Name: Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Öğrenin, fizyolojik akış koşullarında nötrofil hücre hücre eklem geçişini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, paraselüler ve transelüler göç yollarını ayırt ederek inflamatuar hastalıklara yönelik tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, makaleyi eleştirel bir şekilde okuduğu için Dr. P.L. Hordijk'e teşekkür eder. AED, Landsteiner Kan Transfüzyon Araştırmaları Vakfı (LSBR) bursu (hibe #1028) tarafından desteklenmektedir. JK, Hollanda Kalp Vakfı (2005T3901) tarafından desteklenmektedir. JDvB, bir NHS Dekker üyesidir (hibe #2005T039).

Nötrofiller bir bilgilendirilmiş onam imzaladı sağlıklı gönüllülerden izole edilmiştir. Araştırma, insan refahı için kurumsal ve ulusal rehberlere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Kaplama ve İnsan Göbek Daman Endotel Hücrelerinde bakımı <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre Kültürü İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde (HUVECler). Fıbronektin üzerinde büyümeye HUVECler (FN) ortam kullanılarak (demineralize su içinde çözülmüş 10 mg / ml) yemekler -kaplı (Endotel Büyüme Ortamı (EGM-2) ile takviye edilmiş endotel singlequots Bazal Ortam (EBM-2) ortamı). Deneyler için 4-8 geçişleri arasında hücre kültür kullanın. </li><li> Gün 1: 37 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca 100 ul fibronektin (PBS içinde 10 ug / ml) ve% 5 CO2 ile kaplayın akış odaları. </li><li> 2. Gün: hücreleri% 80-90 ulaştığında, OS fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkandıktan sonra dikkatli Hücreleri tripsinize edin (pBS), pH 7.4, medyayı kullanarak 800.000 hücre / ml 800 xg santrifüj ve tekrar süspansiyon. Plaka 80000 FN-kaplanmış akış odalarından her kanal için hücreler yavaşça yukarı ve aşağı hücre süspansiyonu pipetle. Bir 37 ° C&#39;de inkübatör ve% 5 CO2 içinde kültür göre O / N. </li><li> 3. Gün: yavaşça 45 ° açıyla slayt eğerek akış slaytı medyayı yenileyin. (Şekil 1A bakınız). NOT: Sadece rezervuarlarda değil kanalında kendisi ortamı kaldırmak için tavsiye edilir. Kanallardaki ortam çıkarılması nedeniyle pipetleme neden ortamın sürükleme kuvveti endotel hücre kaybına ve ölüme yol açabilir. </li><li> Endotel hücreler, bir tek tabaka (yani,% 100 ortak akışlı) meydana varsa faz kontrast mikroskobu ile kontrol edin. Hücreler% 100 birleşik değilse onlar% 100 izdiham ulaşana kadar, bir gün Ortamı iki kez değiştirin. </li><li> Hücrelerin birleşik hale gelmesinden sonra, (yukandaki adım ortam ile hücrelerini uyarır1.1), iltihabi aracı madde (TNF-α (10 ng / ml) ihtiva etmektedir). , Endotel iltihabik bir fenotipe, TNF-α sonuçlarla HUVECler O / N (örneğin, 12 saat), yani teşvik., Üst-düzenlemenin, örneğin ICAM-1 ve VCAM-1 13 gibi hücre yapışma moleküllerinin. </li></ol> Perkol Degradeleri kullanma 2. Polimorfonükleer Lökosit izolasyonu <ol><li> Polimorfonükleer lökositler (PMN) izole önce N-2-hidroksietilpiperazin-N&#39;-2-etansülfonik asit (akış tamponu bundan sonra da adlandırılır) (HEPES) Tampon hazırlayın. Akış tamponu izole PMN yıkamak için kullanılır ve bu akış deneyinde tampon olarak. Akış tamponu hazırlamak için: 7.72 g NaCl (132 mM), 4.76 g HEPES (20 mM), 0.45 g KCl (6 mM), 0.25 gr MgSO 4 • 7H H2O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H seyreltik 2 O minerali giderilmiş su, 1 L (1.2 mM) ve (bu stok birkaç hafta boyunca 4 ° C de muhafaza edilebilir), pH 7.4 ayarlanır. </li><li> Taze 100 ul 1 M CaCl2 &amp; # ekle160 (1 mM), 2.5 mi, 200 g / L&#39;stok konsantrasyonu, 100 ml (0.5% h / h), ve 0.1 g glikoz, insan albümini (% 0.1 a / ​​h) akış tamponu. Daha sonra, bir 0.45 um filtre kullanılarak, akış tamponu filtre. NOT: Bu akış-tampon her bir deney için taze olarak hazırlanması gerekir. </li><li> Önceki PMN izolasyonu, PBS, pH 7.4 içinde% 10 trisodyum sitrat (TNC) solüsyon hazırlanır. </li><li> Sağlıklı bir gönüllüden sodyum heparin vacuettes tüm kanın 20 ml toplayın. 50 ml tüpler içinde% 10, PBS / TNC 1 ve pipet 20 mi ((gr / ml 1,130 bir yoğunluğu olan su içinde bir koloidal çözelti) bir a / a% 23) 12.5 ml Percoll üzerine dikkatli bir şekilde kan seyreltildi: Tam kan 1 seyreltin Yeni bir 50 ml tüp içinde. Dikkatlice santrifüj tüpleri ve 800, düşük bir ivme ile xg ve oda sıcaklığında belirlenen kırılma yok, 20 dakika boyunca dönerler. Not: Percoll seyreltilmiş kan eklerken, bir 45 ° açıda Percoll içeren tüp eğme ve yavaşça tüp wit seyreltilmiş kan pipetleh yavaş pipet çocuk ayarı. </li><li> Tüm sıvı çıkarın ve daha sonra, 500 ml buz soğukluğunda eritrosit lizis tamponu (4.15 g NH4CI [0.155 M], 0.5 gr 3 KHCO [0.01 M] ve 18.5 mg EDTA (üç katlı III) [0.1 mm] tüpün doldurulması ) buz soğukluğunda H2O eritrositleri lizise uğratmak üzere. Süspansiyon etkin sonları ile, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x santrifüj, ardından koyu kırmızı, olana kadar, bazen Tersine tüp, tüp buz üzerinde bırakın. Not: topak parçası eritrositleri ile birlikte PMN (nötrofiller, eozinofiller, bazofiller) içerir. </li><li> Süpernatantı ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de, buz sıcaklığında lizis tamponu içinde iki kez yıkayın pelet. </li><li> RT&#39;de akış tamponu ile pelet ve hemositometer ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak PMN konsantrasyonunu belirlemek. 1 x 10 6 hücre / ml akış tamponu içinde askıya alma PMN ve oda sıcaklığında tutun. </li></ol> Endotel Junction 3. EtiketlemeEl VE-kaderin ve PECAM-1 <ol><li> 1 de PECAM Alexa Fluor 647 antikoru (klon WM59) ekleyin: 1:50 seyreltme HUVEC kültür ortamı 100 seyreltme ile kalsiyuma bağlı VE-kaderin-FITC antikoru (klon 55-7H1), (adım 1.1) ve önceki fizyolojik akış koşulları altında nötrofil trans sırasında endotel hücre birleşim dinamiklerini görselleştirmek için akış deney başlamadan 30 dakika inkübe edilir. NOT: akış odalarına doğrudan etiketli antikorlar eklemeden önce, her bir kanal hacim 100 ul aşmamasını sağlamak. Bu, mümkün olduğunca düşük antikor giderleri tutmanıza yardımcı olur. </li></ol> 4. PMN Deney TEM altında Akış <ol><li> Önce akış sistem içine enjekte edilmesinden 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca bir su banyosu içine PMN yerleştirin. </li><li> Th kurarken boş bir akış odasına boru bağlayın ve oluşumunu engellemek için (örneğin, 37 ° C) akış tampon sıcak (bkz adım 4.3) ile doldurun hava-kabarcıklarE akış sistemi. </li><li> 20 ml&#39;lik bir şırınga ihtiva eden silikon tüp kullanılarak şırınga pompası akış sistemine boş bir akış odasının bir tarafında bağlayın ve mikroskop kademesine akış odasına koyun. </li><li> 37 ° C akış tamponu (Şekil 1B) ile dolu hazne şişeye boş bir akış odasının diğer tarafını ve akış tamponu ile her borunun doldurmak için şırınga pompası başlar. Pompa şırıngaya akış bölmesi boyunca rezervuardan akış-tampon çeker. Not: Bu boru da akışının kesilmesi ve hava kabarcıkları oluşturmadan PMN çalışan bir deneye bir iğne ile enjekte edilmesi için izin veren bir hat-içi enjeksiyon ağzının luer içerir. </li><li> TNF-α-muamele edilmiş HUVECler içeren akış bölmesi ile boş akış bölmesi yerine, akış tamponu ihtiva eden boru bağlantı ve bir mikroskop kademesine (Şekil 1C) içine yerleştirin. Çıkarmadan ve tekrar bağlamadan önce tüplerini çimdikkapalı kısma değil, HUVECler içeren odalarına m boru ve / veya akış odası içinde hava kabarcıklarının oluşmasına neden olabilir. </li><li> Sonraki kılcal venüllerin fizyolojik akış hızına uygun olarak, 1 dyn / cm 2 akış hızını ayarlamak (1-5 din / cm 2). </li><li> Tutanak Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC), FITC (488 nm) ve Alexa Fluor 647 (647 nm) aynı anda odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak. </li><li> PMN 1 mi şırıngalar kullanılarak hat-içi luer enjeksiyon ağzından (Şekil 1D) ile yavaş yavaş akış sistemi (adım 4.1) enjekte edilir. </li><li> Bir kaç dakika sonra, lökositler yapışan ve göçmek, görünür. Akış odasına akış odasının ve pipetleme fiksatif (PBS içerisinde% 3.7 formaldehit) boruların sökülmesini tarafından arzu edilen herhangi bir an deney durdurun. 10 dakika boyunca tespit Veren, PBS ile yıkanması işlemi uygulanır. Veri görüntüleme yazılımı (malzeme ve ekipman tabloya bakınız) kullanılarak analiz edilmektedir. NOT: 37 ° C,% 5 CO2 olan bir sabit sıcaklığa sahip bir klima kabini ile teçhiz edilmiş bir odaklı lazer tarama mikroskopu ve 63X ile de deneme amaçlı yağ gerçekleştirin. </li></ol>

