Name: A Guide In vivo Tek birim Kayıt (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Öğrenin, anestezili fare korteksinden ChR2 eksprese eden inhibitör internöronlarda yüksek kaliteli tek birim kayıtlar elde etme yöntemini. Optogenetik tanımlama, elektrofizyolojik kayıtların hassasiyetini artırır ve maliyet-etkin bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Whitehall Vakfı ve NIH tarafından finanse edilmiştir. Clifford Dax'a (Oregon Üniversitesi Teknik Destek İdaresi) ışık dağıtımı için bir devre tasarlama konusundaki yardımı ve uzmanlığı için teşekkür ederiz.

NOT: Oregon Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan aşağıdaki protokol sağlık kuralları National Institutes uygundur. 1. Akut Cerrahi <ol><li> Intraperitonal (ip) enjeksiyon (Tablo 1) ile, bir ketamin-medetomidin kokteyl ile hayvan anestezisi. Not: Bu deneylerde kullanılan fare sürücü hatları (, SST-iCre12 SOM +; * Cr iCre12, CR + Pvalb-iCre11 PV +) interneuron bir CRE bağımlı ChR2 EYFP transgenik line10 çaprazlama yoluyla üretilir. CHR2 veya ilgili opsins viral iletim benzer ekspresyon düzeyleri elde varsayarak, eşit derecede iyi çalışmasıdır. </li><li> Ameliyat başlamadan önce, emin olun hayvan sergiler nazik bir ayak tutam hiçbir yanıt olduğunu. Bu anestezi derinliği korumak için gerekli olarak deney boyunca anestezi yeniden yönetmek. Enjektabl anestezikler kullanıyorsanız, isteğe bağlı olarak bakım enjeksiyonlar için ip kateter implant. </li><li> Tuzlu su ya da bakım enjeksiyonlar (Tablo 1), uygun bir şekilde seyreltilir anestezik kokteyli kullanarak, örneğin, deney boyunca laktatlanmış Ringer çözeltisi (yaklaşık 3 ml / kg / saat) ile sulu hayvan tutun. </li><li> Sterotaksik veya diğer baş tutma cihazında hayvan yerleştirin. Kafatası iyi korunan emin olun. Bu kararlı tek hücre kayıtları muhafaza etmek için gereklidir. </li><li> Kuruluğunu önlemek için gözlerin için opthalamic merhem sürün. 36,5-37 ° C vücut ısısını korumak. </li><li> Ek kayıt istikrar için bir sisternal drenaj gerçekleştirin. Bir neşter bıçak kullanarak, sisterna magna maruz kafatasının arka yüzündeki doku kaldırmak. Serebrospinal sıvı boşaltmak için, dura içinde küçük bir çentik olun. Bıçağın sadece çok uç kullanın ve beyincik veya beyin sapıyla temas kaçının. </li><li> Bisturi kullanarak, işitsel için (ilgi kortikal alanı üzerinde küçük bir kranyotomiyi (~ 2 mm 2) gerçekleştirmekkorteks bregmaya kabaca -2,3 mm posterior, orta hatta 4,5 mm lateral). </li><li> Dura çıkarın ve sıcak 0.5 agaroz tabakası ile maruz korteksi kapak - 1 mm kalınlığında (tuzlu su içinde% 1.5 agaroz,% 0.9 NaCl, en geçerli ~ 37 ° C). Periyodik tuz birkaç damla damlatılarak deney boyunca agaroz nemli tutmak. </li></ol> 2. Kayıt Set-up <ol><li> Tungsten elektrot hazırlayın (7-14 MΩ, 127 mikron çapında, 12 ° konik ucu, epoksi kaplı). Bir cam kılcal tüp elektrodu superglue ve kavrama (Şekil 1) ısı ile büzülen boru ekleyin. </li><li> Kortikal yüzeye dik seyahat için ayarlanmış bir motorlu (veya hidrolik) mikromanipülatör elektrot, monte edin. Kafatası karşı, deri altında bir tel zemin kaydırın. Onlar elektromiyografik eserler üretmek gibi baş tarafı ve boyun arkasındaki kasları ile temastan kaçının. </li><li> Bir hücre dışı amfi kullanarak elektrik sinyali yükseltinTek ünite kayıt için uygun li fi er, tercihen bir empedans kontrol modu ile donatılmıştır. İki Osiloskoplara ve güçlendirilmiş hoparlör setini - devam eden spike aktivitesini (5000 Hz bant geçiren 300) izleyin. Burada, kaydedilen veriler 10 kHz örnekleme hızında sürekli sayısallaştırılmaktadır; ani çevrimdışı ayıklanır. </li><li> Ucu korteks yüzeyine ulaşıncaya kadar agaroz aracılığıyla elektrot ilerlemek. Bir mikroskop aracılığıyla bu adımı gözlemleyin. &quot;Sıfır&quot; mikromanipülatör bu pozisyon. </li><li> En iyi kayıt derinliğini tahmin etmek üzere görsel olarak penetrasyon sonunda elektrot geri çekildiği zaman, elektrot ucu sıfır derinlikte kortikal yüzeyinden çıkar olduğunu teyit etmektedir. Not: manipülatör okuma ve gözlenen elektrot konumu arasında bir farklılık bu dokuya göre sürüklenmiştir gösterir. Bu beyin ya da hayvan ya da manipülatör sürüklenme istikrarsızlık neden olabilir. <ol><li> Sağlamak için ilave bir kontrol olarakdoku ilk birkaç yüz mikrometre ile ilerletirken bu sıfır set-noktası korteks yüzeyine karşılık gelen, uyarıcı-uyarılmış alan potansiyelleri izlemek. Alan potansiyelleri izlerken, 10 Hz dışı amplifikatör alt bant geçiren filtre kesme indirin. Yerel alan potansiyelinin polaritesi tabakası I / II sınır 13 yakın, ~ 100 mikron derinliğinde etrafında tersine onaylayın. Bu işitsel korteks için güvenilir bir referans noktasıdır, ama diğer kortikal alanlar için farklı olabilir. </li></ol></li><li> Manuel bir mikromanipülatör üzerine bir mavi ışık kaynağı (Şekil 2) bağlı olan bir optik fiber monte edin. Mikroskop kullanarak, mümkün olan en agaroz yüzeyine yakın olarak, elyafın ucu yerleştirin. Elektrot dokuya girecek ışını Merkezlenmesi. </li><li> Belirtilen genişlik ve duratio bir TTL (transistör-transistör mantığı) darbe katarı sunma yeteneğine bir kontrol ünitesi ile ışık kaynağının çıkış düzenleyenn, örneğin, bir Arduino (Şekil 3), (gösterildiği gibi), bir bilgisayar I / O kartı ya da ticari olarak temin edilebilir darbe üreteci. <ol><li> Her iki osiloskoplarda sinyali izleyin. </li></ol></li><li> Bir güç ölçer kullanarak fiber optik ucunda toplam ışık gücü (mW) ölçün. Elyaf çekirdeğin kesit alanına bölünmesi ile ışınlama (mW / mm2) hesaplamak için bu değeri kullanın. 