Davranan Bal arısı iki nöronal İşleme Dönemlerinde Eşzamanlı Uzun vadeli Kayıtlar

Bu prosedürün genel amacı, davranan bal arılarında iki bağımsız nöronal işleme aşamasına uzun süreli erişim kullanarak koku alma kaplaması ve hafıza oluşumunu incelemektir. Bu, önce yalıtılmış bakır mikro tellerden ve özel yapım tutuculardan düşük maliyetli çok kanallı elektrotların monte edilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, açıkta kalan beyne floresan boya ile muamele edilmiş iki elektrot yerleştirmek için kafa kapsülünün bir bölümünü çıkararak canlı bir bal arısı hazırlamaktır.

Üçüncü adım, çiçek kokuları ve feromonlarla uyarırken, koku alma yolundaki iki bağımsız nöro hap veya yoldan kayıt yapmaktır. Daha sonra, beyni inceledikten sonra, hedef nöronları geri doldurmak için anten lobuna farklı bir floresan izleyici enjekte edilir. Geri doldurulmuş izler ve elektrot izleri daha sonra nöronal mimarinin üç boyutlu bir rekonstrüksiyonunu üretmek için görselleştirilir.

Sonuç olarak, anten lobu ve mantar gövdesi gibi farklı işleme seviyelerindeki iki nöron popülasyonu arasındaki koku kaplamasındaki ilişkiler bu teknikler kullanılarak daha iyi anlaşılabilir. Dolayısıyla, mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajları, çok kanallı elektrotlarımızın çok küçük olması ve kombinasyon halinde kullanılabilmesidir, bu da sabitlendikten sonra beynin farklı bölgelerinde aynı anda kayıt yapabileceğimiz anlamına gelir. Esnek teller, davranan hayvanlarda birkaç saat boyunca istikrarlı bir geri çağırmaya izin verir.

Bu yöntem, nöropatoloji alanında, hayvanların çevrelerinden yaşamdaki olf fabrikalarını nasıl aldıklarını, algıladıklarını ve son olarak nasıl hesapladıklarını anlamak gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu çift kayıt tekniği, koku kodlamasının ve genel olarak nöronal ağların altında yatan mekanizma hakkında fikir verebilir. Omurgasız veya sevgi ve nörobiyolojideki diğer model organizmalara da uygulanabilir.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü bal arısı nöronlarını yalnızca iç lob veya mantar gövdesinin dikey lobu gibi morfolojik yer işaretlerini kullanarak tanımlamak için çok fazla eğitim gereklidir. Bu protokol için, standart bir elektrot arabirim kartına uyacak bir elektrot adaptörü oluşturun. İlk olarak, üç kısa yalıtılmış kabloyu 18 pinli bir konektöre lehimleyin.

Sonra bir parça pleksiglas plaka kesin ve en uzun kenar boyunca sığ bir oluk yerleştirin. Ardından, lehim pabuçlarını pleksiglas plakaya vidalayın ve plakayı konektörün üstüne yapıştırın. Ardından, üç kısa kabloyu kullanarak tabanı pabuçlara bağlayın.

Ardından, pleksiglas plakanın oluğuna bir cam kılcal yerleştirin. Kılcal damar kayabilmeli ve bir vida ile sabitlenebilmelidir Küçük bir pim kullanarak, cam kılcal damarı yaklaşık beş milimetre dışa doğru uzatın. Kılcal damar ve pim, elektrot mikro tellerini desteklemek ve stabilize etmek için kullanılacaktır.

Ardından, üç mikro tel yerleştirin. Daha iyi erişim için yapışkan bant yardımıyla, cam kılcal damar 12 voltluk bir lehim iğnesi tutkalı kullanılarak çıkarılabilir. LMP diş mumu ile birlikte teller, tellerin son üçte birini yapıştırmaz.

Şimdi bu çok kanallı mikro tel düzeneğini elektrot adaptörüne bağlayın. Uzatılmış cam kılcal damarı mikro tellere paralel olarak konumlandırın. Bu ataşmanı, üst üste binen cam kılcal damar ve minüçyal pim boyunca diş mumu ile sabitleyin.

