Name: Canlı Görüntüleme Drosophila Larva nöroblastomun (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Öğrenin Drosophila larva beyninde canlı hücre görüntüleme yöntemiyle asimetrik nöral kök hücre bölünmelerini incelemeyi. Bu teknik sinir sistemi gelişimi ve kök hücre davranışları hakkında mekanistik bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma DAL ödüllendirildi Sağlık / enstitünün (1ZIAHL006126) ve bir Lenfant Biyomedikal Doktora Sonrası Araştırma Bursu National Institutes intramural araştırma bölümü tarafından desteklenmiştir.

1.. Malzemeler Gerekli hazırlanması Üçüncü Instar Larva Brain eksplantasyona <ol><li> Mikrodiseksiyon için gerekli araçları hazırlamak. <ol><li> Öncelikle her pim yuvasına bir tek diseksiyon pimi koyarak iki diseksiyon araçları (bir neşter ve bir kanca) kurma. Elle veya pense (Şekil 1C) ile sıkıca işaretçilerine sabitleyin. </li><li> Yaklaşık 120 ° açı bir diseksiyon pin bükmek için eski bir çift forseps kullanın. Pim tutucu elinde olduğunda pimin üst yarısı düz yatıyor sağlamak için bir mikroskop altında bunu yapın. Bu araç, basılı veya doku yoluyla dilim bir neşter olarak kullanılacaktır. </li><li> Tutun ve doku kazımak için kullanılan bir kanca içine ikinci pimi bükmek için eski bir çift forseps kullanın. </li><li> Hasardan araçları korumak için bir pipet ile her kesme aletini örtün. Bakım, iyi-oluşturulmuş araçları süresiz diseksiyon için kullanılabilir. Gerektiğinde hasarlı veya deforme işaretçilerine değiştirin. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Orta diseksiyon hazırlayın. <ol><li> Bir doku kültürü kaputu, Schneider&#39;in kültür ortamı içine antibiyotik-antimikotik ek sulandırmak. Ek dahil medyayı girdap. </li><li> Takviye edilmiş ortam bir çok 5 ml&#39;lik numuneler hazırlayın. Kullanıma hazır olana kadar 4 ° C&#39;de tüm medya saklayın. </li><li> Oda sıcaklığına kadar takviye edilen ortam içinde, 5 ml&#39;lik bir şişe ısıtın. Steril bir 5 ml şırınganın içine orta çizin ve bir steril 0.2 mikron şırınga filtresi üzerindeki vida. </li></ol></li><li> Diseksiyon için larva seçin. Beyin incelemek için kolay olacak gibi sürünerek üçüncü larva evresindeki seçmek için bir diseksiyon prob kullanın. İsteğe bağlı: Bir üzüm agar plaka üzerinde mevduat larvalar. Not: Bu erken dışarı tarama için ikinci veya birinci larva evresindeki zorlamak eğilimi olarak &quot;ıslak gıda,&quot; ile aşırı kalabalık şişeleri veya şişeleri kullanmayın. Not: Bazı genetik arka genç larvaları kullanılarak gerektirecek. Bu protokol etkilemez, ama d yapmak yokissection daha zor. </li></ol> Merkezi Sinir Sistemi 2. Diseksiyon <ol><li> Tek bir cam slayt üzerine, yaklaşık 3 cm ayırarak sıcak diseksiyon medyanın iki 50 ml havuzu oluşturun. Bir havuz ince diseksiyon (Şekil 1C) için kullanılan brüt diseksiyon ve diğer için kullanılacaktır. </li><li> Ortam damla birine çeşitli larva aktarın. </li><li> Diseksiyon mikroskop larvaları ile lamel taşıyın. Larvaların ön ve arka uçlarının fark edilebilir olduğu bu tür larvaları ihtiva eden havuza büyüt. </li><li> Tek bir larva orta bölgeyi kavramak için forseps bir çift kullanın. Öte yandan forseps ikinci bir çift almak ve aynı bölgeye yakın larva kavramak. Yavaşça yarısında larva gözyaşı ayrı forseps iki çift çekin. Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. </li><li> Bir dokuya aktararak larva vücudun posterior yarısı atmayın. </li><li> Bir larva yakınlaştırmak inci böyleceE anterior mouthhooks açıkça görülebilir. Üçüncü torasik ve birinci ön denticle bantlar arasındaki larva mouthhooks ters tarafta küçük bir kesik veya çentik oluşturmak için forseps iki çift kullanın. </li><li> Baskın olmayan el forseps ile mouthhooks kavrayın. Nazikçe bir ön-to-posterior yönde manikür soyulmaya, diğer yandan forseps kullanın. Merkezi sinir sistemi ortaya çıkıncaya kadar yavaş yavaş manikür soyulmaya devam ediyor. </li><li> Dokular forseps ile yırtılarak larva geri kalanından merkezi sinir sistemine izole edin. Merkezi sinir sistemini bozmayacağı dikkatli kullanın. Kritik adım: merkezi sinir sistemi üzerinde çekmeyin! Yırtık bir ventral sinir kablosu (Şekil 2A) veya bozuk optik loblar (Şekil 2B ve 2B &#39;) ile hasarlı örnekleri atın. </li><li> Lamel tüm larvaları için yukarıdaki iki adımı tekrarlayın. Için sağlıklı eksplante doku aktarınince diseksiyon aşaması için lamel orta ikinci (temiz) havuz. </li><li> Beyinden periferik dokuyu (örneğin, göz, kanat ve bacak diskler) temizlemek için diseksiyon pin araçlarını kullanın. Coverglass için bağ dokusu çivileme, istediği (beyin) ve istenmeyen doku arasındaki neşter kaydırın. Aynı anda testere gibi hareketlerle lamel neşter basarken hafifçe