<ol><li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis--an+inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li>
<li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+migration+in+inflammation%3A+present+and+future+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li>
<li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases%3A+%27+vascular+rheumatology%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224(2008).</li>
<li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-endothelial+cell+recognition%3A+three+%28or+more%29+steps+to+specificity+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration%3A+the+multistep+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li>
<li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-cellular+migration%3A+cell-cell+contacts+get+intimate%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li>
<li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li>
<li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li>
<li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li>
<li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vasc.+Res%22%5BJournal%5D)">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li>
<li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li>
<li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li>
<li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro%3A+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li>
<li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li>
</ol>

Yazarların birbiriyle rekabet eden hiçbir mali çıkarı yoktur.

Bu, hücre apoptozu ve bir tek tabaka kesintiye neden olacağından, bu protokol için, bu akış odalarına hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için çok önemlidir. Bunu önlemek için, tüpler akış odasının bağlı adımlar 4.2 ve 4.5, özellikle faiz ödemek için vurgulamak istiyorum. Protokolde Diğer önemli adım önce akış odasının (aşama 4,1) injekte için 37 ° C&#39;de 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek bunları tutulur PMNs astarlı. Bu da onları, endotel de ICAM-1 ya da VCAM-1 gibi yapışma molekülü uygun sağlayan lökosit bütünleyicilerinin astarlanması ile sonuçlanır. Bu protokol, nötrofil göçü incelemek için sınırlı değildir. , Monositler veya lenfositler gibi diğer lökosit tipleri kullanılabilir. Lökosit tipleri arasında farklılık olabilir lökositler emişli, yani bu adımı 4.1, unutmayın. Aynı zamanda, endotelyal hücrelerin diğer tür de kullanılabilir. Bunun için kritik kalırTNF-α ya da IL-1β gibi uygun, enflamatuar uyarılara ile endotelyal hücrelerini uyarmak için. Nötrofiller transmigrating yanıt yoksa, bir N-formil-L-metionil-L-leusil-L-fenilalanin (fMLP) ile peptit 16 ile nötrofiller kısa bir süre (5 dakika) muamele edilmesi düşünülebilir. Bu endotele uymak için onları daha eğilimli hale daha da, özellikle kendi integrinler de, nötrofiller teşvik edecek. Tipik olarak 1 din / cm 2 akış hızı kullanılır. Bu akış hızı post-kapiller venüllerin, en lökosit transendoteliyal göç 17 oluşur sitelerinde ölçülür. Tarif edilen akış odaları kullanılarak, 10 din / cm 2 akış hızı kadar artırmak mümkündür. Bununla birlikte, daha da geliştirmek için kesme tavsiye edilmez. Bu akış odasından hücrelerin tüp ve dekolmanı istenmeyen sızıntısına neden olabilir. Şekil 3 içinde tarif edilen sonuçlar, bu göstermektedirantikorlar görselleştirmek ve lökosit diyapedezin sırasında endotel hücre-hücre birleşme bölgesinin dinamikleri üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Özellikle, mevcut göçü deneylerinde ek olarak, bu iletişim kuralı, gerçek zamanlı olarak fizyolojik akış şartları altında hücre üzerinden taşıma arası paraselüler ayırt sağlar. Antikorlar, hücre-hücre kavşaklar leke dolayı, bir / PECAM-1-kaderin the VE pozitif olmayan karşı VE-cadherin / PECAM-1 ile pozitif bağlantı yerlerine çapraz lökosit sayısı tam olabilir. Bu şekilde, transselüler göç paraselüler göç ayırt edilebilir. Bu çalışmada kullanılan PECAM-1 antikoru, ikinci hücre-dışı domenine karşı yöneliktir: Bu antikorlar bağlanan proteinlerin işlevine müdahale etmeyen olduğunu vurgulamak önemlidir. Antikor en az vermediği anlamına yayma veya bir tek tabaka oluşturan herhangi bir bozukluğun göstermedi antikorun mevcudiyetinde kaplandı Endotel hücreleri,endotel hücreleri arasındaki homotipik etkileşimleri ile müdahale. buna ek olarak, her iki antikorun endotel tek tabaka boyunca göç etme yeteneği nötrofillerin bozmamaktadır. Buna ek olarak, ya da yokluğunda, antikorların varlığında endotel tek tabaka üzerinde göç etmek nötrofil sayısının (veriler gösterilmemiştir) değişmez. Önemlisi, odaklı lazer tarama mikroskopisi bize aynı anda farklı floresan kanalları ve DIC kayıt imkanı verir. Bir nötrofil endotel hücre-hücre birleşme yerini geçer ve lökosit hücre üzerinden karşı, diğer, yani paraselüler üzerinden bir yol tercih anlamak yardımcı olacaktır Dolayısıyla, bu deney aynı zamanda VE-cadherin ve PECAM-1 dinamiğini çalışmak sağlar.

