A Guide In vivo Tek birim Kayıt

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kanal kökünü iki eksprese eden farelerde kortikal inter nöronlardan yüksek kaliteli hücre dışı tek birim kayıtları elde etmektir. Bu, mavi ışık darbelerine ani tepkilerden inter nöronları tanımlamak için doku boyunca yüksek empedanslı bir kayıt elektrodunun ilerletilmesiyle elde edilir. Elektrik sinyali, uygun ilerleme oranını ve kararlı, iyi izole edilmiş bir kayıt elde etme olasılığını gösteren değişiklikler için izlenir.

İyi bir tek birim izolasyonu sağlanamazsa veya tersine ışığa duyarlı nöronlarla nadiren karşılaşılırsa, kayıt elektrodunu değiştirin. Sonuçlar, optik olarak nöronlara tanımlanan ışık tepkilerinin güvenilirliğini ve bu strateji ile elde edilen tipik sinyal-gürültü oranını göstermektedir. Foto stimülasyon yaklaşımı, standart bir hücre dışı amplifikatör ve mavi ışık kullanarak genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerini hedeflemenin erişilebilir ve ucuz bir yoludur.

Bu, anestezik işitsel kortekste belirli iç nöronları pezevenkleştirmek için stratejimizdir, ancak daha genel noktalar, seyrek hücre tiplerinden ziyade diğer kortikal alanlar için geçerlidir. Hayvan, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin meine kokteyli ile uyuşturulduktan sonra, stereotaksik veya başka bir baş tutma aparatına yerleştirin, kafatasının iyi bir şekilde sabitlendiğinden emin olun. Bu, kararlı tek hücreli kayıtları korumak için gereklidir.

Daha sonra, kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün ve hayvanın vücut ısısını 37 santigrat derecede tutun, ek kayıt stabilitesi için bir CI sternal drenaj gerçekleştirin, CI sternum magnasını ortaya çıkarmak için bir neşter bıçağıyla arka kafatasından dokuyu çıkarın. Ardından, beyin omurilik sıvısını boşaltmak için bıçağın ucuyla Dora'ya küçük bir çentik atın. Şimdi neşteri kullanarak, kortikal ilgi alanı üzerinde küçük bir kraniyotomi yapın.

Bundan sonra, durayı çıkarın, ardından açıkta kalan korteksi ılık aros tabakası ile örtün. Agros'u tuzlu su ile nemli tutun. Bir dil standı elektrodu hazırlayın.

Elektrodu süper yapıştırıcı ve hızlandırıcı ile bir cam kılcal tüpe yapıştırın. Ardından kavrama için ısıyla daralan makaron ekleyin. Daha sonra, elektrodu motorlu veya hidrolik bir mikrom manipülatörüne monte edin ve kortikal yüzeye dik olarak hareket edecek şekilde ayarlayın.

Derinin altına kafatasına doğru bir topraklama kablosu kaydırın. Başın yan tarafındaki ve boynun arkasındaki kaslarla temastan kaçının, çünkü bunlar miyografik artefaktlar oluşturabilir. Elektrik sinyali, tercihen bir empedans kontrol modu ile donatılmış, tek ünite kaydı için uygun bir hücre dışı amplifikatör kullanılarak yükseltilir.

Devam eden ani yükselme aktivitesi, iki osiloskop ve bir dizi elektrikli hoparlör ile izlenir. Şimdi elektrodu agrostan geçirin ve yedi ila 14 mega ohm arasında olduğundan emin olmak için empedansını test edin. Uç korteksin yüzeyini kırdığında, mikrom manipülatörü üzerindeki bu konumu sıfırlayın.

Kayıt derinliğini en iyi şekilde tahmin etmek için, elektrot ucunun kortikal yüzeyden sıfır derinlikte çıktığını görsel olarak onaylayın. Bu sıfır ayar ayar noktasının korteksin seviyesine karşılık geldiğinden emin olmak için işitsel korteksteki bir penetrasyonun sonunda elektrodu geri çekerken, uyaran uyarılmış alan potansiyellerini izler. Elektrodu dokunun ilk birkaç yüz mikrometresi boyunca ilerletirken, yerel alan potansiyelinin polaritesinin 100 mikrometre derinlikte tersine döndüğünü doğrulayın.

Ardından, mavi ışık kaynağına bağlı bir optik fiberi manuel bir mikro manipülatöre monte edin. Belirtilen genişlik ve uzunlukta bir TTL darbe dizisi sağlayabilen kontrol ünitesi ile ışık kaynağının çıkışını düzenleyin. Ardından her iki osiloskoptaki sinyali izleyin.

Bir güç ölçer kullanarak optik fiberin ucundaki toplam ışık gücünü ölçün. Işınımı, fiber çekirdeğin kesit alanına bölerek hesaplamak için bu değeri kullanın. Milimetre kare başına 10 ila 15 miliwatt aralığındaki değerle başlayın.