istenmeyen doku uzak kızdırmak için kanca kullanın. </li><li> Kritik adım: Her beyinden gelen tüm diskleri kaldırmak için yavaş yavaş ve bilinçli çalışın. Beyin morfolojisini rahatsız dikkatli kullanın. Sağlıklı bir beyin bozulmamış bir ventral sinir kablosu ve simetrik, yuvarlak optik lobu (Şekil 2C) sahip olacaktır. </li></ol> 3.. Canlı Görüntüleme Brain Eksplante Montaj <ol><li> (Şekil 2B) yukarı bakacak net film ile 50 mm gaz-geçirgen kültür çanak ters çevirin. T ortamı üzerine küçük bir damla (yaklaşık 30 ul) biriktirilmesi için şırıngayı basınızyemeğin o merkezi. </li><li> Çanak orta damlasına kadar izole edilmiş beyinleri, bir defada, aktarın. Optik lobu altında bir beyin kaldırsanız kanca aracını kullanın. Alternatif olarak, ventral sinir kablosu uzanan aksonları kavramak için forseps kullanabilir. </li><li> Orta damla 5-10 beyinleri toplayın. Birçoğu gibi orta damla dibine tek beyinleri itmek için kesme pim araçlarını kullanarak beyinleri daldırın menisküs (Şekil 2E) tuzak olacaktır. </li><li> Yansıması için NB&#39;ler (Şekil 3A) bağlı olarak beyin hizalamak için diseksiyon pin araçlarını kullanarak beyinlerini yönlendirin. Görüntü dorsal Onaylanmış, (membran boyunca) aşağı bakacak ventral sinir kablosu yerleştirin. Görüntü anterio-ventral NBs, (uzakta membran) yukarı bakacak ventral sinir kablosu ile beyinleri yerleştirin. Tüm ventral sinir kordonları xy düzlemi içinde aynı yöne işaret etmektedir, öyle ki beyin hizalayın. </li><li> Bir şırınga ya da plastik transferi p kullanipette gaz geçirgen zar üzerine 4 halokarbon (HC) yağ damlaları (yaklaşık 30 ul her) yerleştirmek için. Petrol her damla hacmi birbirine ve orta damla eşdeğer olmalıdır. Uzay yağı damla kültür ortamının damla etrafında bir lamel dört köşesine tekabül edecek şekilde. Tamamlandığında, beş damla (yağ dört damla ve merkezi orta biri damla) Batı-tarzı zar (Şekil 3B) beş yönleriyle benzer olacaktır. </li><li> Bu aynı zamanda tüm 5 damla vurur şekilde montajı üzerinde bir # 1.5 22 mm lamel indirin. Örneklerin arasında eşit bir basıncın korunması da bozulacak olasılığını azaltır. Yağ ve orta lamel ağırlığı altında dağıtmak üzere yaklaşık 3 dakika bekleyin. Bir ortam çapraz-benzeri şekil (Şekil 3C ve 3D) oluşturacaktır. </li><li> Kritik adım: ince kağıt fitil (Figu kullanarak fazla ortamı kaldırarak beyinlerinin yüzeyi üzerine lamel Alt) 3C yeniden. Diseksiyon kapsamında örnek izlerken bunu. Ortam çıkarılır olarak, lamel daha düşük olacaktır. Lamel beyinleri dokunduğunda durdurun. Aşırı-fitil bu doku bozulması ya da beyin patlamalara neden olacak gibi. </li><li> Görüntüleme dorsal Onaylanmış (Şekil 3E), 3.9 adıma taşıyın. Görüntüleme anterio-ventral Onaylanmış ise, lamel biraz ventral sinir kablosu ipuçları yönünde (forseps ile yavaşça onu dürtmek) taşınmalıdır. Bu görüntüleme (Şekil 3F) kolaylaştırmak için lamel ile doğrudan temas halinde beyin lobları getiren döndürmek için beyin neden olur. </li><li> Halokarbonlu bir yağ (Şekil 3D), az miktarda lamel çevreleyen ile odası kapatın. Lamel sızma aşırı yağ küçültülmüş ve bir doku ile uzak lekelenen edilmelidir. </li></ol> Central Brain neuroblasts 4. Canlı Görüntüleme Not: Bu çalışma için, bir Nikon Eclipse Ti dönen diskkonfokal mikroskop (ters mikroskop) canlı görüntüleme için kullanılan; Bizim kurulum detayları önceden 31 yayınlanmıştır. Alternatif olarak, numune, bir dik sistemi kullanılarak görüntülenebilir. <ol><li> Sadece monte beyinleri üzerinde lamel daldırma bir damla yağ ekleyin. Bu, numunenin doğrudan üstünde amaç merkezi yardımcı olacaktır. </li><li> Kritik adım: bir sahne kuluçka 25 ° C&#39;lik sabit bir sıcaklıkta beyinleri koruyun. Yavaşça aşama inkübatör içine monte edilmiş örnek pozisyon ve kapak ile odasını kapsamaktadır. </li><li> Optik lobların merkez ve medial alanlarda ikamet büyük, yuvarlak hücreler odaklanarak iletilen ışık kullanarak merkezi beyin Onaylanmış bulun; epi-floresan kullanmayın. Bu uygulama ile daha kolay olur. Bu, mümkün olduğu kadar hafif olan en az miktarda için örnek göstermek için çok önemlidir. Zarar zamanlı görüntüleme beyinleri israf etmeyin. </li><li> Bir kez yerinde, konfokal kullanarak hızlı çekimlerininUygun yeri ve derinliği belirler. Ilk 10-15 mikron derinlik sınırlayın. Gerektiği gibi ayarlayın ve başka bir test görüntü almak. <ol><li> İsteğe bağlı adım: hayır xy kayma olmadığından emin olmak için ventral sinir kablosu bir test film toplayın. Sürüklenme tespit edilirse, yerleşmek için numune için 15-30 dakika bekleyin. Sürüklenme 30 dakika razı değilse, yeni bir örnek hazırlamak. Binbaşı sürüklenme genellikle aşırı yağ ilave geri takip edilebilir, ya da yağ eşitsiz boyutu montaj sırasında