10 aralığı içinde bir yoğunluk değeri ile başlayın - 15 mW / mm 2 ve gerekirse eserler ortadan kalkıncaya kadar aşağı doğru ayarlanır. </li><li> Doku girmek için hazırlanıyor agaroz elektrot, hafif eserler için kontrol edin. Arama darbe tren başlatın (örneğin, 30 msn ışık darbeleri, 500 msn interstimulus aralığı (ISI)). <ol><li> Işığın açısını değiştirmek için elektrot için fiber optik göreceli konumlandırma geçici ışık eserler (Şekil 4) eleyin. Eserler devam ederse, ışık gücünü azaltmayı deneyin. The eserler tamamen (sadece minimize) elimine edilemez nadir durumda, arama darbenin süresini uzatmak. Bu doğru nöronal sivri tanınmasına yardımcı olabilir. </li></ol></li></ol> 3. Düz PINP-in &#39; <ol><li> Yaklaşık olarak 1 mm / sn bir hızda, beyin boyunca yavaşça elektrot ilerletin. Devam eden aktivitesini izlemek için bir osiloskop kullanın. Öte yandan, lazer impulslarından tetikleyebilir. </li><li> Elektrot bir ChR2 + hücre yaklaşıyor ve sık sık elektrik sinyali osiloskop belirgindir önce iyi algılanan edilebileceğini belirtir ses monitörde ışık uyarılmış başak hafif bir &#39;karma&#39;, dinleyin. Avans hızını yavaşlatabilir. NOT: Hücre elektrot doğrudan yolunda yatıyor olursa, ışık uyarılmış aktivite büyük (ve yüksek sesle) artacak. Elektrot tek bir interneuron yaklaştıkça, karma eşit boyut ve şekle sahip küçük ama iyi tanımlanmış sivri olarak çözülür. </li><li> En kısa sürede li gibiGHT-uyarılmış sivri ayrı osiloskop kapalı tetiklemek için yeterince büyük, bu yüzden yapmaya başlar. Başak dalga kesin şeklini gözlemlemek için yatay eksende ölçekleme ayarlayın. </li><li> Durdurmak ve doku yerleşmek için bekleyin. Yakın hücreye elektrodu taşımak için günaha karşı. Bu adım, sabit bir kayıt için çok önemlidir. Birkaç dakika sonra sinyal-gürültü oranı gelişmiş değilse - ki, doku yerleşmiş, ancak herhangi bir yakın elektrot ucu hücreyi getirmemiştir - avansı 5 ileri um ve tekrar bekleyin. <ol><li> Tepe ya da aksiyon potansiyelinin çukur ya güvenilir bir gürültü kat (örneğin, +/- 300 mV veya daha fazla) üzerinde iyi ayarlanmış bir gerilim eşik ile çekilebilir kadar bu işlemi tekrarlayın. NOT: inhibitör internöronlardan PINPing zaman yanlış pozitif veya belirsizlik az risk var. Çoğu hücreleri kolayca 30 msn süresi ve inter-pul ile bakliyat bir tren takip edebilirsinizse aralığı 2-5 msn (Şekil 5) güvenilir bir ilk başak gecikme ile 500 msn, veya daha hızlı. PV + hücrelerinin büyük bir çoğunluğu, özellikle, bir tam olarak 1 sn (Şekil 6) ateşleme sağlanabilmektedir. Bu inhibitör nöronlar Çünkü, disinaptik (dolaylı) aktivasyonu önemli bir endişe değildir. </li></ol></li><li> Kayıt sırasında, ilk osiloskop devam eden etkinliğini izlemek. Boyutu ve ikinci osiloskop kullanarak sivri şekline yakın bir göz tutmak. Hoparlör kendi ses kalitesine dikkat edin. <ol><li> Hücre ya (onu kazığa veya hasar görme riski) elektrot çok yakın çizim belirtmek ani değişiklikler için dikkatle dinleyin, ya da uzağa sürüklüyor. Ani, büyük ve bozuk hale gelirse, dışarı geri; daha küçük büyürse, elektrot ilerlemek. 2 mikron adımda yavaş hareket. </li><li> Zirve veya çukur için hizalanmış tüm başak dalga formları, atma tarafından kayıt sonrası hoc kalitesini onaylayın. Voltaj thres Varytutun. Eşik değerlerin geniş bir yelpazede, sadece hiç eşit yükseklikte (Şekil 5a) tutarlı bir başak şekli olmalıdır. </li></ol></li><li> Herhangi bir noktada sinyal bir komşu nöronun gelen sivri kirlenirse, hareket. Elektrot komşu hücre aralığının dışında geçer, ama hedef nöron aralığında kalacağını kapalı-şans, yavaş yavaş ilerlemek. (Bu genellikle başarısız olur.) </li><li> Her penetrasyonu korteks (900+ mikron) tüm derinliği boyunca elektrot hareket ettirin. Işık-duyarlı nöronlar tersine, kayıtlar rutin komşu ChR2- hücrelerinden sivri ile kontamine birçok sızmalar veya sonra karşılaşılan, yeni bir elektrot deneyin. NOT: Hatta tek bir parti içinde, bireysel elektrotlar empedans ve ucu geometri önemli ölçüde değişebilir. Her iki faktör wh-ışık uyarılmış ani algılamak için yeterli büyüklükte olmalıdır elektrodun etkili &quot;dinleme yarıçapı&quot;, katkıdaIle arama, henüz tek başına bir tek interneuron kayıt sağlayacak kadar sınırlı. </li><li> Istediğiniz gibi elektrot empedansı test edin. Dokuya zarar görmesini önlemek için, iyi beyin dışında, agaroz tabakasının üst kısmında elektrodun ucu ile bunu. 7-14 MΩ aralığı içinde, tam olarak empedans bu uygulama için performans, veya verim kesin bir belirleyici değildir. Yani dinleme yarıçapı için makul bir vekil var, dedi: alt-empedanslı elektrotlar daha birimleri pick up; yüksek empedans, az. </li><li> Deneyin sonunda, böyle anestezi derinliğinin düzlemi altında anestetik aşırı dozda, ya da servikal bozma gibi kurumsal onaylı vasıtasıyla, hayvan euthanize. </li></ol>

