Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, fizyolojik akış koşulları altında lökosit trans endotel göçü sırasında endojen bileşke, terin ve pcam birin dağılımını takip etmektir. Bu, ilk olarak bir proco gradyanı kullanılarak sağlıklı gönüllülerin tam kanından polimorfonükleer lökositlerin veya PMN'lerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, akış deneyine başlamadan 30 dakika önce akış slaytlarında kültürlenmiş bir TNF alfa ile uyarılmış insan göbek veni endotel hücresi tek tabakasına floresan etiketli antikorlar eklemektir.

Bu, fizyolojik akış koşulları altında nötrofil transgöçü sırasında endotel hücrelerinin bağlantı dinamiklerinin görselleştirilmesini sağlayacaktır. Daha sonra, floresan olarak işaretlenmiş TNF alfa ile uyarılmış insan umbilikal ven endotel hücrelerini içeren akış slaytı akış sistemine bağlanır ve mikroskop aşamasına yerleştirilir. Pompa, akış tamponunu rezervuardan akış odasından şırıngaya çekecektir.

Son adım, PMN'leri enjeksiyon portu aracılığıyla akış sistemine yavaşça enjekte etmektir. Sonuç olarak, PMN'ler konfokal bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak görselleştirilir. Birkaç dakika sonra lökositler ortaya çıkar, yapışır ve göç eder.

Deney istenilen herhangi bir anda durdurulabilir. Bu tekniğin statik transmigrasyon tahlilleri gibi diğer mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu teknikle fizyolojik akış koşulları altında gerçek hayatta yapışma ve transmigrasyonu inceleyebilmenizdir. Bu, lökositlerin neden bir kökü diğerine tercih ettiğini, dolayısıyla hücre içi göçe karşı PGA'yı anlamamıza yardımcı olacaktır.

Bunu, floresan olarak işaretlenmiş antikorlarla hücre hücre bağlantılarını görselleştirerek yapıyoruz. Bu deney için insan göbek damarı endotel hücreleri veya HU X, endotel büyümesi ile desteklenmiş ortam kullanılarak üreticinin fibronektin kaplı tabaklar üzerindeki talimatlarına göre kültürlenir. Orta. Hücre kültürü, hücreler% 80 ila 90'a ulaştığında dört ila sekiz geçiş arasında kullanılır. Birleşme, bunları oda sıcaklığında PBS ile pH 7.4'te dikkatlice yıkayın ve ardından tripsin, tripsin ve santrifüjlemeden sonraki hücrelerdir.

Ortam kullanarak mililitrede 800.000 hücrede askıya alıyoruz. Deney, önceki gün plakasında fibronektin ile kaplanmış akış odalarını kullanır. Fibronektin kodlu akış odalarının her bir kanalında 80.000 hücre ve hücre süspansiyonunu gece boyunca 37 santigrat derece ve ertesi gün% 5 karbondioksitte bir inkübatörde yukarı ve aşağı kültüre nazikçe pipetleyin.

Slaytı 45 derecelik bir açıyla hafifçe eğerek akış odası slaytındaki ortamı yenileyin. Medyanın kanalın kendisinde değil, yalnızca rezervuarlarda çıkarılması önerilir. Kanallardaki besiyerinin çıkarılması, pipetlemenin neden olduğu besiyerinin sürükleme kuvveti nedeniyle endotel hücre kaybı ve ölümü ile sonuçlanabilir.

Faz kontrast mikroskobu ile kontrol edin Endotel hücreleri bir monotabaka oluşturmuşsa. Hücreler %100 uyumlu değilse, ortamı %100 birleşmeye ulaşana kadar günde iki kez değiştirin. Hücreler %100 ko-akıcılığa ulaştığında, hücreleri enflamatuar mediatör içeren ortamla uyarın.

TNF alfa ile gece boyunca uix'i uyaran TNF alfa, ICAM one ve VA M1 gibi hücre adezyon moleküllerinin endotel IE yukarı regülasyonunun inflamatuar bir fenotipi ile sonuçlanır. Polimorfonükleer lökositleri veya PMN'leri izole etmeden önce. İzole edilmiş PMN'leri yıkamak ve önceden hazırlanmış bir stok çözeltisinin 100 mililitresine akış tahlilinde kullanmak için bir akış tamponu hazırlayın. 100 mikrolitre taze bir molar kalsiyum klorürde, litre başına 200 gram stok konsantrasyonundan 2,5 mililitre insan albümini ve 0,1 gram glikoz.

0,45 mikronluk bir filtre kullanarak akış tamponunu filtreleyin. PMN'lerin izolasyonundan önce pH 7.4'te PBS'de% 10'luk bir trisodyum sitrat veya TNC çözeltisi de hazırlanır. PMN'ler, sağlıklı bir gönüllüden alınan bir sodyum heparin ette toplanan 20 mililitre tam kandan izole edilecektir.

İlk olarak, tam kanı 15 mililitrelik bir tüpte% 10 PBST NNC ile bire bir seyreltin. Daha sonra, 20 mililitre seyreltilmiş kanı, yeni bir 50 mililitrelik tüpte mililitre başına 1.130 gram yoğunluğa sahip sudaki 12.5 mililitre kolloidal çözeltiye dikkatlice pipetlemek için en yavaş ayarda bir pipet çocuğu kullanın. Coll içeren tüp, kanın eklenmesi sırasında 45 derecelik bir açıyla eğilmelidir.

Tüpleri dikkatlice santrifüje yerleştirin ve santrifüjleme tamamlandığında frenler devre dışı bırakıldığında düşük ivmelenme ile 800 Gs'de 20 dakika oda sıcaklığında döndürün. Tüm sıvıyı çıkarın ve eritrositleri yatıştırmak için her tüpü buz gibi soğuk eritrosit lizis tamponu ile doldurun. Tüpleri buzun üzerinde bırakın, ara sıra süspansiyon koyu kırmızı olana kadar ters çevirin, frenler etkinken dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 GS'de santrifüjleyin.

Elde edilen pelet fraksiyonu PMN'leri içerir Eritrositlerle birlikte, süpernatanı çıkarın ve peleti iki kez buzda yıkayın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 Gs'de soğuk lizis tamponu. Süpernatantın ikinci yıkamadan çıkarılmasından sonra, peleti oda sıcaklığında akış tamponu ile yeniden süspanse edin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak PMN konsantrasyonunu belirleyin.

Son olarak, PMN'leri mililitrede 10 ila altı hücreye bir kez akış tamponunda askıya alın ve endotelyal kavşak VA kaderin ve pcam birini etiketlemek için oda sıcaklığında tutun. Bir ila 100 seyreltmede pcam LOR 6 47 antikorunu ve bir ila 50 seyreltmede kalsiyumdan bağımsız FE kaderin ZI antikorunu VE kültürüne, akış odasındaki ortama ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. PMN'leri tahlil için hazırlamak için, akış sistemine enjekte etmeden önce 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca bir su banyosuna koyun.

Hortumu boş bir akış odasına bağlayın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için ılık akış tamponu ile doldurun. Akış sistemini kurarken. Silikon boru kullanarak, boş akış odasının bir tarafını 20 mililitrelik bir şırınga içeren şırınga pompası akış sistemine bağlayın.

Akış odasını mikroskop tablasına yerleştirin. Tahlil, 63 x yağ objektifi ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmış bir iklim odası ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilecektir. Boş akış odasının diğer tarafını 37 santigrat derece akış tamponu ile doldurulmuş rezervuar şişesine bağlayın ve tüm boruları akış tamponu ile doldurmak için şırınga pompasını çalıştırın, pompa akış tamponunu rezervuardan akış odasından şırıngaya çekecektir.

Bu boru ayrıca, PMN'lerin akışı durdurmadan ve hava kabarcıkları oluşturmadan çalışan bir deneye bir iğne ile enjekte edilmesine izin veren bir hat içi yem enjeksiyon portu içerir. Daha sonra, boş akış odasını TNF alfa muameleli VE içeren hazneye bağlamadan ve yeniden bağlamadan önce tüpleri sıkıştırın ve sistemdeki hava kabarcıklarını önlemek VE.To, boruları sıkıştırmak ve kelepçelemek çok önemlidir. Hücreleri içeren slaydı bağlarken.

Akış odasını mikroskop tablasına yerleştirin, akış hızını, santimetre kare başına bir ila beş dines olan post kapiler es'teki fizyolojik akış hızına göre bir kuruş santimetre kareye ayarlayın, bu da santimetre kare kayıt diferansiyel girişim kontrastı veya DIC fite LOR 6 47'dir. Aynı anda bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, PMN'yi hat içi yem enjeksiyon portu aracılığıyla akış sistemine yavaşça enjekte edin. Birkaç dakika sonra, lökositler ortaya çıkar, yapışır ve göç eder, deneyi istenen herhangi bir anda durdurur.

Hortumun akış odasından ayrılması ve akış odasına fiksatif pipetlenmesiyle, antikorların endotelin bariyer fonksiyonuna müdahale edip etmediğini test etmek için endotelyal tek tabakaların direnci ölçüldü. VE, 55 7 H'lik bir antikor klonunu duyabildiğinde veya hücrelere izotip kontrolü eklendiğinde dirençte herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Buna karşılık, VE morina işitme engelleme antikoru CL 75, direnci önemli ölçüde azalttı.

RAP analizi, VE CADHERIN 55 7 H bir antikorun varlığında veya yokluğunda floresan geri kazanımında herhangi bir değişiklik göstermedi, bu da antikorun nötrofil trans endotelyal migrasyon veya TEM sırasında VE kaderin, VE kaderin ve pcam'ın dinamiklerini değiştirmediğini gösterir. Üst panel, endotel üzerine yapışan ve VE uyumlu ve pcam olanın dağılımına zarar vermeden hücreyi hücre kavşağına geçen beyaz ile özetlenen bir nötrofili gösterir. Diyapedez sırasında, bir nötrofil hücreden beyazla belirtilen hücre bağlantılarına çıkıntı yaptığında, endotelin üstünde bir nötrofil olan VE uyumlu ve P chem'in lokal bir dispersiyonu gözlemlenebilir.

Sarı anahat, zaten endotelin altında bulunan nötrofil zarını göstermektedir. Diapedezi tamamlandıktan sonra, kavşaklar kapanır ve uyumlu ve pcam bir diyapedez bölgelerine yerleştirilir. Trans göç etmiş nötrofilin sınırları sarı renkle belirtilmiştir.

Bu işlemi takiben, lökositlerin bagga veya transselüler kök kullanılarak endotelyumu geçip geçmediği gibi ek sorulara cevap vermek için lökosit trans endotel göçü yapılabilir.