Daha sonra elektrot tellerini, minutian piminden uzanan iki ila üç santimetre ve elektrot ucundan uzanan iki ila üç santimetre bırakarak kesin. Ardından, kılcal damarı elektrot adaptörüne sabitleyin ve her şeyi yerinde sabitlemek için bir vida kullanın. 360 santigrat derecede.

Tellerin uçlarını pabuçlara dik olarak lehimleyin. Ardından, empedanslarının bir kilohertz'de yaklaşık 300 kilo ohm olduğunu kontrol ederek yeterince güçlü bir elektrik teması olup olmadığını kontrol edin. Şimdi ikinci elektrot adaptörünün kanallarını ana elektroda bağlayın ve referans ve kas elektrotlarını ana elektrot tabanına lehimleyin.

Son olarak, ana elektrodu kafa aşamasının arayüz kartına monte edin. Bal arılarını elde ettikten sonra ikinci elektrodu ayrı bir adaptöre sabitleyin, birini hareketsiz hale gelene kadar buz üzerinde soğutun. Ardından, arıyı başı açıkta kalacak şekilde standart bir pleksiglas tutucuya sabitleyin.

Isıtılmış diş mumunu gözlerin tabanına ve baş ile göğüs kafesi arasındaki bağlantıya uygulayın, böylece başı sabitleyin. Kafa kapsülü üzerindeki antenin scape gözünü hareketsiz hale getirmek için balmumu kullanmaya devam edin. İleriye dönük olması gereken fagel'e balmumu uygulamaktan kaçının.

Pro Bois çarpmadan arındırılmış olmalıdır. Hareket edip etmediğini kontrol edin. Şimdi erişilebilirliği artırmak için kafa kapsülünü tıraş edin.

Daha sonra arıyı tüketeceği %30'luk sakarozun tamamını besleyin. Bu, iyi bir hazırlık, canlılık ve doku nemi sağlar. Şimdi bir mikro neşter kullanarak, göz kenarı boyunca dikey olarak ve anten tabanlarının üzerinde yatay olarak kesin.

O hücre gözünün altında kesmeye devam edin ve gevşek kütikülü çıkarın. Hipofaringeal bezler, trakea gibi bir kenara taşınmalıdır. Bu, elektrotun yerleştirilmesi için yolu temizleyecektir.

35 mikronluk gümüş bir tel olan referans elektrodunu yerleştirerek başlayın. İlk olarak, ipsilateral bileşik gözde küçük bir kesi yapın. Sonra elektrodu içinden geçirin.

Daha sonra, ikinci teli lateral O hücreli gözünün altındaki kas projeksiyon bölgesine yerleştirin. Elektrot konumlarını daha sonra görselleştirmek için, elektrotları üç dakika boyunca 0.5 molar potasyum klorür ve% 5 Alexa Hydrocyte 4 88 çözeltisine batırın. Daha sonra, mikro manipülatörler kullanarak iki elektrotu beyne yerleştirin.

Mantar gövdesinin anten lobunu ve dikey lobunu tanımlayarak kendinizi yönlendirin. Burada bir elektrot 180 mikron derinliğindeki yan anten lob yolunda, diğeri ise medial anten lob yolundadır. Yaklaşık 300 mikron derinliğe yerleştirildi.

Elektrot yerleşimlerini iki bileşen kullanarak sabitleyerek tamamlayın. Silikon, beynin üzerindeki tüm boşluğu kaplar ve bu da dokuların kurumasını önler. Ardından, hücre dışı kaydedilen sinyalden birim aktivitesini çıkarmak için kayıt yapmaya devam edin.

Mevcut spike sıralama yazılımını kullanın. Farklılaştırılmış elektrot kanallarını kullanın. Tek ani yükselme olaylarını açıklayan farklı dalga biçimi kombinasyonlarını tespit etmek için şablon eşleştirme tekniklerini üç elektrot kanalının tümüne aynı anda uygulayın.