<ol><li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, (2009).</li>
<li>Moore, A. K., Wehr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+inhibitory+interneurons+in+auditory+cortex+are+well-tuned+for+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing inhibitory interneurons in auditory cortex are well-tuned for frequency.</a> J Neurosci. 33, 13713-13723 (2013).</li>
<li>Merchant, H., de Lafuente, V., Pena-Ortega, F., Larriva-Sahd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+interneuronal+inhibition+in+the+cerebral+cortex+of+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Functional impact of interneuronal inhibition in the cerebral cortex of behaving animals.</a> Prog Neurobiol. 99, 163-178 (2012).</li>
<li>Markram, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneurons+of+the+neocortical+inhibitory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interneurons of the neocortical inhibitory system.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 793-807 (2004).</li>
<li>Atallah, B. V., Bruns, W., Carandini, M., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-expressing+interneurons+linearly+transform+cortical+responses+to+visual+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-expressing interneurons linearly transform cortical responses to visual stimuli.</a> Neuron. 73, 159-170 (2012).</li>
<li>Wilson, N. R., Runyan, C. A., Wang, F. L., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+and+subtraction+by+distinct+cortical+inhibitory+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Division and subtraction by distinct cortical inhibitory networks in vivo.</a> Nature. 488, 343-348 (2012).</li>
<li>Letzkus, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+disinhibitory+microcircuit+for+associative+fear+learning+in+the+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A disinhibitory microcircuit for associative fear learning in the auditory cortex.</a> Nature. 480, 331-335 (2011).</li>
<li>Pi, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+interneurons+that+specialize+in+disinhibitory+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cortical interneurons that specialize in disinhibitory control.</a> Nature. 503, 521-524 (2013).</li>
<li>Adesnik, H., Bruns, W., Taniguchi, H., Huang, Z. J., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neural+circuit+for+spatial+summation+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neural circuit for spatial summation in visual cortex.</a> Nature. 490, 226-231 (2012).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Hippenmeyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biol. 3, 159(2005).</li>
<li>Taniguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+of+Cre+driver+lines+for+genetic+targeting+of+GABAergic+neurons+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex.</a> Neuron. 71, 995-1013 (2011).</li>
<li>Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depth-dependent+temporal+response+properties+in+core+auditory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex.</a> J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).</li>
<li>Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+heterogeneity+of+fast-spiking+interneurons%3A+chandelier+versus+basket+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells.</a> PLoS One. 8, 70553(2013).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

PINP kavramsal olarak basit olmasına rağmen, pratikte zor olabilir. Başarının önemli bir belirleyici elektrot seçimdir. Elektrik dinleme çapı kritik bir parametredir. Bu ucu bazı mesafe uzakta bir ChR2 + hücreden hala zaman bir doğrultuda ilerleme hızını ayarlayabilirsiniz, böylece ışık-uyarılmış ani algılamak için yeterince büyük olmalıdır. Aynı zamanda, iyi bir tek birim izolasyonu sağlayacak kadar kısıtlanmalıdır. Bu elektrot da komşu ChR2- birimlerinden ani almak, olmamalıdır. Dinleme yarıçapı açısından doğru dengey...