düşer. </li></ol></li><li> Eksenel kayması (z-drift) ortadan kaldırmak için bir kızılötesi LED kullanan bir sürekli otomatik odaklama aygıtı kullanın. Alternatif olarak, elle odak düzlemi düzeltin. </li><li> Ilgi konusu bir NB tanımlanır, görüntüleme rejimi ile devam edin. Tüm canlı hücre görüntüleme, lazer ışık miktarı, maruziyet süresi, kamera binning, objektif büyütme, zaman ve / veya z-adım aralığı ile tüm ampirik eldeki soruyu cevaplamak için belirli bir deney için optimize edilmelidir. Amacı ışık baraj en aza indirmek içinyaş iken yine de yararlı veri toplama. Ek rehberlik için açıklamalara bakın. <ol><li> Resim z-ekseninde 1 mikron aralıklı 12-14 görüntüleri toplayarak NB tüm hacmi. Aynı NB bir veya birden fazla hücre döngüsü yakalamak için zaman çözünürlüğü ayarlayın. Genel bir kural olarak, tek bir hücre döngüsü görüntüleme ve birden fazla hücre döngüsü için 1-3 dakika için 10-30 saniye aralıklarla aralıkları kullanın. </li></ol></li><li> Kritik adım: örnek mitoz süresini izleyerek sağlıklı olduğunu onaylayın. Mitoz fazla 15 dakika sürer, başka bir beyin geçmek. Sağlıklı bir beyin mitoz birkaç tur geçiren görüş aynı alanda bulunan birçok Onaylanmış gösterecektir. Her bir hücre döngüsü nedeniyle ışık hasarına biraz daha uzun bir öncekinden daha olduğuna dikkat edin. </li><li> Görüntüleme işlemi tamamlandıktan sonra, inkübasyon odası sökmeye ve gaz geçirgen kültürleme yemekler ama her atın. % 95 etanol ile kültür çanak yüzeyi durulayın ve bir doku ile de silin. Iki kez daha tekrarlayın. </li&gt; </ol> Immünofloresans için Brain 5. Hazırlanması <ol><li> Takviye edilen ortam içinde yaklaşık 0.2 ml ihtiva eden 1.5 ml tüp içine 20 ya da daha fazla eksplante beynini toplayın. </li><li> Tüpten Ortamı çıkarın ve (% 0.3 Triton X-100 ile fosfat tamponlu tuz çözeltisi, PBS) 0.5 ml PBSTx ile bir kez beyinleri yıkayın. Beyin sıvının tüm değişimleri arasında tüpün dibe olsun. Triton X-100, deterjan doku nüfuz edilebilir kılınması için kullanılmaktadır. Genellikle durulama en az 30 saniye sürer; beyin tüpün dibine yerleşmiş bir kere sadece PBSTx çıkarın. </li><li> PBSTx içinde seyreltilmiş% 9 elektron mikroskobu sınıf paraformaldehidin 0.5 ml çözelti değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> Tehlikeli atık yönetmeliklerine göre sabitleştirici bertaraf edin. </li><li> 15 dakika boyunca 0.5 ml PBSTx ile örnekleri yıkayın. Taze PBSTx iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> 0.5 ml PBT (PBS, 1 ile çözüm yerine% Bovine Serum Albumin (BSA) ve% 0.1 Tween-20). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın. Bu adım, blok dokuya antikorun spesifik olmayan bağlanma. </li><li> % 4 normal keçi serumu (NGS) ile desteklenmiş PBT içinde seyreltilmiş 0.5 ml birincil antikor ile çözüm değiştirin. 4 ° C de bir gece nutation ile inkübe </li><li> Seyreltilmiş primer antikor atın veya kaydedin. </li><li> 15 dakika boyunca 0.5 ml PBT ile örnekleri yıkayın. Taze PBT iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> 0.5 modifiye PBT ml (PBS,% 2 BSA,% 0.1 Tween-20 ve% 4 NGS) ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> Tadil edilmiş PBT ile seyreltilmiş 0.5 ml ikincil antikor ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca nutation kuluçkalayın. </li><li> (% 0.1 Tween-20 ile PBS) 0.5 ml PBST ile çözüm değiştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca nutation kuluçkalayın. Taze PBST&#39;de iki kez daha ile yıkama adımı tekrarlayın. </li></ol><ol><li> Dikkatlice slayt merkezinin soluna doğru sınırlayan damla bir cam slayt üzerinde bir damla olarak örnekleri aktarın. </li><li> Slaydın merkezine monte orta büyük bir düşüş (çapı yaklaşık 2 cm) (örneğin, Aqua-Poly/Mount) ilave edin. Sola doğru olan PBST havuz kaçının. </li><li> Montaj orta havuzuna PBST havuzundan beyinleri aktarmak için forseps kullanın. Beyinleri üstüne doğrudan montaj orta ekleyerek kendi yönünü bozabilir ve kaçınılmalıdır. </li><li> , Bir ışık mikroskobu altında, yukarı bakacak görüntüsü olacak yüzü montaj ortamı içinde örnekleri düzenlemek. </li><li> Işık mikroskobu altında sürgü ile, yavaş yavaş örneklerin üstünde bir # 1,5 daha düşük bir cam lamel. İsteğe bağlı adım: hafifçe lamel iterek küçük hava kabarcıklarını yerinden oynatın. </li><li> Montaj orta slaytlar yalan, bir gecede birkaç saat veya polimerize düz, ışık ver, oda sıcaklığında, koruma. </li><li> Slaytlar bir sonraki gün görüntü verilen ya da önceden görüntüleme için saklanabilir. </li></ol>

<ol><li>Truman, J. W., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+patterns+of+neurogenesis+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).</li>
