi

Öğrenin davranan bal arılarında iki farklı beyin bölgesinden eşzamanlı uzun vadeli kayıt tekniğini. Bu yöntem, koku kodlama ve bellek oluşumu mekanizmalarını anlamak için nöronal işlemeyi araştırır.

Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

Daha fazla video keşfet