Verimli ve sıkı bir şekilde kontrol lökosit transendotelyal göç (TEM) gibi bağışıklık gözetim ve akut inflamasyon gibi fizyolojik süreçlerde önemli bir yer tutmaktadır. Bununla birlikte, bazı pato-fizyolojik koşullar altında, kontrol edilemeyen ve aşırı TEM kronik iltihaplı hastalıklar (örneğin, romatoid artrit, ateroskleroz, astım) elde görülmektedir. Tümör hücreleri 1-3 metastaz için kan dolaşımını bırakmak için aynı zamanda, tümör hücre metastazı sırasında transendoteliyal taşınması işleminde etkili olduğunu. Özellikle aşırı lökosit ya da tümör hücresi TEM müdahale etmek için, bu işlemin düzenlenmesinde ayrıntılı bir anlaşılması gerekmektedir. TEM sürecinin farklı adımlarda meydana geldiğine inanılır. Butcher ve Springer tarafından iki yıl önce yorumlanan Seminal çalışmaları, TEM 4,5 sürecini anlatan çok basamaklı modeline yol açtı. Bu model, her ne kadar hala bazı reklamdan, geçerlidirditional adımlar 6 dahil edilmiştir. Alon ve diğ. Endotel 7 yüzeyi üzerinde hareketsiz kemokinlerin yer alması ihtiyacı tanımlamışlardır. Son zamanlarda, onlar endotel kendisi endotel apikal yüzeyinde 8&#39;de sunulmaktadır kemokinlerle üretir olduğunu gösterdi. Ayrıca, aynı grup TEM sırasında 7 akış koşullarının önemini ortaya koymak. Son zamanlarda, iki farklı güzergahlar lökositler odaklanan çeşitli yayınlar TEM son diyapedez aşamada alabilir. Onlar, yani, hücre-hücre kavşaklarda aracılığıyla paraselüler göç rota gitmek, ya da transselüler göç rotası 9 olarak bilinen endotel hücre gövdesi aracılığıyla geçebilir ya. Carman ve meslektaşları detaylı olarak bu yolları okudu ve göbek ven endotel tektabaka 10 geçerken lökositler tercihen transselüler rota (% 10) üzerinde paraselüler göç güzergahı (% 90) tercih sonucuna varmıştır.Bununla birlikte, diğer kaynaklardan gelen endotel hücreleri kullanıldığı zaman, örneğin, beyin ya da kılcal daha lökositler transsellüler yol (% 30) 11 kullanılır. Bir VE-kaderin-alfa-katenin için şimeri Vestweber grup son hücre-hücre kavşaklar endojen yerine, bir darbe-hayvan modeli kullanarak birbirinden ayırmak koyamadık o zaman VE-kaderin gösterdi, lökosit TEM tam 12 engellendi . Şaşırtıcı, yazarlar TEM birkaç engellendi ama hepsi değil, dokular olduğunu fark ettim. Genel olarak, bu zarif deneyler bu kararı tetikleyen düzenleyici sinyaller hala bilinmiyor olsa da lökositler, transselüler güzergahın üzerinde paraselüler rotayı tercih ettiğini belirtti. Lökositlerin çoğunluğu paraselüler göç yolu tercih olsa da, her iki yollar arasında ayrım hala zordur. Endotel hücre-hücre ayr rolü üzerine odaklanan bazı çalışmalarda rağmen bu ek olarak,iyonlar, bu kavşak dinamikleri, özellikle kavşak proteinler VE-kaderin ve PECAM-1, lökosit geçiş tartışma halen sırasında. Biz, bu birleşim moleküller flüoresan etiketli antikorlar kullanılarak akış koşulları altında, fizyolojik lökosit diyapedezin boyunca gerçek zamanlı olarak izlenmesini mümkün kılan nispeten basit bir deney geliştirildi. Bu antikorlar müdahale veya hedeflenen proteinlerin kavşak bütünlüğü veya hareketlilik bloke etmedi. Bu deney, bize paraselüler TEM sürecinde kavşak proteinlerin dinamiklerini takip etmesini sağlar. Ayrıca, bu testte de para- ve transselüler göç yolları arasında ayrımcılık verir.

<table><tbody><tr><td>&mu;-Slayt VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>Akış odası</td></tr><tr><td>0.45 &mu; M filtresi&nbsp;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Şırınga&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Şırınga&nbsp;</td><td>BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21 G İğne&nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Albümin&nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum klorür (NH<alt>4</alt>Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür (CaCl<alt>2</alt>)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Bazal ortam + EGM-2 SingleQuot Kit Takviyesi & Büyüme Faktörleri</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>medya</td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tüpleri&nbsp;</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Sıralı Luer enjeksiyon portu&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO4&bull; 7H < alt > 2 < / alt > O)</td> <td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>klon WM59</td></tr><tr><td>Percoll&nbsp;</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Salamin</td><td>Fresenius Kabi&nbsp; Nederland</td><td>M090001/01NL</td><td></td></tr><tr><td>PBS Potasyum klorür (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidrojen karbonat (KHCO<alt>3</alt>)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik trihidrat (K<alt>2</alt>HPO<alt>4</alt>)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Silikon Tygon 3350 boru</td><td>VWR</td><td>228-4331</td><td>boru</td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl)</td> <td>Calbiochem (Millipore),</td> <td>567441</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası&nbsp;</td><td>Harvard Aparatı</td><td>model numarası 55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa; &nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>tümör nekroz faktörü</td></tr><tr><td>Trisodyum sitrat&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Almanya</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>560411</td><td>klonu 55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Almanya</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nötrofil hicret altında fizyolojik akış sırasında endotel hücre-hücre eklemlerinin gerçek zamanlı görüntüleme