<li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+markers+for+identified+neuroblasts+and+ganglion+mother+cells+in+the+Drosophila+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system.</a> Development. 116, 855-863 (1992).</li>
<li>Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+asymmetry+for+proper+fitness%2C+function%2C+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research%22%5BJournal%5D)">Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate.</a> Chromosome research. 21, 271-286 (2013).</li>
<li>Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplification+of+neural+stem+cell+proliferation+by+intermediate+progenitor+cells+in+Drosophila+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+development%22%5BJournal%5D)">Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development.</a> Neural development. 3, 5 (2008).</li>
<li>Bowman, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressors+Brat+and+Numb+regulate+transit-amplifying+neuroblast+lineages+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila.</a> Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).</li>
<li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Savoian, M. S., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+primary+cultures+of+Drosophila+melanogaster+larval+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts.</a> Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).</li>
<li>Fleming, S. L., Rieder, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flattening+Drosophila+cells+for+high-resolution+light+microscopic+studies+of+mitosis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).</li>
<li>Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Mad2+to+the+kinetochore+requires+the+Rod%2FZw10+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex.</a> Current biology. 15, 856-861 (2005).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li>
<li>Lucas, E. P., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+the+proper+connection+between+the+centrioles+and+the+pericentriolar+matrix+requires+Drosophila+centrosomin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin.</a> J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+amplification+can+initiate+tumorigenesis+in+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies.</a> Cell. 133, 1032-1042 (2008).</li>
<li>Conduit, P. T., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cnn+dynamics+drive+centrosome+size+asymmetry+to+ensure+daughter+centriole+retention+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).</li>
<li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+research%22%5BJournal%5D)">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome research. 6, 533-549 (1998).</li>
<li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells.</a> Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).</li>
<li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat. Commun. 2, 243 (2011).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrobin+controls+mother-daughter+centriole+asymmetry+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts.</a> Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).</li>
<li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Live+Cell+Imaging+and+Automated+4D+Analysis+of+Drosophila+Neuroblast+Lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells+by+transgenic+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi.</a> Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Siegrist, S. E., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+cues+orient+the+cell+division+axis+in+Drosophila+embryonic+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts.</a> Development. 133, 529-536 (2006).</li>
<li>Broadus, J., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrinsic+cues%2C+intrinsic+cues+and+microfilaments+regulate+asymmetric+protein+localization+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts.</a> Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).</li>
<li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1%2Fdynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).</li>
<li>Britton, J. S., Edgar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+control+of+the+cell+cycle+in+Drosophila%3A+nutrition+activates+mitotic+and+endoreplicative+cells+by+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms.</a> Development. 125, 2149-2158 (1998).</li>
<li>Siller, K. H., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lis1%2Fdynactin+regulates+metaphase+spindle+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts.</a> Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical%2Fbasal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).</li>