Mikroskobu kullanarak, lifin ucunu aros yüzeyine mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Elektrotun dokuya gireceği ışını ortalayın. Şimdi arostaki elektrot ile ışık artefaktları olup olmadığını kontrol edin.

Bir nabız gerginliği verin. Gelen ışığın açısını değiştirmek için optik fiberi elektroda göre yeniden konumlandırarak geçici ışık artefaktlarını ortadan kaldırın. Yapaylıklar devam ederse, ışık gücünü azaltmayı deneyin.

Daha sonra, elektrodu saniyede yaklaşık bir mikrometre hızında beyinden yavaşça ilerletin. Elektrotun devam eden aktivitesini izlemek için bir osiloskop kullanın. Lazer darbelerini tetiklemek için diğerini kullanın.

Ses monitöründe uyandırılan ışığın soluk karmasını dinleyin, bu da elektrotun bir kanal opsin pozitif hücreye yaklaştığını gösterir. Ardından, ışık uyanır uyanmaz ilerleme hızını yavaşlatın. Sivri uçlar, osiloskop üzerinde ayrı ayrı tetiklenebilecek kadar büyüktür.

Bunu yapmaya başlayın. Spike dalga formunun tam şeklini gözlemlemek için yatay eksende bir ölçek ayarlayın. Bu noktada, elektrodu ilerletmeyi bırakın ve dokuya yerleşmesini bekleyin.

Bu, kararlı bir kayıt için çok önemlidir. Birkaç dakika sonra, sinyal-gürültü oranı düzelmediyse, beş mikrometre daha ilerleyin ve bekleyin. Yine, bir aksiyon potansiyelinin tepe noktası veya çukuru bir voltaj eşiği ile güvenilir bir şekilde yakalanana kadar bu işlemi tekrarlayın.

Kayıt sırasında gürültü tabanının oldukça üzerine ayarlayın. İlk osiloskopta devam eden aktiviteyi izleyin. Aynı zamanda, ikinci osiloskopu kullanarak sivri uçların boyutuna ve şekline dikkat edin ve seslerinin kalitesini hoparlöre not edin.

Hücrenin elektroda çok yaklaştığını veya uzaklaştığını gösteren ani değişiklikleri dikkatlice dinleyin. Sivri uçlar büyür ve bozulursa, elektrodu geri çekin. Küçülürlerse, elektrodu ilerletin.

Sivri uçların kalitesini doğrulamak için iki mikrometrelik adımlarla yavaşça hareket edin. Tüm ani dalga biçimini çok çeşitli eşik değerleri boyunca üst üste bindirin. Düzgün yükseklikte yalnızca bir tutarlı başak şekli görülmelidir.

Çoğu PV pozitif hücre, tam bir saniye boyunca ateşlemeyi sürdürebilir. Sinyal, komşu bir nörondan gelen sivri uçlarla kontamine olursa, elektrodu ilerletin ve her penetrasyonda yeni bir hücre arayın, elektrotu tüm korteks derinliği boyunca indirin. Birçok penetrasyondan sonra ışığa duyarlı nöronlarla karşılaşılmazsa veya tersine, kayıtlar rutin olarak komşu kanaldan, opsin negatif hücrelerden gelen sivri uçlarla kontamine olur, yeni bir elektrot deneyin.

Bu şekil, optik olarak tanımlanmış üç tür inter nörondan örnek kayıtları göstermektedir. Hücreler, arama nabız trenine güvenilir bir sivri uç patlaması ile yanıt verir. Burada 100 tr çizgi sivri uçları ve ortalama enterpolasyonlu dalga formu gösterilmektedir.

Bu liste grafikleri, ışıkla uyarılan ani artışların tutarlı zamanlamasını gösterir. Bir güç örneği için ilk ani artış gecikme süreleri. Volin pozitif inter nöronlar burada sunulmuştur.

Foto stimülasyon yaklaşımı kavramsal olarak çok basittir, ancak şaşırtıcı derecede zorlayıcı ve düşük verim olabilir. Uygulamada. Cam yama elektrotları parametal nöronlara karşı güçlü bir şekilde önyargılıdır, bu nedenle iç nöronları çok sık almazsınız.

Öte yandan, tetrolarla bol miktarda ışığa duyarlı inter nöron elde edersiniz, ancak sivri uçlar küçüktür ve çok sayıda örtüşen dalga formu vardır, bu nedenle güvenilir bir şekilde tek birimlere ayırmak çok zordur. Bunu birçok farklı şekilde gerçekleştirmeye çalışıyoruz ve iç nöronlar için, bu keskin 10 ila 14 mega elektrotların, meşe sivri uçlarının ışığını uzaktan algılayacak kadar büyük olması gereken dinleme yarıçapı açısından doğru dengeyi sağladığını bulduk, ancak iyi bir tek birim izolasyonu elde etmek için yeterince kısıtlı olmalı. Yine de biraz vudu var.

Bunu başaramazsanız, sadece o elektrotu atıp işe yarayan bir tane bulana kadar bir sonrakine geçerek kendinize çok zaman kazandıracaksınız.