Memeli beynini oluşturan sayısız hücre tipini karakterize etmek, nörofizyolojinin merkezi, ancak uzun süredir anlaşılması zor bir hedefi olmuştur. Örneğin, serebral korteksteki farklı inhibitör hücre tiplerinin özellikleri ve işlevi büyük ilgi gören konulardır, ancak hala nispeten bilinmemektedir. Bunun nedeni kısmen, geleneksel kör in vivo kayıt tekniklerinin farklı hücre tipleri arasında ayrım yapma yeteneklerinin sınırlı olmasıdır. Hücre dışı spike genişliği, varsayılan parvalbümin pozitif inhibitör nöronları uyarıcı piramidal hücrelerden ayırmak için kullanılabilir, ancak bu yöntem hem tip I hem de tip II hatalaratabidir 2,3. Alternatif olarak, kaydedilen nöronlar daha sonra morfolojik ve moleküler kimliklerini doğrulamak için doldurulabilir, geri kazanılabilir ve boyanabilir, ancak bu acı verici ve zaman alıcı bir süreçtir. Son zamanlarda, genetik olarak tanımlanmış inhibitör internöron popülasyonları, kalsiyum görüntüleme veya görsel olarak yönlendirilen yama kayıtları yoluyla erişilebilir hale gelmiştir. Bu yaklaşımlarda, bir kalsiyum raportörünün (GCaMP gibi) veya floresan proteinin (GFP gibi) viral veya transgenik ekspresyonu, promotör ekspresyonu ile tanımlanan hücre tiplerinin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Bu yaklaşımlar, pahalı ekipman gerektiren 2-foton mikroskobunu kullanır ve ayrıca beyin dokusunun ışık saçma özellikleri nedeniyle yüzeysel kortikal tabakalarla sınırlıdır. 
Son zamanlarda, Lima ve meslektaşları1, "PINP" veya Nöronal Popülasyonların Fotostimülasyon Destekli Tanımlanması olarak adlandırılan, in vivo genetik olarak tanımlanmış nöronal tiplere elektrofizyolojik kayıtları hedeflemek için yeni bir optogenetik uygulaması geliştirdi. Kayıtlar, belirli nöronal alt popülasyonlarda Channelrhodopsin-2 (ChR2) eksprese eden farelerde gerçekleştirilir. Nüfusun üyeleri, kısa bir mavi ışık parlamasına verdikleri tepkiyle tanımlanır. Diğer birçok optogenetik uygulamadan farklı olarak, amaç devre fonksiyonunu manipüle etmek değil, sadece genetik olarak tanımlanmış bir sınıfa ait nöronları tanımlamaktır, bu da daha sonra normal beyin fonksiyonu sırasında karakterize edilebilir. Teknik, standart hücre dışı kayıt ekipmanı ile uygulanabilir ve bu nedenle kalsiyum görüntülemeye veya görsel kılavuzlu yamaya erişilebilir ve ucuz bir alternatif olarak hizmet edebilir. Burada, anestezi uygulanmış işitsel kortekste belirli hücre tiplerinin PINPing edilmesine yönelik bir yaklaşımı, daha genel noktaların diğer preparatlarda ve beyin bölgelerinde yararlı bir şekilde uygulanabileceği beklentisiyle açıklıyoruz.
Kortekste, PIMP, inhibitör internöronların in vivo yanıt özelliklerini araştırmak için özel bir umut vaat ediyor. GABAerjik internöronlar, kortikal nöronların küçük, heterojen bir alt kümesini içerir4. Belirli moleküler belirteçlerin ekspresyonu ile işaretlenen farklı alt tiplerin, son zamanlarda kortikal devrelerde5-9 farklı hesaplama rolleri gerçekleştirdiği gösterilmiştir. Genetik araçlar geliştikçe, bu geniş sınıflara giren morfolojik ve fizyolojik olarak ayrılabilir türleri ayırt etmek mümkün olabilir. Burada, anestezi uygulanmış fare korteksindeki tanımlanmış inhibitör internöronlardan kararlı, iyi izole edilmiş tek birimli kayıtlar elde etme stratejimizi paylaşıyoruz. Bu strateji, parvalbümin pozitif (PV +) hücreleri hedeflemek için özel olarak geliştirilmiştir, ancak somatostatin eksprese eden (SOM +) ve kalretinin eksprese eden (CR +) internöronlar gibi diğer internöron tipleri için de işe yaradığını bulduk. PINPing kavramsal olarak basit olsa da, pratikte şaşırtıcı derecede inatçı olabilir. Deneme yanılma yoluyla, yöntemi deneyen diğer kişiler için yararlı olabilecek bir dizi ipucu ve püf noktası öğrendik.