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Inflamasyon sırasında, lökositler dolaşımını bırakın ve alttaki dokularda işgalci patojenlere mücadele endotelyumu çapraz. Bu süreç lökosit transendotelyal göç olarak bilinir. Endotel tek tabaka geçmeye lökositler için iki yol tarif edilmiştir: yani hücre-hücre kavşaklarda ve transselüler rota aracılığıyla paraselüler rota, yani, endotel hücre vücuda. Bununla birlikte, para- ve transsellüler yol arasında ayrım yapmak teknik olarak zor olmuştur. Biz endojen dağılımı VE-kaderin ve PECAM-1 fizyolojik akış koşulları altında nötrofil transendotelyal göç sırasında incelemek için basit in vitro testi geliştirdi. Nötrofil perfüzyon önce, endotel hücreleri kısa bir süre için VE-cadherin ve PECAM-1 karşı floresan ile etiketlenmiş antikorlar ile tedavi edilmiştir. Elektrik hücre substra ile saptandığı gibi, bu antikorlar hem proteinlerin işlevine müdahale etmedite empedans algılama ve sıkı bağlamak ölçümleri. Bu analizi kullanarak, endojen dağılımı akış koşulları altında transendotelyal göç sırasında ve PECAM-1-kaderin VE ve endotelyumda lökositlerin para- ve transselüler göç yolları ayırt takip başardık.