<li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).</li>
<li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).</li>
<li>Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+the+model+to+the+test%3A+are+APC+proteins+essential+for+neuronal+polarity%2C+axon+outgrowth%2C+and+axon+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting.</a> J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).</li>
<li>Lerit, D. A., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLP+inhibits+the+activity+of+interphase+centrosomes+to+ensure+their+proper+segregation+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells.</a> J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138, 2207-2215 (2011).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+Drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).</li>
<li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).</li>
<li>Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+pericentrin-like+protein+is+essential+for+cilia%2Fflagella+function%2C+but+appears+to+be+dispensable+for+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis.</a> J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).</li>
<li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Spd-2+recruits+PCM+to+the+sperm+centriole%2C+but+is+dispensable+for+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication.</a> Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).</li>
<li>Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localisation+of+the+mitotic+POLO+kinase+shows+a+highly+dynamic+association+with+the+mitotic+apparatus+during+early+embryogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila.</a> Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).</li>
<li>Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+is+a+dynamic+structure+that+ejects+PCM+flares%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares.</a> J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Canlı hücre görüntüleme kök hücre ACD, hücre soylarının farklılaşmasını düzenleyen mekanizmaları incelemek için kullanılan çok değerli bir yaklaşım ve kompleks dokuların morfolojisi olan. Araştırma grupları tarihsel NB ACD görselleştirmek için çeşitli teknikler istihdam olmasına rağmen, bu yaklaşımlar genellikle öncelikle beyin dokusu bozulmadan sola veya ayrışmış olup olmadığını açısından farklılık iki kategoride toplanabilir. Görüntüleme Onaylanmış avantajları vardır ayrışmış. İlk olarak, ...

Kök hücreleri erken gelişim sırasında hücresel çeşitlilik oluşturmak ve yetişkin dokularda hasar gören hücrelerin yerine bir farklılaşma denge ve kendini yenileme korumak. Bu homeostazının düzenlenmesi kaybı ve zararlı doku dejenerasyonu ya da tümör oluşumu ile sonuçlanabilir kök hücre popülasyonunun aşırı genişlemesini hem de önler. Nöroblastomun (Onaylanmış) Drosophila merkezi sinir sistemi (Şekil 1A) embriyonik aşamalarında 1, 2 sırasında o ilk formu çok çalışılan nöral kök hücrelerdir. Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Onaylanmış iki eşitsiz kaderde hücreleri üretmek için asimetrik hücre bölünmesi (ACD) tekrarlanan mermi tabi. ACD sentrozom, çoğu hücre 3&#39;ün mikrotübül organizasyon merkezi olarak hareket olmayan zar organeller tarafından yönlendirilmektedir. Mitoz sırasında NB centrosomes düzenlemek ve apikal-bazal polar boyunca bipolar mitotik iğ yönlendirmekSığ ekseni. Bölünmesi NB ayrılması üzerine, kök hücre kaderini belirlemek apikal kader belirleyici ve farklılaşma belirtmek bazal kader belirleyici, eşitsiz kızı hücrelere ayrılmış olan. Larva orta beyinde, Onaylanmış iki tür bunların sayısı, konumu, transkripsiyon faktörü ifadesi ve hücre soyu (Şekil 1A) 4-6 ile ayırt edilebilir. I Onaylanmış en bol olan yazın ve yaklaşık 90 tanesi beyin 7 her optik lob ön ve arka tarafı doldurmak. Bu Onaylanmış transkripsiyon faktörü asense (Ase) ifade ve karakteristik bir kendini yenileyen NB bölmek ve bir küçük ganglion anne hücre (GMC; Şekil 1B). Her GMC iki nöron veya glia (Şekil 1B) oluşturmak için tek bir terminal bölümü uğrar. Buna karşılık, her bir optik lobun arka tarafını doldurmak sekiz Tip II NBs Ase ifadesini 5. yoksundur. Onlar ACD geçmesibir kendini yenileyen NB ve bir ara nöral progenitör (INP) üretmek. INP da, asimetrik 3-5 kez böler. InP rejenerasyonu ve tek GMC 4 üretiminde Bu bölümler bir sonuç her biri. Toplu olarak, özel NB kimliği ve GMC doğum zamansal sırası, yetişkin merkezi sinir sisteminin nöronal şaşırtıcı çeşitliliğine yol açar. NB ACD temelini hücre biyolojisi çok canlı hücre görüntüleme tekniklerinin kullanılması ile geliştirilmiştir Anlamak. Görüntü canlı NB&#39;ler için araştırmacılar tarafından