<table><tbody><tr><td>ChR2-EYFP Hattı</td><td>Jackson Kolonileri</td><td>12569</td><td></td></tr><tr><td>Pvalb-iCre (PV) Hattı</td><td>Jackson Kolonileri</td><td>8069</td><td></td></tr><tr><td>Sst-iCre (SOM) Hattı</td><td>Jackson Kolonileri</td><td>13044</td><td></td></tr><tr><td>Cr-iCre (CR) Hattı</td><td>Jackson Kolonileri</td><td>10774</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>Tip III-A, Yüksek EEO</td></tr><tr><td>Mikro Nokta (dural kanca)</td><td>FST</td><td>10066-15</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Makas</td><td>FST</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Neşter</td><td>FST</td><td>10003-12 (sap), 10011-00 (bıçaklar)</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Oftalmik Merhem</td><td>Foster & Smith</td><td>9N-76855</td><td></td></tr><tr><td>Homeotermik Battaniye</td><td>Harvard Aparatı</td><td><a name="RANGE! C11 ">507220F</a></td><td></td></tr><tr><td>Tungsten Mikroelektrotlar</td><td>A-M Sistemleri</td><td>577200</td><td>12 M & Omega; AC direnci, 127 & mu; m çapı, 12 derece; konik uçlu, epoksi kaplı</td></tr><tr><td>Kılcal Cam Boru</td><td>Warner Instruments</td><td>G150TF-3</td><td></td></tr><tr><td>Isıyla Daralan Makaron</td><td>DigiKey</td><td>A332B-4-ND</td><td></td></tr><tr><td>Zapit Hızlandırıcı</td><td>DVA</td><td>SKU ZA/ZAA</td><td>Standart Süper Yapıştırıcı ile kullanın.</td></tr><tr><td>Mikroelektrot AC Amplifikatör 1800</td><td>Sistemleri</td><td>700000</td><td></td></tr><tr><td>MP-285 Motorlu Mikromanipülatör</td><td>Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>4 kanallı Dijital Osiloskoplar</td><td>Tektronix</td><td>TDS2000C</td><td></td></tr><tr><td>Güçlendirilmiş Hoparlörler</td><td>Harman</td><td>Modeli JBL ve nbsp; Duet</td><td></td></tr><tr><td>Manuel Manipülatör</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7</td><td></td></tr><tr><td>800 & m Fiber Optik Yama Kablosu</td><td>ThorLabs</td><td>FC/PC BFL37-800</td><td></td></tr><tr><td>Güç Ölçer</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D (Güç Ölçer), S121C (Standart Güç Sensörü)</td><td></td></tr><tr><td>475 nm Cree XLamp XP-E</td><td>DigiKey</td><td>XPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-ND</td><td>LED gücü ve verimliliği sürekli artmaktadır, bu nedenle en son ürünleri (www.cree.com) kontrol etmenizi öneririz.</td></tr><tr><td>Arduino UNO</td><td>DigiKey</td><td>1050-1024-ND</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide in vivo tek birim kayıt

A Guide to In vivo Single-unit Recording from Optogenetically Identified Cortical Inhibitory Interneurons

Nörofizyolojideki büyük bir meydan okuma serebral kortekste çeşitli inhibitör hücre tiplerinin yanıtı özellikleri ve işlevini karakterize etmek olmuştur. Biz burada Lima ve 1 meslektaşları tarafından geliştirilen bir yöntem kullanılarak anestezi fare kortekste tespit inhibitör itibaren istikrarlı, iyi izole edilmiş tek ünite kayıtları elde etmek için strateji paylaşıyoruz. Kayıtlar spesifik sinir hücresi alt gruplarda channelrhodopsin-2 (CHR2) ifade eden farelerde gerçekleştirilmiştir. Nüfusun üyeleri mavi ışık kısa bir flaş kendi tepkisi ile tanımlanır. &quot;PINP&quot; olarak adlandırılan, ya da Nöronal Popülasyonlarının photostimulation destekli Kimlik - - Bu teknik, standart dışı kayıt ekipmanı ile uygulanabilir. Bu genetik olarak tanımlanan hücreler, hücre dışı kayıtları hedefleme amacıyla, kalsiyum görüntüleme veya görme güdümlü yama için ucuz ve erişilebilir bir alternatif olarak kullanılabilir. Here gündelik pratikte yöntemini optimize etmek için bir ilkeler kümesi sağlar. Bu parvalbumin pozitif (PV +) hücre hedeflenmesi için özel olarak bu strateji rafine edilmiş, ancak bu tür somatostatin salgılayan (som +) ve kalretinin salgılayan (CR +) internöronlar gibi, hem de diğer interneuron türler için geçerlidir bulduk.

Biz burada "Lima ve ark. 1. Tablo 1 ayrıntıları önerilen anestezik kokteyl, ketamin-Medetomidin-acepromazine (tarafından geliştirilmiş bir Optogenetic yöntemi kullanılarak, anestezi fare kortekste genetik ilan inhibitör gelen tek birim kayıtları elde etmek için stratejimizi paylaşmak KMA "). Şekil 1 Şekil 4. 3 Arduino mikrodenetleyici ile ışık çıkışı yolluk için yapılandırma ve kodu içeren Şekil. 2 basit bir LED kontrol ünitesi için bir devre şeması ...

Burada, anestezi uygulanmış fare korteksindeki tanımlanmış inhibitör internöronlardan kararlı, iyi izole edilmiş tek birimli kayıtlar elde etme stratejimizi açıklıyoruz. ChR2 eksprese eden nöronlar, mavi ışığa verdikleri tepkilerle tanımlanır. Yöntem, standart hücre dışı kayıt ekipmanı kullanır ve kalsiyum görüntülemeye veya görsel olarak yönlendirilen yamaya ucuz bir alternatif olarak hizmet eder.

A Guide In vivo Tek birim Kayıt

A major challenge in neurophysiology has been to characterize the response properties and function of the numerous inhibitory cell types in the cerebral ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kanal kökünü iki eksprese eden farelerde kortikal inter nöronlardan yüksek kaliteli hücre dışı tek birim kayıtları elde etmektir. Bu, mavi ışık darbelerine ani tepkilerden inter nöronları tanımlamak için doku boyunca yüksek empedanslı bir kayıt elektrodunun ilerletilmesiyle elde edilir. Elektrik sinyali, uygun ilerleme oranını ve kararlı, iyi izole edilmiş bir kayıt elde etme olasılığını gösteren değişiklikler için izlenir.İyi bir tek birim izolasyonu sağlanamazsa veya tersine ışığa duyarlı nöronlarla nadiren karşılaşılırsa, kayıt elektrodunu değiştirin. Sonuçlar, optik olarak nöronlara tanımlanan ışık tepkilerinin güvenilirliğini ve bu strateji ile elde edilen tipik sinyal-gürültü oranını göstermektedir. Foto stimülasyon yaklaşımı, standart bir hücre dışı amplifikatör ve mavi ışık kullanarak genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerini hedeflemenin erişilebilir ve ucuz bir yoludur.Bu, anestezik işitsel kortekste belirli iç nöronları pezevenkleştirmek için stratejimizdir, ancak daha genel noktalar, seyrek hücre tiplerinden ziyade diğer kortikal alanlar için geçerlidir. Hayvan, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamin meine kokteyli ile uyuşturulduktan sonra, stereotaksik veya başka bir baş tutma aparatına yerleştirin, kafatasının iyi bir şekilde sabitlendiğinden emin olun. Bu, kararlı tek hücreli kayıtları korumak için gereklidir.Daha sonra, kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün ve hayvanın vücut ısısını 37 santigrat derecede tutun, ek kayıt stabilitesi için bir CI sternal drenaj gerçekleştirin, CI sternum magnasını ortaya çıkarmak için bir neşter bıçağıyla arka kafatasından dokuyu çıkarın. Ardından, beyin omurilik sıvısını boşaltmak için bıçağın ucuyla Dora'ya küçük bir çentik atın. Şimdi neşteri kullanarak, kortikal ilgi alanı üzerinde küçük bir kraniyotomi yapın.Bundan sonra, durayı çıkarın, ardından açıkta kalan korteksi ılık aros tabakası ile örtün. Agros'u tuzlu su ile nemli tutun. Bir dil standı elektrodu hazırlayın.Elektrodu süper yapıştırıcı ve hızlandırıcı ile bir cam kılcal tüpe yapıştırın. Ardından kavrama için ısıyla daralan makaron ekleyin. Daha sonra, elektrodu motorlu veya hidrolik bir mikrom manipülatörüne monte edin ve kortikal yüzeye dik olarak hareket edecek şekilde ayarlayın.Derinin altına kafatasına doğru bir topraklama kablosu kaydırın. Başın yan tarafındaki ve boynun arkasındaki kaslarla temastan kaçının, çünkü bunlar miyografik artefaktlar oluşturabilir. Elektrik sinyali, tercihen bir empedans kontrol modu ile donatılmış, tek ünite kaydı için uygun bir hücre dışı amplifikatör kullanılarak yükseltilir.Devam eden ani yükselme aktivitesi, iki osiloskop ve bir dizi elektrikli hoparlör ile izlenir. Şimdi elektrodu agrostan geçirin ve yedi ila 14 mega ohm arasında olduğundan emin olmak için empedansını test edin. Uç korteksin yüzeyini kırdığında, mikrom manipülatörü üzerindeki bu konumu sıfırlayın.Kayıt derinliğini en iyi şekilde tahmin etmek için, elektrot ucunun kortikal yüzeyden sıfır derinlikte çıktığını görsel olarak onaylayın. Bu sıfır ayar ayar noktasının korteksin seviyesine karşılık geldiğinden emin olmak için işitsel korteksteki bir penetrasyonun sonunda elektrodu geri çekerken, uyaran uyarılmış alan potansiyellerini izler. Elektrodu dokunun ilk birkaç yüz mikrometresi boyunca ilerletirken, yerel alan potansiyelinin polaritesinin 100 mikrometre derinlikte tersine döndüğünü doğrulayın.Ardından, mavi ışık kaynağına bağlı bir optik fiberi manuel bir mikro manipülatöre monte edin. Belirtilen genişlik ve uzunlukta bir TTL darbe dizisi sağlayabilen kontrol ünitesi ile ışık kaynağının çıkışını düzenleyin. Ardından her iki osiloskoptaki sinyali izleyin.Bir güç ölçer kullanarak optik fiberin ucundaki toplam ışık gücünü ölçün. Işınımı, fiber çekirdeğin kesit alanına bölerek hesaplamak için bu değeri kullanın. Milimetre kare başına 10 ila 15 miliwatt aralığındaki değerle başlayın.Mikroskobu kullanarak, lifin ucunu aros yüzeyine mümkün olduğunca yakın konumlandırın. Elektrotun dokuya gireceği ışını ortalayın. Şimdi arostaki elektrot ile ışık artefaktları olup olmadığını kontrol edin.Bir nabız gerginliği verin. Gelen ışığın açısını değiştirmek için optik fiberi elektroda göre yeniden konumlandırarak geçici ışık artefaktlarını ortadan kaldırın. Yapaylıklar devam ederse, ışık gücünü azaltmayı deneyin.Daha sonra, elektrodu saniyede yaklaşık bir mikrometre hızında beyinden yavaşça ilerletin. Elektrotun devam eden aktivitesini izlemek için bir osiloskop kullanın. Lazer darbelerini tetiklemek için diğerini kullanın.Ses monitöründe uyandırılan ışığın soluk karmasını dinleyin, bu da elektrotun bir kanal opsin pozitif hücreye yaklaştığını gösterir. Ardından, ışık uyanır uyanmaz ilerleme hızını yavaşlatın. Sivri uçlar, osiloskop üzerinde ayrı ayrı tetiklenebilecek kadar büyüktür.Bunu yapmaya başlayın. Spike dalga formunun tam şeklini gözlemlemek için yatay eksende bir ölçek ayarlayın. Bu noktada, elektrodu ilerletmeyi bırakın ve dokuya yerleşmesini bekleyin.Bu, kararlı bir kayıt için çok önemlidir. Birkaç dakika sonra, sinyal-gürültü oranı düzelmediyse, beş mikrometre daha ilerleyin ve bekleyin. Yine, bir aksiyon potansiyelinin tepe noktası veya çukuru bir voltaj eşiği ile güvenilir bir şekilde yakalanana kadar bu işlemi tekrarlayın.Kayıt sırasında gürültü tabanının oldukça üzerine ayarlayın. İlk osiloskopta devam eden aktiviteyi izleyin. Aynı zamanda, ikinci osiloskopu kullanarak sivri uçların boyutuna ve şekline dikkat edin ve seslerinin kalitesini hoparlöre not edin.Hücrenin elektroda çok yaklaştığını veya uzaklaştığını gösteren ani değişiklikleri dikkatlice dinleyin. Sivri uçlar büyür ve bozulursa, elektrodu geri çekin. Küçülürlerse, elektrodu ilerletin.Sivri uçların kalitesini doğrulamak için iki mikrometrelik adımlarla yavaşça hareket edin. Tüm ani dalga biçimini çok çeşitli eşik değerleri boyunca üst üste bindirin. Düzgün yükseklikte yalnızca bir tutarlı başak şekli görülmelidir.Çoğu PV pozitif hücre, tam bir saniye boyunca ateşlemeyi sürdürebilir. Sinyal, komşu bir nörondan gelen sivri uçlarla kontamine olursa, elektrodu ilerletin ve her penetrasyonda yeni bir hücre arayın, elektrotu tüm korteks derinliği boyunca indirin. Birçok penetrasyondan sonra ışığa duyarlı nöronlarla karşılaşılmazsa veya tersine, kayıtlar rutin olarak komşu kanaldan, opsin negatif hücrelerden gelen sivri uçlarla kontamine olur, yeni bir elektrot deneyin.Bu şekil, optik olarak tanımlanmış üç tür inter nörondan örnek kayıtları göstermektedir. Hücreler, arama nabız trenine güvenilir bir sivri uç patlaması ile yanıt verir. Burada 100 tr çizgi sivri uçları ve ortalama enterpolasyonlu dalga formu gösterilmektedir.Bu liste grafikleri, ışıkla uyarılan ani artışların tutarlı zamanlamasını gösterir. Bir güç örneği için ilk ani artış gecikme süreleri. Volin pozitif inter nöronlar burada sunulmuştur.Foto stimülasyon yaklaşımı kavramsal olarak çok basittir, ancak şaşırtıcı derecede zorlayıcı ve düşük verim olabilir. Uygulamada. Cam yama elektrotları parametal nöronlara karşı güçlü bir şekilde önyargılıdır, bu nedenle iç nöronları çok sık almazsınız.Öte yandan, tetrolarla bol miktarda ışığa duyarlı inter nöron elde edersiniz, ancak sivri uçlar küçüktür ve çok sayıda örtüşen dalga formu vardır, bu nedenle güvenilir bir şekilde tek birimlere ayırmak çok zordur. Bunu birçok farklı şekilde gerçekleştirmeye çalışıyoruz ve iç nöronlar için, bu keskin 10 ila 14 mega elektrotların, meşe sivri uçlarının ışığını uzaktan algılayacak kadar büyük olması gereken dinleme yarıçapı açısından doğru dengeyi sağladığını bulduk, ancak iyi bir tek birim izolasyonu elde etmek için yeterince kısıtlı olmalı. Yine de biraz vudu var.Bunu başaramazsanız, sadece o elektrotu atıp işe yarayan bir tane bulana kadar bir sonrakine geçerek kendinize çok zaman kazandıracaksınız.

a-guide-to-vivo-single-unit-recording-from-optogenetically-identified

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, ince uçlu bir cam mikropipet ve özel bir kurulum kullanılarak tek beyin nöronlarından gelen elektrik sinyallerinin kaydını göstermektedir. Mikropipet, farenin beynine dikkatlice yerleştirilir ve iç nöronal elektrik sinyallerini kaydetmek için nörona nüfuz etmesi için vızıldar.

Tek Bir Nörondan Hücre İçi Sinyallerin İn Vivo Kaydı

Bu video, farelerden alınan akut amigdala beyin dilimleri kullanılarak medial prefrontal korteks (mPFC) ve amigdala nöronları arasındaki sinaptik bağlantıyı analiz etmek için bir prosedürü göstermektedir. Bu farelerdeki mPFC nöronları, bir floresan proteine kaynaşmış channelrhodopsin eksprese eder. Channelrhodopsinler, ışık aktivasyonu üzerine mPFC nöronlarında iyon akışını ve aksiyon potansiyeli oluşumunu kolaylaştırır. Sonuç olarak, mPFC nöronları, postsinaptik amigdala nöronlarına bağlanan...

Amigdala Beyin Dilimindeki Nöronal Yolların Görselleştirilmesi ve Haritalanması

Bu video, medial prefrontal korteks (mPFC) aksonlarını optogenetik olarak uyararak ve LEC'deki piramidal nöronların yanıtlarını kaydederek lateral entorinal kortekste (LEC) sinaptik verimliliği inceleme prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, sinaptik plastisiteyi incelemek için yama-kelepçe kayıtlarını ışık stimülasyonu ile sinaptik aktivasyon ile birleştirir.

Sıçan Beyin Dilimlerinde Sinaptik Olayların Optogenetik Stimülasyonu ve Elektrofizyolojik Kaydı

Kaynak: Lai, J., et al. Kemirgen beyninde inhibitör ajanların eşzamanlı elektrofizyolojik kaydı ve mikro enjeksiyonları. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, sıçan superior colliculus'ta eşzamanlı nöronal kayıt ve inhibisyon için mikroenjeksiyon tabanlı bir tekniği göstermektedir. Prosedür, stereotaksik hedeflemeyi, kafatası delmeyi ve nöronal aktiviteyi kaydederken inhibe edici bir nörotransmitter sağlayan bir injectrodun yerleştirilmesini içerir. Işık stimülasyonu aksiyon potansiyellerini...

Bir Sıçanda Nöronal Aktivitenin İnhibisyonu ve Elektrofizyoloji Kullanılarak Tespiti

Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, "optogenetics" olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar.

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem<em&gt; In vivo</em

Kortikal ağları inhibitör küçük, ama farklı kümesi tarafından kontrol edilir. Internöronlar Fonksiyonel soruşturma dolayısıyla hedeflenen kayıt ve titiz belirlenmesini gerektirir. Hücre içi etiketleme, post-hoc morfolojik ve imünositokimyasal analizler nöronu tek ya da çiftli sinaptik çiftlerinden bütün hücre kayıtları içeren bir birleşik yaklaşım aşağıda tarif edilmiştir.

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Optogenetic yaklaşımlar yaygın nöral aktiviteyi işlemek ve beyin fonksiyonu için sonuçlarını değerlendirmek için kullanılır. Burada, bir teknik optik aktivatör channelrhodopsin in vivo tanımlanması üzerine, korku ile ilgili devreler özel uzun menzilli ve yerel sinirsel bağlantılar sinaptik özellikleri ex vivo analiz için izin verdiği gösterilmiştir.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Ürünleri ve tüm hücre yama kelepçe kayıt Xenopus laevis Tectal nöronlar için iletişim kuralları

Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.

Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Burada, akut kemirgen beyin dilimlerinde sinapsa özgü elektrofizyolojik karakterizasyona izin vermek için optogenetik yapılara sahip ayrık beyin bölgelerinin viral transdüksiyonunu tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Eski Vivo Medial Prefrontal Korteksten Lateral Entorinal Kortekse Uzun Menzilli Sinaptik İletim ve Plastisitenin Optogenetik Sorgulanması

Burada, sıçanlarda ve farelerde yüksek yoğunluklu mikro-elektrokortikografi (μEcoG) kaydı için cerrahi, implantasyon ve kayıt yöntemleri dahil olmak üzere iki protokol sunuyoruz. μECoG kayıtları, sıçan işitsel korteksinde laminer politrod kaydı veya fare somatosensoriyel korteksindeki nöral aktivitenin optogenetik manipülasyonu ile kombinasyon halinde gerçekleştirilir.

Kemirgenlerde Laminer Politrodlar ve Optogenetiğin Mikro Elektrokortikografi ile Entegre Edilmesi ile Kortikal İşlemenin Çok Ölçekli Araştırılması

Öğrenin, anestezili fare korteksinden ChR2 eksprese eden inhibitör internöronlarda yüksek kaliteli tek birim kayıtlar elde etme yöntemini. Optogenetik tanımlama, elektrofizyolojik kayıtların hassasiyetini artırır ve maliyet-etkin bir alternatif sunar.

A Guide In vivo Tek birim Kayıt

Daha fazla video keşfet