Ve son olarak, uygun ünite ayrımı için kontrol. Kaydedilen üç diferansiye elektrot kanalının tek spike olaylarında temel bileşen analizini kullanma. Kayıtları yaptıktan sonra, silikonu ve elektrotları arıdan dikkatlice çıkarın.

Daha sonra, beyni arı zil çözeltisi ile durulayın ve bezleri ve trakeayı çıkarın. Daha sonra bir mikro pipet kullanarak anten lobuna enjekte edin, bir molar potasyum asetat içinde çözülmüş %5 mikro yakut. Bu, lobun izlerine anterograd bir etiket sağlayacaktır.

Buradan itibaren, tüm adımları maksimum karanlıkta gerçekleştirin. Beyni arı halkaları ile tekrar üç kez durulayın ve boyanın 30 ila 45 dakika inkübe kalmasına izin verin. Ariyi buzdolabında soğutarak hareketsiz hale getirin.

Sonra beyni izole edin. Beyni% 4 Para aldehitte 0.1 molar PBS'de gece boyunca dört santigrat derecede ve hafif çalkalama ile sabitleyin. Bunu dehidrasyon ve temizleme için standart protokollerle takip edin Anten lobundaki projeksiyon nöronları mikro yakut izleyici ile geri doldurduktan sonra, bu nöronların bir projeksiyon görünümü Z ekseni boyunca orto dilimlerden birleştirildi.

İki elektrot üzerindeki Alexa Hydrocyte 4 88 boyası, bunların medial anten lobuna ve lateral anten lob yoluna yerleştirildiğini gösterir. Lekeli hedef hücrelerin ve elektrot yerleştirme bölgelerinin 3D rekonstrüksiyonu, iki anten lobu izli yörüngenin bir şemasını yapmak için kullanıldı, iki anten lobu yolundan eşzamanlı kayıt yapılırken, arıyı farklı koku konsantrasyonlarıyla uyarmak zamansal işlemeyi araştırmak için kullanıldı. Aktivite, sonraki işlem aşamalarında değerlendirildi.

Anten lob projeksiyon nöronları ve popülasyon vektörlerinin dışsal nöronlar prensip bileşen analizi, projeksiyon nöronlarındaki kokunun uzun sürdüğünü ve uyarandan daha uzun sürdüğünü göstermektedir. Buna karşılık, dışsal nöron popülasyonunda, sadece koku açık ve koku kapalı türleri temsil edildi. Bu nedenle, zamanla aktiviteyi görüntülerken, sağdaki dışsal nöron popülasyonu, projeksiyon nöron popülasyonu koku kaynaklı aktivitelerini geliştirmeye başlamadan biraz önce koku ayırma aktivitesi gösterir.

Koku stimülasyonu gri ile işaretlenmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bir elektrot oluşturmak yaklaşık 30 dakika sürer. Arının hazırlanması ve elektrotların hedef bölgelere yerleştirilmesi, uygun şekilde yapılırsa yarım saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, ustalaşana kadar her adımın çok fazla pratik ve sabır gerektirdiğini hatırlamak önemlidir. Elektrot tellerini bağlantı noktalarına yükseltirken ve istenen beyin erişiminden kayıt yaparken özellikle dikkatli olun. Geliştirilmesinden sonra bal arısı beyin anatomisi hakkında gerekli sağlam bilgi.

Bu teknik, nöropatoloji ve böcek koku alma alanındaki araştırmacıların, farklı nöronal yolların aktivitesi ile davranan bal arılarındaki beyin merkezleri arasındaki kesin zamansal ilişkileri keşfetmelerini sağladı. Bu videoyu izledikten sonra, iki beyin bölgesinden ve davranan bal arılarından aynı anda kayıt yapmak için çok kanallı mikrotel elektrotların nasıl oluşturulacağını ve kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Ayrıca kayıt elektrotlarınızın tam konumlarını da görselleştirebilmelisiniz.