Canlı Görüntüleme Drosophila Larva nöroblastomun

Bu prosedürün genel amacı, üçüncü Instar oph larvalarından sağlam CNS'nin diseksiyonunu detaylandırmaktır. Asimetrik kök hücre bölünmelerini, hücresel farklılaşmayı ve morfogenezi incelemek için. Bu, ilk olarak CNS'nin larva gövdesinden brüt diseksiyon ile ekilmesiyle gerçekleştirilir.

İkinci adım, sağlam beynin özel yapım aletler kullanılarak ince mikrodiseksiyon ile periferik dokulardan izole edilmesidir. Daha sonra, sağlıklı beyinler ya canlı hücre görüntüleme için monte edilir ya da kimyasal fiksasyon ve immünofloresansa tabi tutulur, sonuçta dönen disk konfokal Mikroskopi, nöral kök hücre bölünmelerini yöneten olayları göstermek ve CNS gelişimine mekanik içgörü sağlamak için kullanılır. Bu yöntem, kök hücre kanseri ve nöral gelişim alanlarındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Kök hücre çoğalmasının nasıl düzenlendiğine dair anlayışımıza katkıda bulunarak, ABER kök hücre bölünmesinin tümör oluşumu ve mikrosefali ile ilişkili olduğunu biliyoruz ve görüntüleme çalışmalarımız bu kök hücre bölünmelerini düzenleyen mekanizmaları ortaya koyuyor. Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü beynin mikrodiseksiyonu ve montajı, sabit eller, sabır ve pratik gerektirdiğinden öğrenilmesi zordur. Bu prosedüre, biri brüt diseksiyon ve diğeri ince diseksiyon için olmak üzere tek bir cam slayt üzerine iki damla ılık diseksiyon ortamı koyarak başlayın.

Sonra birkaç larvayı medya damlalarından birine aktarın. Bundan sonra, larvaları olan cam slaytı bir diseksiyon mikroskobuna aktarın. Şimdi larvaları içeren damlayı, larvaların ön ve arka uçları görünecek şekilde yakınlaştırın.

Tek bir larvanın orta bölgesini bir çift forseps ile kavrayın ve hemen yanındaki başka bir bölgeyi ikinci bir çift forseps ile kavrayın. Sonra larvaları ikiye bölün. Kapaktaki tüm larvalar için prosedürleri tekrarlayın, kaydırın ve arka yarıyı atın.

Ön ağız kancalarının net bir şekilde görülebilmesi için bir larvayı yakınlaştırın. Bundan sonra, üçüncü torasik ve birinci abdominal CLE bantları arasında larva ağız kancalarının karşı tarafında küçük bir kesi veya çentik yapın. Ardından, ağız kancalarını forseps ile kavrayın.

Kütikülü önden arkaya doğru nazikçe soyun ve CNS açığa çıkana kadar devam edin. Daha sonra CNS'yi larvaların geri kalanından izole etmek için dokuları yırtın. CNS'ye zarar vermemeye ve yırtık ventral sinir kordonu veya çarpık optik lobları olan hasarlı numuneleri atmamaya dikkat edin.

Kapak fişindeki tüm larvalar için prosedürleri tekrarlayın. Daha sonra ekilen sağlıklı dokuyu diğer temiz ortama aktarın. İnce diseksiyon için kapak fişini bırakın.

Periferik dokuları beyinden çıkarmak için diseksiyon pimlerini kullanın. Neşteri beyin ile istenmeyen doku arasına kaydırın ve bağ dokusunu cam slayta sabitleyin. İstenmeyen dokuyu nazikçe uzaklaştırmak için kancayı kullanın ve aynı anda Tahterevalli hareketlerinde neşteri kapak kızağına bastırın.

Her beyindeki tüm diskleri çıkarmak için yavaş ve kasıtlı olarak çalışın. Beyin morfolojisini bozmamak için dikkatli olun. Sağlıklı bir beyin, sağlam bir ventral sinir kordonuna ve simetrik yuvarlak optik loblara sahip olacaktır.

Şimdi, 50 milimetrelik gaz geçirgen bir kültür kabını, şeffaf bir film yukarı bakacak şekilde ters çevirin, yemeğin ortasına küçük bir orta damla bırakın. Ardından, optik lobların altındaki beyinleri toplamak için bir kanca kullanın ve bunları tek tek tabağın üzerindeki orta damlasına aktarın. Orta damlada beş ila 10 beyin toplayın.

Daha sonra birçoğu daha sonra menisküste sıkışıp kalacağı için onları tek tek dibe doğru itin. Anterior ventral nöroblastı görüntülemek için nöroblastın görüntülenmesine izin vermek için beyinleri yönlendirin. Beyinleri ventral sinir kordonu yukarı bakacak şekilde yerleştirin, beyinleri tüm ventral sinir kordonları XY düzlemi içinde aynı yönü gösterecek şekilde hizalayın.

Gaz geçirgen membran üzerine dört halo karbon yağı damlası yerleştirmek için bir şırınga veya plastik transfer pipeti kullanın. Her bir yağ damlasının hacmi birbirine ve ortamın damlasına eşit olmalıdır. Tamamlandığında, beş damla batı tarzı zarlardaki beş fasete benzeyecektir.

Ardından, aynı anda beş damlanın tümüne çarpacak şekilde düzeneğin üzerine bir kapak fişi indirin. Numuneler arasında eşit bir basınç sağlamak, bozulma olasılıklarını azaltır. Yaklaşık üç dakika bekleyin.

Yağ ve ortam, kapağın ağırlığı altında dağıldıkça, bir diseksiyon kapsamı altında kayar. Kapak fişi temas edene kadar fazla ortamı bir kağıt mendil fitili ile çıkararak kapak kızağını beynin yüzeyine daha fazla indirin, beyinler fitili aşmaz çünkü bu, anteriyal ventral nöroblastı görüntülemek için doku distorsiyonuna veya beyin patlamasına neden olur. Kapak kayması, ventral sinir kordonu uçları yönünde hafifçe hareket ettirilmelidir.

Bu, beynin dönmesine neden olur, bu da beyin loblarını görüntülemeyi kolaylaştırmak için kapak kayması ile doğrudan temas ettirir ve daha sonra odayı enc ile kapatır. Az miktarda halo karbon yağı ile kapak kayması. Kapak kaymasından sızan fazla yağ en aza indirilmeli ve bir mendille lekelenmelidir.

Görüntülemeden önce. Objektifi doğrudan numunenin üzerinde ortalamaya yardımcı olmak için, monte edilmiş beyinlerin hemen üzerindeki kapak kızağına bir damla daldırma yağı ekleyin. Monte edilmiş numuneyi yavaşça 25 santigrat derece aşamalı inkübatörüne yerleştirin ve hazneyi kapağıyla kapatın.

Daha sonra, optik lobların merkezi ve medial bölgelerinde bulunan büyük yuvarlak hücrelere odaklanarak iletilen ışığı kullanarak merkezi beyin nöroblastını bulun. Yerleştirildikten sonra, nöroblastın uygun konumunu ve derinliğini belirlemek için konfokal kullanarak hızlı pozlamalar yapın. Derinliği ilk 10 ila 15 mikrometre ile sınırlayın.

Gerektiği gibi ayarlayın ve başka bir test görüntüsü alın. Eksenel kaymayı ortadan kaldırmak için, kızılötesi LED kullanan sürekli bir otomatik odaklama cihazı kullanın veya odak düzlemini manuel olarak düzeltin. İlgilenilen bir nöroblast tanımlandıktan sonra, görüntülemeden önce tüm parametreleri optimize edin.

Şimdi Z ekseninde bir mikrometre aralıklı 12 ila 14 görüntü toplayarak tüm nöroblastı görüntüleyin. Aynı nöroblastın tek veya çoklu hücre döngülerini yakalamak için zaman çözünürlüğünü ayarlayın. Tek hücre döngüsü görüntüleme için 10 ila 32. aralıklar ve çoklu hücre döngüleri için bir ila üç dakikalık aralıklar kullanın.

Ardından, mitoz süresini izleyerek numunenin sağlıklı olduğunu onaylayın. Mitoz 15 dakikadan fazla sürerse, başka bir beyne geçin. Sağlıklı bir beyin, aynı görüş alanı içinde birkaç tur mitoz geçiren birçok nöroblast gösterecektir.

Görüntüleme tamamlandıktan sonra, inkübasyon odasını sökün ve gaz geçirgen kültür kapları dışındaki her şeyi atın. Kültür kabı yüzeyini %95 etanol ile durulayın ve yağı bir mendille silin. İşlemi iki kez daha tekrarlayın.

Burada, tüm montaj preparatlarında nöroblast kök hücre bölünmelerinin canlı görüntülenmesi gösterilmektedir. Bunlar, ince hücresel analiz için GFP Mosin eksprese eden bir nöroblasttan tek bir hücre döngüsünün hızlandırılmış görüntüleridir, tek bir nöroblast hücre döngüsü 32'den daha az zaman aralığında görüntülenir. Ve bunlar, hem G-F-P-M-O hem de GFP etiketli bir sentrozom markörü eksprese eden bir nöroblasttan ardışık hücre bölünmesi döngülerinin hızlandırılmış görüntüleridir.

Çoklu nöroblast hücre döngülerini görüntülemek için. Beyinler tipik olarak iki ila üç saatlik bir süre boyunca bir ila üç dakikalık zaman aralıklarında görüntülenir. Evde montaj preparatlarından elde edilen sabit kök hücrelerin konfokal projeksiyonları burada gösterilmektedir.

Her iki optik lobda bulunan tüm nöroblastı görüntülemek için 20 x büyütme kullanılır. Bu analiz, genel beyin morfolojisini incelemek ve nöroblast sayılarını ölçmek için özellikle yararlıdır. Tek bir optik lobdan gelen nöroblastın çoğunluğu 40 x büyütme ile görüntülenebilir.

Birkaç nöroblastın ayrıntılı hücresel analizi için 100 x büyütme kullanılmalıdır. Bu mutant nöroblast, her iğ kutbunda birden fazla sentrozom gösterir. Bu prosedürü denerken, Örneğe çarpan ışık miktarını sınırlayarak fotoğraf hasarını önlemeyi unutmamak önemlidir.

Tüm montaj preparatlarında canlı nöroblast bölünmelerini görüntülemeye yönelik bu teknik, kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, gelişmekte olan drosophila beyninin canlı doğal bağlamında asimetrik hücre bölünmesini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.