Antikorlar endotel bariyer fonksiyonu ile müdahale etmedi eğer ilk test. Biz elektrik hücre alt-tabaka empedans algılama (ECIS) ile endotel tek katmanlarının direnci ölçüldü. Ayrıntılar için, Van Buul ve diğ. 13 anti-VE-cadherin floresan etiketli antikor hücreleri (Şekil 2A) ilave edildi, dirençli herhangi bir değişiklik gözlenmedi bkz. Engellemek için çok iyi bilinen bir anti-VE-cadherin antikor fonksiyonu önemli ölçüde (Şekil 2A) direncini azaltır VE-cadherin. Aynı zamanda, dinamiklerini değiştirmeyen, görüntüleme için kullanılan antikorlar, VE-cadherin, foto-ağartıcı (sıkı bağlamak) sonra flüoresan iyileşme ölçülerek değerlendirildi (Şekil 2B)-kaderin-GFP VE. 1-2 dakika sonra, nötrofiller DIC kanalı (Şekil 3A) olarak sunulacak bir görüntü olarak aktive edilmiş endotel tabakasına yapıştırılır. 5-30 se için tarama sonrac nötrofillerin büyük çoğunluğu PECAM-1 a'ya karşı yönlendirilen antikorlar ile etiketlenmiş ve VE-cadherin olan hücre-hücre birleşme yoluyla endotel tek tabaka ile transmigrant. Diyapedezin sürecinde, dağıtım VE-cadherin ve PECAM-1 ile gerçek zamanlı (Şekil 3B) olarak izlenmiştir. Nötrofil diyapedezin sahalarında, VE-kaderin yerel bozulur ve PECAM-1, daha halka benzeri bir yapı gösterdi. Diyapedezin tamamlanmasından sonra, kapat ve bir kam VE-cadherin ve PECAM-1 açıkça diyapedezin sahalara (Şekil 3C) yeri değiştirilir. Nötrofil endotelinin baso-yan kenar ulaştıktan sonra, anti-PECAM-1 antikor parçaları nötrofil yüzeyinde tespit edilmiştir unutmayın. Bununla birlikte, bu, endoteli geçmesini nötrofiller engellemedi. Nötrofil transendotelyal göç sırasında gerçek zamanlı olarak gözlenen dinamikleri VE-kaderin Shaw ve arkadaşları tarafından çalışmaları ile anlaşmaya vardı kimkonfokal mikroskopi kullanılarak, gösterdi ve VE-kaderin-GFP-transfekte VE-kaderin-GFP lökositler endotel hücre-hücre kavşakları 14 geçtiklerinde yanal dağınık endotel hücreleri,. Su ve arkadaşları PECAM-1 bizim gözlemlerini vurguladı tarafından da çalışırlar. Onlar lökosit geçişi üzerine yanal yanında, bu VE-kaderin difüzyon gösterdi, PECAM-1 lokal transmigrating nötrofil 15 etrafında bir halka içine dağıtıldı. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400"> In vitro akış odasında Şekil 1. (A). Ok orta yenilenmesi gerekiyor hangi depoyu gösterir. Boru sistemi (ok başı) bağlantısını kesmeden PMN enjekte etmek için kullanılan aynı doğrultuda luer enjeksiyon ağzı ile akış odacığına bağlayan (B) Silikon boru. (C), Conn37 ° C akış tamponu (ok başı) ile dolu hazne şişeye boş bir akış odasının ection. (D) akış tamponu ihtiva eden boru TNF-α-muamele edilmiş HUVECler ile akış odasının bağlanması ve bir mikroskop kademesine (ok başı) içine yerleştirilmiştir. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500"> Şekil 2. VE-cadherin birleşim dinamikleri ya da işlev ile karışmaz antikor (A). Endotelyal hücre tek empedans ECIS kullanılarak ölçülür. Y-ekseni Ohm empedansı ifade ve x-ekseni saat zamanı gösterir. Antikor, CL75 (siyah çizgi) bloke VE-cadherin ise VE-cadherin antikor Alexa647 (mavi çizgi) ile etiketlenmiş klon 55-7H1 veya empedansını azaltmak, endotelyal hücre tek empedansını değiştirebilir olmayan IgG Alexa647 kontrol (kırmızı çizgi) ki izotipini . (B <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500"> Şekil 3. VE-cadherin ve PECAM-1 dağılımı gerçek zamanlı olarak nötrofil TEM sırasında (A). Nötrofil endotelyum üzerinde yapışma ve dağılımını etkilemeden hücre-hücre birleşme yerini geçen (beyaz çizgi ile işaretlenmiştir) VE-cadherin ve PECAM -1. (B), nötrofil hücre-hücre birleşme yoluyla endotel tek tabaka kapısı. Yerel bir dispersiyon VE-cadherin nötrofil hücre-hücre birleşme sayesinde çıkıntı yaptığında ve PECAM-1 ile gözlenebilir. Beyaz çizgi endotel üstüne hala nötrofil varlığını göstermektedir. Sarı çizgi nötrofil membran tha gösterirt endoteline altında zaten. (C) Nötrofil tamamen endotel tek tabaka geçti. VE-kaderin ve PECAM-1 diyapedezin bölgelerinde taşındı. Sarı çizgi transmigrant nötrofil sınırlarını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Bu prosedürün genel amacı, fizyolojik akış koşulları altında lökosit trans endotel göçü sırasında endojen bileşke, terin ve pcam birin dağılımını takip etmektir. Bu, ilk olarak bir proco gradyanı kullanılarak sağlıklı gönüllülerin tam kanından polimorfonükleer lökositlerin veya PMN'lerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, akış deneyine başlamadan 30 dakika önce akış slaytlarında kültürlenmiş bir TNF alfa ile uyarılmış insan göbek veni endotel hücresi tek tabakasına floresan etiketli antikorlar eklemektir.Bu, fizyolojik akış koşulları altında nötrofil transgöçü sırasında endotel hücrelerinin bağlantı dinamiklerinin görselleştirilmesini sağlayacaktır. Daha sonra, floresan olarak işaretlenmiş TNF alfa ile uyarılmış insan umbilikal ven endotel hücrelerini içeren akış slaytı akış sistemine bağlanır ve mikroskop aşamasına yerleştirilir. Pompa, akış tamponunu rezervuardan akış odasından şırıngaya çekecektir.Son adım, PMN'leri enjeksiyon portu aracılığıyla akış sistemine yavaşça enjekte etmektir. Sonuç olarak, PMN'ler konfokal bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak görselleştirilir. Birkaç dakika sonra lökositler ortaya çıkar, yapışır ve göç eder.Deney istenilen herhangi bir anda durdurulabilir. Bu tekniğin statik transmigrasyon tahlilleri gibi diğer mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu teknikle fizyolojik akış koşulları altında gerçek hayatta yapışma ve transmigrasyonu inceleyebilmenizdir. Bu, lökositlerin neden bir kökü diğerine tercih ettiğini, dolayısıyla hücre içi göçe karşı PGA'yı anlamamıza yardımcı olacaktır.Bunu, floresan olarak işaretlenmiş antikorlarla hücre hücre bağlantılarını görselleştirerek yapıyoruz. Bu deney için insan göbek damarı endotel hücreleri veya HU X, endotel büyümesi ile desteklenmiş ortam kullanılarak üreticinin fibronektin kaplı tabaklar üzerindeki talimatlarına göre kültürlenir. Orta. Hücre kültürü, hücreler% 80 ila 90'a ulaştığında dört ila sekiz geçiş arasında kullanılır. Birleşme, bunları oda sıcaklığında PBS ile pH 7.4'te dikkatlice yıkayın ve ardından tripsin, tripsin ve santrifüjlemeden sonraki hücrelerdir.Ortam kullanarak mililitrede 800.000 hücrede askıya alıyoruz. Deney, önceki gün plakasında fibronektin ile kaplanmış akış odalarını kullanır. Fibronektin kodlu akış odalarının her bir kanalında 80.000 hücre ve hücre süspansiyonunu gece boyunca 37 santigrat derece ve ertesi gün% 5 karbondioksitte bir inkübatörde yukarı ve aşağı kültüre nazikçe pipetleyin.Slaytı 45 derecelik bir açıyla hafifçe eğerek akış odası slaytındaki ortamı yenileyin. Medyanın kanalın kendisinde değil, yalnızca rezervuarlarda çıkarılması önerilir. Kanallardaki besiyerinin çıkarılması, pipetlemenin neden olduğu besiyerinin sürükleme kuvveti nedeniyle endotel hücre kaybı ve ölümü ile sonuçlanabilir.Faz kontrast mikroskobu ile kontrol edin Endotel hücreleri bir monotabaka oluşturmuşsa. Hücreler %100 uyumlu değilse, ortamı %100 birleşmeye ulaşana kadar günde iki kez değiştirin. Hücreler %100 ko-akıcılığa ulaştığında, hücreleri enflamatuar mediatör içeren ortamla uyarın.TNF alfa ile gece boyunca uix'i uyaran TNF alfa, ICAM one ve VA M1 gibi hücre adezyon moleküllerinin endotel IE yukarı regülasyonunun inflamatuar bir fenotipi ile sonuçlanır. Polimorfonükleer lökositleri veya PMN'leri izole etmeden önce. İzole edilmiş PMN'leri yıkamak ve önceden hazırlanmış bir stok çözeltisinin 100 mililitresine akış tahlilinde kullanmak için bir akış tamponu hazırlayın. 100 mikrolitre taze bir molar kalsiyum klorürde, litre başına 200 gram stok konsantrasyonundan 2,5 mililitre insan albümini ve 0,1 gram glikoz.0,45 mikronluk bir filtre kullanarak akış tamponunu filtreleyin. PMN'lerin izolasyonundan önce pH 7.4'te PBS'de% 10'luk bir trisodyum sitrat veya TNC çözeltisi de hazırlanır. PMN'ler, sağlıklı bir gönüllüden alınan bir sodyum heparin ette toplanan 20 mililitre tam kandan izole edilecektir.İlk olarak, tam kanı 15 mililitrelik bir tüpte% 10 PBST NNC ile bire bir seyreltin. Daha sonra, 20 mililitre seyreltilmiş kanı, yeni bir 50 mililitrelik tüpte mililitre başına 1.130 gram yoğunluğa sahip sudaki 12.5 mililitre kolloidal çözeltiye dikkatlice pipetlemek için en yavaş ayarda bir pipet çocuğu kullanın. Coll içeren tüp, kanın eklenmesi sırasında 45 derecelik bir açıyla eğilmelidir.Tüpleri dikkatlice santrifüje yerleştirin ve santrifüjleme tamamlandığında frenler devre dışı bırakıldığında düşük ivmelenme ile 800 Gs'de 20 dakika oda sıcaklığında döndürün. Tüm sıvıyı çıkarın ve eritrositleri yatıştırmak için her tüpü buz gibi soğuk eritrosit lizis tamponu ile doldurun. Tüpleri buzun üzerinde bırakın, ara sıra süspansiyon koyu kırmızı olana kadar ters çevirin, frenler etkinken dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 GS'de santrifüjleyin.Elde edilen pelet fraksiyonu PMN'leri içerir Eritrositlerle birlikte, süpernatanı çıkarın ve peleti iki kez buzda yıkayın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 Gs'de soğuk lizis tamponu. Süpernatantın ikinci yıkamadan çıkarılmasından sonra, peleti oda sıcaklığında akış tamponu ile yeniden süspanse edin ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak PMN konsantrasyonunu belirleyin.Son olarak, PMN'leri mililitrede 10 ila altı hücreye bir kez akış tamponunda askıya alın ve endotelyal kavşak VA kaderin ve pcam birini etiketlemek için oda sıcaklığında tutun. Bir ila 100 seyreltmede pcam LOR 6 47 antikorunu ve bir ila 50 seyreltmede kalsiyumdan bağımsız FE kaderin ZI antikorunu VE kültürüne, akış odasındaki ortama ekleyin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. PMN'leri tahlil için hazırlamak için, akış sistemine enjekte etmeden önce 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca bir su banyosuna koyun.Hortumu boş bir akış odasına bağlayın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için ılık akış tamponu ile doldurun. Akış sistemini kurarken. Silikon boru kullanarak, boş akış odasının bir tarafını 20 mililitrelik bir şırınga içeren şırınga pompası akış sistemine bağlayın.Akış odasını mikroskop tablasına yerleştirin. Tahlil, 63 x yağ objektifi ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksite ayarlanmış bir iklim odası ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilecektir. Boş akış odasının diğer tarafını 37 santigrat derece akış tamponu ile doldurulmuş rezervuar şişesine bağlayın ve tüm boruları akış tamponu ile doldurmak için şırınga pompasını çalıştırın, pompa akış tamponunu rezervuardan akış odasından şırıngaya çekecektir.Bu boru ayrıca, PMN'lerin akışı durdurmadan ve hava kabarcıkları oluşturmadan çalışan bir deneye bir iğne ile enjekte edilmesine izin veren bir hat içi yem enjeksiyon portu içerir. Daha sonra, boş akış odasını TNF alfa muameleli VE içeren hazneye bağlamadan ve yeniden bağlamadan önce tüpleri sıkıştırın ve sistemdeki hava kabarcıklarını önlemek VE.To, boruları sıkıştırmak ve kelepçelemek çok önemlidir. Hücreleri içeren slaydı bağlarken.Akış odasını mikroskop tablasına yerleştirin, akış hızını, santimetre kare başına bir ila beş dines olan post kapiler es'teki fizyolojik akış hızına göre bir kuruş santimetre kareye ayarlayın, bu da santimetre kare kayıt diferansiyel girişim kontrastı veya DIC fite LOR 6 47'dir. Aynı anda bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, PMN'yi hat içi yem enjeksiyon portu aracılığıyla akış sistemine yavaşça enjekte edin. Birkaç dakika sonra, lökositler ortaya çıkar, yapışır ve göç eder, deneyi istenen herhangi bir anda durdurur.Hortumun akış odasından ayrılması ve akış odasına fiksatif pipetlenmesiyle, antikorların endotelin bariyer fonksiyonuna müdahale edip etmediğini test etmek için endotelyal tek tabakaların direnci ölçüldü. VE, 55 7 H'lik bir antikor klonunu duyabildiğinde veya hücrelere izotip kontrolü eklendiğinde dirençte herhangi bir değişiklik gözlenmedi. Buna karşılık, VE morina işitme engelleme antikoru CL 75, direnci önemli ölçüde azalttı.RAP analizi, VE CADHERIN 55 7 H bir antikorun varlığında veya yokluğunda floresan geri kazanımında herhangi bir değişiklik göstermedi, bu da antikorun nötrofil trans endotelyal migrasyon veya TEM sırasında VE kaderin, VE kaderin ve pcam'ın dinamiklerini değiştirmediğini gösterir. Üst panel, endotel üzerine yapışan ve VE uyumlu ve pcam olanın dağılımına zarar vermeden hücreyi hücre kavşağına geçen beyaz ile özetlenen bir nötrofili gösterir. Diyapedez sırasında, bir nötrofil hücreden beyazla belirtilen hücre bağlantılarına çıkıntı yaptığında, endotelin üstünde bir nötrofil olan VE uyumlu ve P chem'in lokal bir dispersiyonu gözlemlenebilir.Sarı anahat, zaten endotelin altında bulunan nötrofil zarını göstermektedir. Diapedezi tamamlandıktan sonra, kavşaklar kapanır ve uyumlu ve pcam bir diyapedez bölgelerine yerleştirilir. Trans göç etmiş nötrofilin sınırları sarı renkle belirtilmiştir.Bu işlemi takiben, lökositlerin bagga veya transselüler kök kullanılarak endotelyumu geçip geçmediği gibi ek sorulara cevap vermek için lökosit trans endotel göçü yapılabilir.

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Bu hasat basınçlı kaplar endotele lökosit yapışma görselleştirmek için bir yöntemdir. Bu teknik, bu nedenle yüksek kan basıncı fizyopatolojik koşullardaki taklit-200 mmHg intralüminal basınca kadar farklı kayma akışı altında vasküler yapışma eğitimi sağlar.

Vasküler Endotel Yüksek Lumen Basıncı Görüntüleme Lökosit Adezyon

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu makale ilk umblikal damarlar, insan endotel hücreleri izole etmek için bir yordam açıklanır ve sonra akış koşullarında nötrofil göçü incelemek için bu hücreleri nasıl kullanılacağını gösterir. Camın optik karakteristikler ile bir polimer elde edilen bir düşük hacimli akış odası kullanılarak, nadir hücre popülasyonlarının canlı-hücre flüoresan görüntüleme da mümkündür.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Burada vasküler inflamasyon ve canlı farelerde trombüs oluşumu sırasında aktive endotel üzerindeki heterotipik trombosit-nötrofil etkileşimleri görselleştirmek için floresan intravital mikroskobu deneysel bir tekniktir rapor. Bu mikroskobik teknoloji vasküler hastalığın moleküler mekanizmasını incelemek ve patofizyolojik durumlardaki farmakolojik ajanları test için değerli olacaktır.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Anestezi uygulanmış farelerde intravital konfokal mikroskopi kullanarak kararlı durum ve enflamatuar koşullar altında mezenterik venlerdeki nötrofillerin ve monositlerin davranışını izlemek için bir protokolü detaylandırıyoruz.

Real Time Anestetize Farelerde Intravital Mikroskopi Mezenterik Damarlardaki nötrofiller ve monositler Görüntüleme

Lökosit heyecanla damar hücreleri ve trombositlerin damar duvar yaralanma sonra veya enflamasyon sırasında etkileşim. Burada, lökosit ve hücresel eşleri arasındaki etkileşimler altında yatan moleküler mekanizmaları karakterize etmek için basit bir laminar akış tabanlı tahlil açıklayın.

Lökosit işe kültürlü damar hücreleri ve yapışık trombositler üzerinde araştırmak için Laminar akış tabanlı deneyleri

Burada, monosit subpopulation altında akış tüp bebek belirli yüzey işaretleyicileri ve confocal floresan mikroskopi kullanımı ile ticareti ölçer entegre bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı diğer belirli yüzey işaretçileri kullanarak diğer lökosit alt türlerinden profil olarak sıralı işe alma adımları de keşfetmek için kullanılabilir.

Monosit altgrupları Vitro akışında altında alımı eş zamanlı çalışma

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Öğrenin, fizyolojik akış koşullarında nötrofil hücre hücre eklem geçişini gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, paraselüler ve transelüler göç yollarını ayırt ederek inflamatuar hastalıklara yönelik tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet