Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Bu prosedürün genel amacı, floresan görüntülemenin bir nanometre hassasiyetle veya Fiona deneyleriyle nasıl gerçekleştirileceğini göstermektir. Bu, önce gerekli ekipmanın kurulması ve optiklerin toplam iç yansıma, floresan, mikroskopi veya çim için hizalanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, CY 3D NA'yı bir numune odasının iç yüzeyinde hareketsiz hale getirmek ve CY 3D NA tek moleküllerini nanometre hassasiyetinde lokalize etmektir.

Daha sonra, Fiona, bir kuantum noktası ile etiketlenmiş tek bir kesilmiş miyozin beşinin hareketini incelemek için uygulanır. Sonuçta, miyozinin yürürken adım boyutu, Acton Fiona analizi ile 36 nanometre olarak ölçüldü. Bu yöntem moleküler motorlar hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre zarı üzerindeki reseptörlerin izlenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Deneysel detayların öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Kurulum sırasında her zaman lazer koruyucu gözlük takmak önemlidir. Toplam iç yansıma, floresan, mikroskopi veya çim için.

Başlamak için, tüm optik bileşenlerin yüksekliklerini mikroskobun merkezinin, arka bağlantı noktasının yüksekliğine ayarlayın, lazeri, lazer deklanşörünü ve ND filtrelerini monte edin. Işını görünür tutarken lazer gücünü mümkün olduğunca azaltmak için ND filtreleri kullanın. Vidaları uygun altıgen anahtarlarla sıkın.

Noktalı mavi çizgilerle gösterildiği gibi bir ışın yolu planlayın. Bu şemada, ışın yolunu optik tabla üzerinde bant veya işaretleyici ile işaretleyin. Ayna M1'i ilk dik açılı dönüşe yerleştirin, iki süseni planlanan kiriş yolunun ikinci düz bölümü boyunca yerleştirin.

M1'in hem konumunu hem de eğimini, lazer iris yer aynası M iki'den geçecek şekilde ayarlayın. İkinci dik açı dönüşünde, 10 x ışın genişleticiyi yolun üçüncü düz bölümü boyunca yerleştirin. Eğimini, ışın genişletici hem optik tablaya hem de planlanan ışın yoluna paralel olacak şekilde ayarlayın.

Bir sonraki adım, M1 ve M'yi iki, lazer her iki merceğin merkezlerinden düz bir şekilde geçecek şekilde, ışın genişleticinin L bir ve L iki'sinden geçecek şekilde yinelemeli olarak ayarlamaktır. Işın profilini gözle kontrol etmek için ışın genişleticiden sonra ışını engellemek için bir parça beyaz kağıt kullanın. Genişletilmiş kirişin ışın profili ED olmayana kadar ayarlayın.

Gauss, L bir ve L iki arasındaki mesafeyi, ışın harmanlanmış deklanşör olacak şekilde ayarlar. Lazer, mikroskop objektifini sökün ve bir floresan hizalaması vidalayın. Genleşmiş ışını mikroskop portuna ve dikroik aynaya yönlendirmek için hedef yer aynaları M üç ve M dört.

Taretin içinde. Işının en parlak kısmını floresan hedef üzerinde ortalamak için M üç'ü ve ışının dikey olarak eğilmesini sağlamak için M dördü ayarlayın, lazeri kapatın ve hedefi tekrar vidalayın. İyi. Lazer gücünü ve objektiften ışın profilini optimize etmek için M üç ve M dört'ün eğimlerini ayarlayın.

Bir E-M-C-C-D kamerayı mikroskoba monte edin ve kamerayı bir bilgisayara bağlayın. Kamera için yazılımı başlatın. Mikroskobun üzerine bir floresan numunesi monte edin.

Kameradaki parlak floresan noktaya bakın. Odak değiştiği için ekranda noktanın kaymadığını kontrol edin. TIR merceğini, objektifin arka odak düzleminden odak uzaklığına, yaklaşık 30 santimetre olan L üçe eşit bir mesafeye XY, Z öteleme aşamasına yerleştirin.

L üç'ün konumunu, lazer lensin merkezinden geçecek şekilde ayarlayın. Işın harmanlamasını ayarlamak için L üç'ü ışın yolu boyunca çevirin. Işının hala monitörde ortalandığından ve şekil olarak simetrik olduğundan emin olun.

Işını objektiften dışarı eğmek için L üçünü ışın yoluna dik olarak çevirin. Bir Fiona gerçekleştirmeden önce TIR lensini TIR elde edilecek şekilde çevirmeye devam edin. CY 3D NA'yı yerelleştirme ve mobilize etme deneyi. Tek moleküller, protokol metninde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi numune odaları oluşturur.

Kızağın üzerine uzun kenarlar boyunca iki şerit çift taraflı bant uygulanır, merkezde üç ila beş milimetre boşluk bırakılır ve daha sonra kaydırağın üstüne temizlenmiş bir kapak sürgüsü yerleştirilir, odanın sağdan ve önden yan görünümleri gösterilir. Haznenin açık uçları açık bırakılır ve numune haznesinin iç yüzeylerinde SI 3D NA'yı hareketsiz hale getirmek için giriş ve çıkış görevi görür. Hazneye 10 mikrolitre BSA biotin pipetleyin.

Beş dakika bekleyin. Numune haznesine 40 mikrolitre T 50 BSA pipetleyerek yıkayın. Daha sonra hazneye 10 mikrolitre nötr travain pipetleyin ve beş dakika inkübe edin.

Hazneyi 40 mikrolitre T 50 BSA pipet, 20 mikrolitre SI 3D NA ile numune haznesine tekrar yıkayın ve beş dakika inkübe edin. Son olarak, hazneyi 80 mikrolitre T 50 BSA ile yıkayın. Çim M altında SI 3D NA tek moleküllerini görüntüleme prosedürüne başlamak için, numune odasına 30 mikrolitre görüntüleme tamponu pipetleyin ve sekiz ila 10 dakika bekleyin.

Numuneyi görüntüleme için yeşil bir lazer, 100 X yağa daldırma objektifi ve bir EMCD kamera ile donatılmış bir çim mikroskobuna monte edin. Pozlama süresini ve EM kazancını ayarlayın. 1000 kare için örneğin bir filmini alın.

Fiona analizi için Fiona Pro'yu derleyin ve çalıştırın. Etkin piksel boyutunu ve yoğunluktan foton sayısına dönüştürme faktörünü girmek ve Fiona analizi için noktaları seçmek üzere elde edilen görüntüyü içe aktarmak için bu IDL programını kullanın. Sonunda, program, 2D Gauss fonksiyonlarının yanı sıra toplam foton sayıları ve lokalizasyon hassasiyeti ile montaj sonuçlarını çıkaracak ve pH sayımı pro'yu çalıştıracaktır.

Foton sayısını karakterize etmek için, bir flora tarafından yayılan ortalama foton sayısını ölçmek için bu DL programını kullanın. Elde edilen görüntüyü içe aktarmak ve yoğunluktan foton sayısına dönüşüm faktörünü girmek için fotoğraf ağartmadan önce dört. Program floresan noktaları algılayacak, foton sayımlarını çerçeve numarasının bir fonksiyonu olarak otomatik olarak hesaplayacak ve foton sayımlarının izlerini çıkaracaktır.

DD H2O'da mililitre başına bir miligramda 20 mikrolitre biyotinile BSA'yı bir numune haznesine pipetleyerek numuneyi bu deney için hazırlayın. 10 dakika inkübe edin. 30 mikrolitre D ddh, mililitre nötr travain başına 0.5 miligramda iki O pipet ile durulayın ve iki dakika inkübe edin.

Hazneyi 30 mikrolitre M beş PSA ile yıkayın. Bu deney için acton, protokol metninde açıklandığı gibi bir önceki gün hazırlanmalıdır. Hazırlanan f aktini genel olarak 25 kez seyreltin, aktin tamponunu mililitre başına yaklaşık 0.004 miligramlık bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin.

Aktin solüsyonunu hazneye pipetleyin ve 10 dakika bekleyin. Hazneyi 30 mikrolitre tamponla durulayın, miyozin beş A'yı bayrak etiketleriyle 30 oranında seyreltin. Bir M beş tamponu 250 nano molar nihai konsantrasyona katlayın.

Bir mikrolitre seyreltilmiş miyozini bir mikrolitre Anti-Flag Q.Do 7 0 5 ile karıştırın. 10 mikrolitreye doldurmak için sekiz mikrolitre M beş ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.

Miyozin Q nokta içeren 20 mikrolitre görüntüleme tamponunu numune haznesine pipetleyin. Sekiz ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Numuneyi çim mikroskobunda 30 milisaniyelik bir pozlamada görüntüleyin.

Veri analizine başlamak için en az 1000 çerçeve edinin. Video dosyasını görüntü J'de açın ve videoyu hareketli bir nokta etrafında kırpın. Videonun her karesine Fiona analizi uygulayarak piksel cinsinden zaman içinde X ve Y koordinatları oluşturmak için videodaki noktayı takip edin.

Pikselleri protokol metninde açıklandığı gibi nanometreye dönüştürün. Zamanın bir fonksiyonu olarak başlangıç konumundan yer değiştirmeyi hesaplayın. Miyozin yürüyüşünün adımlarını elde etmek için yer değiştirme üzerinde bir T-testi yapın.

Adım boyutu sütunundan tüm sıfır değerlerini silin. Başlangıç veya matlab kullanarak adım boyutlarının dağılımını çizin. Histograma bir Gauss sığdırın.

Bu tipik yüzey görüntüsünde SI 3D NA'yı hareketsiz hale getirin. Sarı ok, nokta yayılma fonksiyonu veya PSF'si burada gösterilen tek bir SI 3D NA molekülüne işaret eder. PSF, iki boyutlu bir Gauss fonksiyonu ile donatılmıştır ve montaj kalıntıları da gösterilmiştir. Bu grafik, kare sayısına karşı foton sayısının tipik bir izidir ve üstel uydurma, miyozin adım boyutunu ölçmek için yaklaşık 1.4 çarpı 10'a altıncı ortalama foton sayısını verir, tek bir miyozinin gürültüsüne iyi bir sinyale sahip bir video dosyası.

Yürürken, bir aktin filamenti yakalanır. Üç örnek çerçeve gösterilmiştir. Fiona'nın her kareye uygulanması, kırmızı ile çizilmiş bir mesafeye karşı zaman izi verir.

Tek tek adımları çıkarmak için T-testine dayalı bir adım bulma algoritması kullanılır ve çıktı beyaz Adım boyutları üzerine yerleştirilir ve nanometreler beyaz olarak etiketlenir. Birden fazla izden gelen adımlar bir histogramda birleştirildiğinde, ölçülen adım boyutları yaklaşık 35.8 artı veya eksi 0.4 nanometre Gauss dağılımındadır. Bu videoyu izledikten sonra, çim mikroskobu kurmak da dahil olmak üzere Fiona deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız En iyi sonuçları elde etmek için Bu prosedürlerle, zemin kuvveti kullanımına ve deneylere yönelik fotoğraf hasarını en aza indirmek önemlidir.

Çim mikroskobu ve Fiona ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken koruyucu gözlük gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.