kullanılan yayınlanan protokolleri yaygın olarak değişebilir. Genel olarak, bununla birlikte, bu yöntemler, larva beyin değişmeden kalır ya da mekanik olarak ayrışmış olup olmadığını ayırt iki genel kategoride toplanabilir. Her iki teknik araştırmacının uygulamaya bağlı olarak, farklı avantaj ve dezavantajları var. Canlı NB hücre Divi ortaya Erken raporlarları larva beyin manuel ayrışma bir dereceye içerir. Bu protokoller detay 8 bulaşıyor ya da cam lamelleri Onaylanmış kısa vadeli birincil kültürleri büyümek için ayrı 9 beyin alay. Görüntüleme geliştirmek için, yuvarlak Onaylanmış genellikle cam slaytlar 8 veya agaroz pedleri 9 ile ya lamelleri üzerinde düzleştirilir. Düzleştirilmiş hücreler optik geliştirilmiş olmasına rağmen, bu teknikler çoğu zaman bölünme karık gerileme ve birden çok kez bölmek için yetersizlik de dahil olmak üzere, NB mitotik kusurlarına yol açar. Bu nedenle, manuel Ayrışma ve larva beyin dokusunun fiziksel bozulmasını hem içeren protokolleri genellikle sadece çok kısa vadeli (yani., Bir hücre döngü ya da daha az) uygulamaları için uygundur. Aynı şekilde, yarı silinmesine veya tamamen cam slaytlar ve lamelleri arasındaki sağlam beyinleri düzleştirme birinin bir, yaklaşık 30 dakikalık bir süre için 10, belirli bir örnek görüntüleme harcayabilir zamanını sınırlar. Bu sınırlama, thi rağmenyaklaşımı başarıyla 11-14 kullanılmaktadır. Görüntü canlı için son çabalar NBs limiti izole hücrelerin fiziksel bozulma ayrışmış. Bu teknikler, birden fazla hücre bölünmesi devir için hücre kültürlerinin sürdürmek için gerekli olan uygulamalar için özellikle yararlıdır. Örneğin, el ile ayrışmış beyinlerinden alınmış dağılmış hücrelerden, kısmen uzun süreli görüntüleme 16 fibrinojen ve trombin 15 karışımından yapılan bir pıhtı gömülü olabilir. Seçenek olarak ise, eksplante beyin kimyasal olarak, enzim bir sonraki el ile bir pipet ucu ile tekrar geçirilerek kesintiye kolajenaz, ve daha sonra poli-L-lisin-kaplamalı cam alt yemekler 17, 18, ​​kaplama ile ayrıştırılmış ilk olabilir. Fibrinojen ya da poli-L-lisin ya cam yemekleri Kaplama önemli fiziksel bozulma olmadan mümkün olduğu lamel onları yakın getirerek, yuvarlak hücrelerin yayılmasını eki ve hafif teşvik etmektedir. Additi yılında, bu yöntemler, hali hazırda pertürbasyon farmakolojik deneyler 18 için değiş tokuş edilebilir bir ortam içinde kültür edilmesini Onaylanmış içerir. Genel olarak, doğrudan kaplama NBs uzun vadeli görüntüleme yetenekleri ödün vermeden görüntüleme optik geliştirir dağıldılar. Son zamanlarda, ayrışmış Onaylanmış uzun vadeli kültürlemenin açıklayan bir protokol 19 ayrıntılı olmuştur. Ancak, bu yaklaşım sınırlamaları olmadan değildir. Canlı ayrışmış Onaylanmış görüntüleme için çeşitli uyarılar vardır. Dağılmış bir hücre alanında, örneğin, uzamsal olarak sağlam bir beyin 1 düzenlenmesiyle belirli NB soy tespit etmek zordur. Aynı şekilde, Tip II ayrışmış doku içinde Onaylanmış karşı Tip I ayırt örneğin worniu-GAL4, asense Gal80-20 gibi soy ajanları ya da alt tip spesifik transgenlerin, ekspresyonuna olmadan da zordur. Bu transgenler, bazı uygulamalar için oldukça yararlı olsa da, bu eski transgenler için araştırmacılar sınırı yokturUAS güçlendirici elemanın 21 kontrolünde preslenmiş ve daha karmaşık genetik düzenleri gerektirir. Onaylanmış mekansal ya da zamansal geliştirilmesiyle ilgili çalışmalar, bu nedenle, bir sağlam doku bağlamında in vivo görüntüleme gerektirir. Ayrıca, ayrışmış embriyonik Onaylanmış çalışmaları önemli polarite interfaz lokalizasyonu 22, 23, belirleyicilerinin için bitişik hücrelerin fiziksel temas kritik olduğunu gösterir. Bu çalışmalar tamamen izole NBs artık değişmez mitotik iğ ekseni korumak göstermektedir. Bunun yerine, bu hücreler nedeniyle belki de apikal centrosome konumlandırma 22 kaybı daha randomize mili ekseni ve ardışık GMC tomurcukları arasındaki ayrılık, geniş açıları gösterilecek. Larva NB&#39;ler ve komşu hücreler arasındaki ilişki yaygın olarak incelenmiştir olmasına rağmen, bu larva kök hücre mikroçevresinin hücre polarite veya diğer değindiği olabileceğini dikkate değerdavranışları. Larva Onaylanmış fizyolojik içeriği muhafaza edilmesi için, tüm beyinlerinden biz görüntü ACD. Görüntüleme ayrışmış NB&#39;ler ile ilişkili doğal sınırlamalar dikkate alındığında, bizim laboratuvar ve diğerleri bütün larva beyinlerinden NB KHA görüntü ardışık tur protokolleri kurduk. Görüntü bozulmadan beyin teknikler genellikle doku bozulmasını veya zarar görmesini önlemek ve gaz değişimi için izin vermek için esnek bir membran ile kültür odasının bir tarafında cam sert yüzey değiştirin. Bazı yöntemler böcek kültür ortamı, serum ve on larva 24 izole edilmiş organlarla yağ, askorbik asit içeren bir karışım içerisinde eksplante beyinleri montaj içerir. Bu NB hücre bölünmesini teşvik 25 bilinen bir mitojen salgılayan için izole edilmiş yağ gövdeleri eklenir. Bu protokol üzerinde 3 saat için doku bütünlüğünü koruyan ve uzun süreli görüntüleme 24, 26-28 için uygun, bu nedenle,. Son zamanlarda, boylam açıklayan bir protokolaskorbik asit, serum ve yağ organlar mevcudiyetinde sağlam larva beyinlerin g İÇİ görüntüleme 29, ayrıntılı edilmiştir. Doku maruz ne de hareketsizleştirilir için önemlisi, bu yaklaşım kültürleme ortam değiştirilir uygulamalar için daha az faydalı olan (örneğin, vb, ilaç araştırmaları, imüno-,.). Bizim laboratuvar uzun vadeli görüntüleme 30, 31 canlı larva beyinlerinin bütün montaj hazırlanmasını kolaylaştırmıştır. Başkaları üzerinde bizim protokolüne ana avantajı basitliği: bizim gözlemler NB KHA görüntü ardışık tur için gerekli katkı maddeleri ne serum, askorbik asit, insülin, ne de yağ organları gösterir. İnsülin gibi katkı maddeleri, kök hücre bölünmesi 32 ve Drosophila yumurtalık 33 toplu hücre göçü uzun görüntüleme için yararlı olmuştur, ancak eden görüntüleme ortamı sta basit bir karışımından oluşur, onlar, NB ACD için önemsiz görünmektedirndard böcek hücre kültürü ortamı bulaşmasını önlemek için antibiyotik-antimikotik ile takviye edilmiştir. Yeniden gaz-geçirgen veya cam alt kültür yemekleri kullanımı sayesinde, biz ardışık NB acds birkaç tur sürdürmek mümkün olmuştur. Aynı eksplante örnekler hali hazırda, bağışıklık ve sabit dokusu ile diğer işlemler için de kullanılabilir. Bu protokol, biz detay sağlam larva beyinlerinin diseksiyonu, yanı sıra canlı ve sabit hem de analiz için beyin hazırlanması.

<table><tbody><tr><td>Lumox doku kültürü kabı 50 x 12 mm</td><td>Sarstedt</td><td>94.6077.410</td><td>Gaz geçirgen ve optik olarak şeffaf film tabanına sahip yeniden kullanılabilir bir kültür kabı.</td></tr><tr><td>Schneider's S2 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiyotik-Antimikotik (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Penisilin (10.000 U/ml), streptomisin (10.000 &# 956; g / ml) ve amfoterisin B (25 & # 956; g/ml) bakteri ve mantar kontaminasyonunu önlemek için Schneider'in S2 ortamına eklenir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cam lameller, #1.5 22 x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Halokarbon yağı 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898</td><td>Berrak ve renksiz yüksek viskoziteli inert bir yağ.</td></tr><tr><td>Bir çift nikel kaplı pim tutucu, 17 cm uzunluğunda</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>Çift Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Plastik saplı diseksiyon iğnesi/probu</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-965-A</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi, 0.22 &#956; m gözenek boyutu</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Plastik transfer pipeti</td><td>Fisher Scientific</td><td>S30467-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit, %32 EM dereceli</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15714</td><td>DİKKAT: Formaldehit toksiktir; çeker ocakta tutulmalıdır. Güvenli kullanım için MSDS yönergelerini izleyin.</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, dihidroklorür)</td><td>İnvitrojen</td><td>D1306</td><td>DNA'yı etiketleyen ve UV ışığı tarafından uyarılan bir boya.</td></tr></tbody></table>

canlı görüntüleme<em&gt; drosophila</em&gt; larva nöroblastomun

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Bir kendini yenileyen kök hücre ve farklılaşan hücre: Kök hücreler, eşitsiz kader potansiyelli iki döl hücreleri üretmek için asimetrik bölün. Asimetrik kök hücre bölünmesi çalışmanın sağlam bir alan olmuştur yöneten mekanizmaların anlaşılması, geliştirilmesi ve hastalık onların alaka önüne alındığında. Bunlar genetik uysal ve bir kez, her saat hücre bölünmesinin ardışık mermi geçmesi için, Drosophila merkezi sinir sistemi veya neuroblasts kök hücreler, kök hücre bölünme çalışma için vazgeçilmez modellerdir. Yaklaşık 100 nöral kök hücre canlı görüntüleme çalışmaları için mikroskopi Bu model sistemi, özellikle faydalı bir hale getirir, her iki larva beyin lob her yüzeyine yakın olarak yerleştirilir. Bu çalışmada, yaygın kök hücre bölünmeleri görselleştirmek için kullanılan çeşitli yaklaşımlar gözden ve biz göreceli avantaj ve bozulmamış beyin dokularında karşı ayrışmış çalıştırırız bu tekniklerin dezavantajlarını ele. Biz de detay bizim simplified protokol canlı hücre görüntüleme için Üçüncü dönem larva ve sabit analiz uygulamaları bütün beyinleri eksplantasyona için kullanılır.

Canlı görüntüleme, NB ACD düzenleyen mekanizmalar bir dizi açıklamıştır. Önceki görüntü elde etme için, bu uygun görüntüleme koşulları belirlemek için gereklidir. Bu canlı hücre görüntüleme süresi ile kare yakalama hızını dengelemek için gereklidir. Ince hücre analizi için, örneğin, geçici artış ve optik çözünürlük gerekli olabilir. Tek bir NB hücre döngüsü (Şekil 4A) imgelerken, görüntüler yakalanır hangi hızı fotohasar tanıtan olmadan artabilir. Tipik olarak, tek bir hücre bölünmesi olayları, yaklaşık...

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Bu prosedürün genel amacı, asimetrik kök hücre bölünmelerini, hücresel farklılaşmayı ve morfogenezi incelemek amacıyla, üçüncü dönem oph larvalarının sağlam MSS'sinin diseksiyonunu detaylandırmaktır. Bu işlem, öncelikle kaba diseksiyon yoluyla MSS'nin larval gövdeden eksize edilmesiyle gerçekleştirilir.İkinci adım, özel yapım araçlar kullanılarak gerçekleştirilen hassas mikrodissection ile sağlam beyni periferik dokulardan izole etmektir. Ardından, sağlıklı beyinler ya canlı hücre görüntüleme için monte edilir ya da kimyasal fiksasyona ve immunfloresansa tabi tutulur; son aşamada, nöral kök hücre bölünmelerini yöneten olayları göstermek ve MSS gelişimi hakkında mekanistik içgörü sağlamak için spinning disc konfokal mikroskopi kullanılır. Bu yöntem, kök hücre, kanser ve nöral gelişim alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Kök hücre proliferasyonunun nasıl düzenlendiğine dair anlayışımıza katkıda bulunarak, ABER kök hücre bölünmesinin tümoregenez ve mikrosefali ile ilişkili olduğunu biliyoruz ve görüntüleme çalışmalarımız bu kök hücre bölünmelerini düzenleyen mekanizmaları ortaya çıkarmaktadır. Bu yöntemin görsel olarak gösterimi kritiktir çünkü beynin mikrodi

live-imaging-of-drosophila-larval-neuroblasts

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Source: Hellerman, M. B., et al. Drosophila Pupa Gözünün canlı görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2015)Video, bir Drosophila melanogaster pupasında göz desenini incelemek için canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Yeşil floresan proteini (GFP) etiketli belirteçler, gelişmekte olan göz yapısının oluşumu sırasında hücresel organizasyonun ve farklılaşmanın görselleştirilmesini sağlar.

Floresan mikroskobu kullanılarak Drosophila pupa gözünün canlı görüntülenmesi

Burada apoptotik hücre boşluk dinamikleri eğitim için etkili bir yöntem...

Apoptotik hücresi Temizliği görüntülenmesi sırasında Canlı<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Bu protokol uzun vadeli ex vivo kültür ve Drosophila hayali diskin canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem tarif etmektedir. Göz diskin canlı görüntüleme 10 saat süre içinde fotoreseptör farklılaşma ve ommatidial dönüşünü gösterir. protokol basit ve pahalı kurulum gerektirmez.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Burada, Drosophila larva beyninin canlı bir hazırlığında son derece hareketli dendritik filopodia'yı görüntülemek için uyguladığımız yöntemi ve dendritin kantitatif değerlendirmeleri için hızlandırılmış 3D görüntüleme veri kümelerini ölçmek için geliştirdiğimiz protokolü anlatıyoruz. nöronlar gelişmekte dinamikleri.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Burada, fizyolojik koşullar altında hücresel ve hücre altı dinamikleri gözlemlemek için Drosophila melanogaster üçüncü instar larvalarından canlı eksplant beyinlerini hazırlamak, parçalamak, monte etmek ve görüntülemek için bir iş akışını tartışıyoruz.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin Drosophila larva beyninde canlı hücre görüntüleme yöntemiyle asimetrik nöral kök hücre bölünmelerini incelemeyi. Bu teknik sinir sistemi gelişimi ve kök hücre davranışları hakkında mekanistik bilgiler sağlar.

Canlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet