Name: Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Öğrenin, tek molekül lokalizasyonu için FIONA tekniğini; miyozin motorlarının 36 nanometrelik adım boyutunu yüksek hassasiyetle ölçerek hücresel süreçleri anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH Hibe 068.625, NSF Bağış 1063188 ve 0822613. Özel teşekkür tavşan gözlerinde hediye için İleri Bilim ve Teknoloji Beckman Enstitüsü&#39;nün Dr Marina Marjanovic gitmek Yaşayan Hücrelerinin Fizik Merkezi tarafından desteklenmiştir.

Etik Açıklama: tavşanlardan Kornea dokusu Illinois Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı kılavuzların Üniversitesi doğrultusunda toplanmıştır. 1. TIRFM Kur NOT: lazer güvenlik gözlük Tüm zaman giyin. <ol><li> Malzeme Listesi'nde yer gerekli tüm optik bileşenleri mevcuttur ve uyum için hazır olduğundan emin olun. Gerekirse, diğer şirketlerden eşdeğer fonksiyonları ile değiştirmeleri kullanın. Aynalar ve lensler kullanımı lazer eşleşen anti yansıtıcı (AR) kaplamalar olmalıdır emin olun. </li><li> Mikroskop arka bağlantı noktası merkezinin yüksekliği tüm optik bileşenlerin yükseklikleri ayarlayın. </li><li> Lazer, lazer çekim ve ND filtre (ler) monte edin. Görünür ışın tutarken mümkün olduğunca düşük lazer gücü aşağı zayıflatmak ND filtreleri kullanın. Uygun altıgen tuşları ile vidalarını sıkın. </li><li> Bir ışın yolu planlamak ve optik masaya bant veya işaretleyici (nokta ile işaretleyinŞekil 1'de ted mavi çizgiler). Kolaylık olması açısından, optik masaya delik hattı boyunca düz bir koridor tutun. </li><li> Yer ayna M1 ilk dik açı fırsatta (Şekil 1). Planlanan ışın yolunun ikinci düz bir bölüm boyunca iki süsen yerleştirin. Konumunu ve lazer süsen geçer şekilde M1 eğimini hem ayarlayın. </li><li> Yer ayna M2 ikinci dik açı fırsatta (Şekil 1). Yolun üçüncü düz kesit boyunca 10X ışın genişletici (L1 ve L2, Şekil 1) yerleştirin. Işın genişletici optik masa ve planlanan ışın yolu hem de paralel olduğunu eğme gibi ayarlayın. <ol><li> Lazer, ışın her iki lenslerin merkezleri ile düz bir şekilde gider M1 ve M2 yinelemeli gibi ayarlayın. Genişletilmiş ışın demeti profili Gauss olmayan kırkılmış kadar bu adımı tekrarlayın. </li></ol></li><li> (L1 ışınını ortalamak için Fi M1 ayarlayınsaat'in 1) ve M2 yinelemeli L2 kiriş (Şekil 1) merkezi. Kötü bir ışın profili, genellikle lazer kesilmiş olduğu anlamına gelir; Göz ile ışın profilini kontrol etmek için ışın genişletici sonra ışın engellemek için beyaz bir parça kağıt kullanın. Yüksek hassasiyetli analizi için, optik bir ışın profilcisini kullanmak. </li><li> Işın collimated öyle ki L1 ve L2 arasındaki mesafeyi ayarlayın. Tekrarlayın Adım 1.8 ve 1.9 gerekirse. NOT: kiriş boyutu mesafe ile değişmez zaman, kiriş bir TIRFM kurulum için yeterli collimated. Ayrıca ışın kolimasyon artırmak için, bu tür bir makaslama interferometre gibi araçlar kullanılabilir. Genişlemesinden sonra tipik bir kiriş boyutu ~ 20 mm'dir. </li><li> Shutter, lazer. Mikroskop objektif sökün ve bir floresan hizalama hedef vida. Yer M3 ve M4 (Şekil 1) mikroskop portuna ve taret içindeki renkli aynadan üzerine genişletilmiş ışını doğrudan yansıtır. Lazer ışını t sıçrar emin oluno dikroik ve tavana doğru. </li><li> Floresan hedef ışınının parlak bölümünü ortalamak için M3 ayarlayın ve M4 ışın eğim dikey olarak ayarlamak için. </li><li> Shutter, lazer ve geri hedefini vida. Önceki adımda hizalama yapılırsa iyi hedefini çıkan simetrik bir nokta olmalıdır. İnce ayar M3 ve M4 eğilmeler amacı dışında lazer gücü ve ışın profili optimize etmek. </li><li> Mikroskop bir EMCCD kamera monte ve bir bilgisayara kamera bağlamak. Kamera için yazılımını başlatın. </li><li> Mikroskop floresan örnek (Flüoroforlann çözelti) monte edin. Kameradaki parlak floresan noktada bak. Odak değiştiğinde nokta ekranda kaymamasını kontrol edin. </li><li> L3 odak uzunluğu (~ 30 cm) eşittir hedefi arka odak düzlemi bir mesafede XYZ çeviri sahnede TIR lens (L3, Şekil 1) yerleştirin. L3 pozisyonunu ayarlayınve lazer lens merkezinden geçer ki. </li><li> Kiriş paralelleştirilmesini ayarlamak için ışın yolu boyunca L3 Çevir. Kiriş hala monitörde merkezli ve şekli simetrik olduğundan emin olun. NOT: TIR lens odak uzunluğunun azaltılması ile örnek düzlem artar aydınlatma alanı. Genel olarak, set-up sığabilir küçük odak uzunluğunu kullanın. </li><li> Amacın kirişi yatırmak için ışın yoluna dik, L3 çevirir. TIR elde edilir, öyle ki, TIR lens tercüme edin. Iyi SNR almak için EMCCD kamera ve ince ayar L3 ile floresan boncuk örneği gözlemleyin. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500"> Toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için 1. Optik yapılandırmasını Şekil. Cy3 DNA 2. FIONA <ol><li> Cyalın mikroskop slaytlar ve lamelleri: GKD 2 O ve izopropanolle mikroskop slaytlar ve lamelleri durulayın ve azot gazı ile kurulayın; Ar plazma altında 5 dakika boyunca plazma temizleyici slaytlar ve lamelleri yerleştirin. </li><li> (Şekil 2 kabataslak) örnek odalarını Construct. <ol><li> Bankta bir doku yerleştirin ve sonra doku üstüne objektif bir parça kağıt koyun. Objektif kağıt üzerinde slayt yerleştirin. Slayt temiz tarafı yukarı olduğundan emin olun. </li><li> Merkezinde 3-5 mm arasında bir boşluk bırakarak, uzun kenarları boyunca slayt üzerine çift taraflı bant ile iki şerit uygulanır. Slayt üstüne temizlenmiş lamel yerleştirin. Lamel temiz tarafı slayt baktığından emin olun. </li><li> Çift taraflı bant üzerinde aşağı basmak için pipet kullanın. Bant sadece coverslip altında kalacak şekilde slayt aşırı bandı çıkarmak için bir jilet kullanın. Not: bölmesinin açık uçları açık bırakılır ve benzeri gibi giriş ve çıkış hizmet verirlerlet. Kamara hacmi birkaç mikrolitredir. </li></ol></li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500"> Tipik bir örnek odasının Şekil 2. Eskiz: (a) en görünüşüdür. (B) sağdan Yandan görünüm; Ön (c) yan görünüşüdür. <ol start="3"><li> Örnek odalarının iç yüzeyleri üzerinde Cy3 DNA hareketsiz. <ol><li> T-50 tamponu (10 mM Tris-HCI pH 8.0, 50 mM NaCI) hazırlayın. 1 mg / ml nihai konsantrasyonda, T-50 BSA-biyotin hazırlayın. 10 mg / ml nihai konsantrasyonda, T-50 BSA çözülerek T50-BSA tamponu hazırlayın. </li><li> 0.5 mg / T50-BSA tamponu ml NeutrAvidin hazırlayın. 5-10 pM nihai konsantrasyonda biyotinile Cy3 etiketli DNA T50-BSA içinde (Cy3-DNA) hazırlayın. </li><li> Örnek odasına pipetle 10 ul BSA-biyotin (1 mg / ml). 5 dakika bekleyin. </li><li ul t50-bsa ile b y odas pipetle n mg ml dakika boyunca ink edin.><li> 40 ul T50-BSA ile bölmesi yıkayın. Numune bölmesindeki balona, ​​20 ul Cy3 ile DNA arasında değişir. 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 80 ul T50-BSA ile bölmesi yıkayın. </li></ol></li><li> Resim Cy3 DNA TIRFM altında, bir molekülleri. <ol><li> 50 ul 6-hidroksi-2,5,7,8-, 1 ul Protocatechuate-3,4-dioksijenazı (PSD, 5 uM), 4 ul protokateşuik asit (ABA, 62.5 mM) ile muamele görüntüleme tamponu (100 ul) hazırlayın tetrametilkroman-2-karboksilik asit (T-50 olarak Trolox®, 2 mM) ve 45 ul T50-inkübe edilmişlerdir. </li><li> Ve 30 ul görüntüleme tamponu Pipet 8-10 dakika bekleyin. </li><li> Yeşil lazer (532 nm) ile donatılmış bir TIRFM üzerinde görüntüleme için örnek montaj, 100X immersiyon yağı objektif (1.45 NA) ve bir EMCCD kamera. </li><li> 1,0 için örnek bir film Edinme 100'e 100 ile 500 msn ve 25 EM kazanç pozlama süresini ayarlayın00 kare. </li></ol></li><li> Cy3-DNA kaydedilen görüntülerde Fiona veri analizi yapın. <ol><li> Etkin piksel boyutunu belirlemek (yani nanometre piksel dönüşüm faktörü) fiziksel piksel boyutunu bölerek toplam büyütme (herhangi bir ekstra büyütmelerle çarpılır mikroskop objektif büyütme) tarafından (EMCCD kamera özellikler sayfasında okur). </li><li> CCD hassasiyetini görüntü alımı sırasında kullanılan (yani, CCD kamera özellikler sayfasında okumak, A / D sayımı, başına elektronlar) elektron çarpanı (EM) kazanç bölerek sayıları foton piksel yoğunluğunun gelen dönüşüm faktörünü belirlemek. </li><li> Derleme ve Fiona analiz için FIONA.pro çalıştırın. Girişi (Adım 2.5.1 'dan itibaren) etkin piksel boyutu ve (Adım 2.5.2' dan itibaren) foton sayısına yoğunluğundan dönüşüm faktörü, elde edilen görüntüyü almak için bu IDL programı kullanın ve Fiona analiz için noktalar seçin. Not: Sonunda, programmingm irade çıktı 2B Gauss fonksiyonlarının yanı sıra, toplam foton numaraları ve yerelleştirme hassasiyetle uydurma sonuçları. Tipik bir sonuç temsilcisi sonuçları ve Şekil 4c-4d bölümünde gösterilir. </li><li> Derleme ve foton sayımı karakterize etmek phcount.pro çalıştırın. (Adım 2.5.2 'dan itibaren) foton sayısına yoğunluğundan alınan görüntü ve girişe dönüşüm faktörü ithal etmek, ışıkla önce flüorofora tarafından yayılan fotonların ortalama sayısını ölçmek için bu IDL programı kullanın. NOT: Program daha sonra, (manuel seçim bir seçenek) otomatik floresan noktalar tespit çerçeve sayıda fonksiyonu ve çıkış olarak foton sayımı izlerini foton sayısı hesaplar. <ol><li> Kötü izleri atın ve temel düzeltme için ışıkla sonra kare aralıkları belirtin. Sonunda, program çıktısı tüm noktalar için toplam foton numaralarının listesi değildir atılır olacaktır. Daha sonra foton sayıları dağılımını çizmek ve dağılımının uygunBir üslü ile yon ortalama foton numarasını elde etmek. Tipik bir sonuç temsilcisi sonuçları bölümünde gösterilen ve 4e-4f Rakamlar edilir. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Fiona Uygulamalı Nanometre Ölçeğinde Motor (örneğin, Aktin üzerinde miyozin) Dynamics belirlememize <ol><li> Aktin polimerize Fiona deneyden bir gün önce (yani F-aktin hazırlamak). <ol><li> Genel aktin tamponu ile mi, 10 mg / G-aktin (monomer) ve biyotin G-aktin (monomer) sulandırın. De tamamen çözülmüş olduğundan emin olun, ve buz üzerinde hem tutmak için karıştırın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 1.7 ul biyotin, G-aktin 10 ul, G-aktin (monomer) karıştırın. 100 ul buz gibi soğuk tampon aktin polimerizasyonu ekleyin. </li><li> 4 ° C'de bir gece beklettikten sonra (F-aktin oluşturulan) ve daha sonra 1 ml bir toplam hacme GKD 2 O ekleyin. </li><li> Deneylerde daha sonra kullanılmak üzere 4 ° C 'de aktin filamanlarını (F-aktin) saklayın. NOT: Filamentler parçalanır ve zaman içinde kısaltmak, ancak en az iki hafta boyunca kullanılabilir olacaktır. </li></ol></li><li> Görüntüleme için örnek hazırlayın. <ol><li> (Protokol 2.1 ve 2.2 'de tarif edildiği gibi), bir numune haznesi yapın. Ile kombine edilmiştir 2 O 1 mg / ml BSA, 20 ul biyotinile edilmiş Pipet 10 dakika boyunca inkübe edin. 30 ul GKD 2 O. ile durulayın NOT: Bu bloklar, cam yüzeyi ve aktin filamentler bağlanması için biotin belirlemektedir. Biyotinile edilmiş, poli-L-lisin - polietilen glikol (PEG-PLL) ile aynı fonksiyonu görür. </li><li> 0.5 mg / ml nötravidin Pipet. 2 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra 30 ul M5 tamponu ile bölmesini yıkayın. </li><li> Hazırlanan F-aktine Pipet nihai konsantrasyon ~ 0,004 mg / ml ila genel aktin tamponu içinde 25 kez seyreltilmiştir. , 10 dk bekleyin 30 ul tamponu ile odasını durulayın. </li><li> A bir nihai konsantrasyonu o M5 tamponu (20 mM HEPES (pH 7.6), 2 mM MgCI2, 25 mM KCI, 1 mM EGTA) içinde FLAG etiketleri ile 30 kat seyreltiniz Va miyosinf 250 nM. (Üreticisinden kullanma kılavuzuna göre Qdot705 Antikor Birleşme Kit kullanarak Anti-FLAG antikorlar ve Qdot705 gelen konjuge ~ 1 mcM) 1 ul Anti-FLAG-Qdot705 ile 1 ul miyozini karıştırın. 10 ul doldurmak için 8 ul M5 ekleyin. Pipet ve aşağı yukarı iyice karıştırın. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. NOT: Bu ~ 25nM miyosin konsantrasyonda kullanıldığında, 1 ila 4, motor kuantum noktaları bir karışımını verir. </li></ol></li><li> Aktin üzerinde yürüyen miyozin görüntüleme. <ol><li> Karıştırılarak görüntüleme tamponu (100 ul) hazırlayın 84 ul M5, BSA (1 mg M5 tampon / ml BSA), 1 ul ATP (GKD 2 O 50 uM), 2 ul DTT (500mM GKD 2 O), 1 CK ul (500 U / ml), 5 ul CP (200 mM), 1 ul PCD, 4 ul PCA, 1 ul miyozin Qdot sonra 2.5 nM miyozin konsantrasyonu ve 1 ul BME için başka bir 10-kat seyreltilmiştir. </li><li> 20 ul görüntüleme tamponu Pipet odasını örnek ve 8-10 dakika inkübe. </li><li> Görüntü T örnek30 msn pozlama IRF mikroskop. En az 1000 kare edinin. Gerekirse Adım 3.3.1 miyozin-Qdot seviyesini ayarlayın. </li></ol></li><li> Veri analizi yapın ve miyozin yürüme adım boyutunu bulabilirsiniz. <ol><li> ImageJ 17 video dosyasını açın ve hareketli bir nokta etrafında video kırpmak. Spot asla kenarının 20 piksel içinde alır yeterince büyük bir alanı kırpmak ve video başka noktalar vardır emin olun. Bu noktada doğrusal bir yolda hareket emin olun. </li><li> X oluşturmak için video aracılığıyla noktayı izlemek ve y her ve videonun her karesine Fiona analizi (Adım 2.5.3) uygulayarak, piksel, zaman içinde koordinatları. </li><li> Önceki bölümde açıklandığı gibi, nanometre pikselleri dönüştürün. </li><li> Zamanın bir fonksiyonu olarak başlangıç ​​konumundan yer değiştirme hesaplayın. </li><li> Miyozin yürüyüş adımları edinmek için deplasman t-testi çalıştırın. Not: t-testi (step_t_test.zip) için sunulan program IDL ve con kodlanmıştırklasörde bulunan 14 altrutinlerin ibarettir. <ol><li> IDL altrutinlerin tüm açın ve iki kez tüm derlemek. Sonra mtltyanalysis_ttest.pro çalıştırın ve tek bir sütunda sadece uzaklık verilerini içeren bir metin dosyasını seçin. Bir çıkış Excel dosyası ham veri, uyum ve adım boyutunu içeren, oluşturulur. </li></ol></li><li> Adım boyutu sütundaki tüm sıfır değerleri silin. Kökeni veya MATLAB kullanarak adım boyutları dağılımını çiziniz. Histograma bir Gauss takın. Not: sıfır arasında değişen aşamalı bir adım yok önceki çerçeveden alınır anlamına gelir, çünkü sıfır değerleri Adım boyutları silinmesi gerekir. (Şekil 5'de gösterildiği gibi) uygun 36 nm civarında bir tepe noktası verir. </li></ol></li></ol> FIONA 4. Numune Hazırlama Kalın <ol><li> Sol-jel kapsüllü kuantum noktalar hazırlayın. <ol><li> Karıştırın 4.5 mi TMOS, 1 mi GKD 2 O ve 100 ul HCI (120 mM) getirilmiştir. Ultrasonik temizleyici sp 30 dakika boyunca buz üzerinde karışımın sonikasyonMalzeme Listesi ecified (frekans = 40 kHz, ısıtıcı = off). Çözüme her 10 dk karıştırın. </li><li> 1.5 mi HEPES (50 mM, pH = 7.2) içinde 1.5 ul Qdot605 seyreltin. Önceki adımdaki 1.5 ml TMOS ile çözüm karıştırın. </li><li> Bir cam alt çanak içine karışımı dökün. 1. 5 saat boyunca 4 ° C'de cam alt Parafilm ile çanak ve mağaza mühür. </li><li> Numune çanağı PBS içerisinde 2 ml% 1 BME ekleyin ve görüntüleme önce 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li></ol></li><li> Kuantum noktaları ile boyandı kornea örnek hazırlayın. NOT: Tavşan gözler Dr Marina Marjanovic gelen hediyeler vardı. <ol><li> Gözlerden kornea ayırın ve 3 mm x 3 mm parçalar halinde kesin. </li><li> 1 ml PBS içinde 1 ul streptavidin-Qdot 605 seyreltin. 4 ° C'de 1 nM Qdots çözeltisi ile kornea doku inkübe 1 saat boyunca ° C. PBS ile doku yıkayın. </li><li> Temiz bir cam slayt ve # 1.5 lamel alın. , Uzun kenarı boyunca cam slayt üzerine çift taraflı bant 4 katmanları koymaknd önceki bant çift taraflı bant paralel başka bir 4 kat koymak ve aralarında yaklaşık 1 cm bir kanal bırakın. Kanalın ortasında içinde önceki aşamada elde edilen doku koyun ve bir lamel ile örtün. </li><li> Yavaşça lamel tarafta basın o kasetleri sopa yapmak. Görüntüleme önce 50 ul PBS ile kanal ıslatın. </li></ol></li><li> Sol-jel ve korneada Görüntü kuantum noktalar. <ol><li> Kalın örneklerinde Fiona görüntüleme için, 0.27 mm veya 0.28 mm çalışma mesafesi ile 60X su daldırma hedefi çalışma mesafesi ile 60X su daldırma objektif kullanın. </li><li> Mikroskop örnek monte edin. Bu epi-floresan modu ulaşacak şekilde TIRF lens ayarlama (yani, lazer ışını lamel karşı açı objektif çıkar). Ekstra bir büyütme merceği (3.3X veya 4.0x) takın. </li><li> Istenen z konumuna (örneğin&gt; 200 mikron) için hedefi odak düzlemini hareket ettirin. Hareketsiz rekor görüntülerinumunede kuantum noktalar. </li></ol></li><li> Bu protokolün 2.5 bölümünde açıklandığı gibi Fiona analizi yapın. </li></ol>

<ol><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li>
<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope+%28continued%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued).</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).</li>
<li>Thompson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+Walks+Hand-Over-Hand%3A+Single+Fluorophore+Imaging+with+1.5-nm+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+Walks+Hand-Over-Hand%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinesin Walks Hand-Over-Hand.</a> Science. 303 (5658), 676-678 (2004).</li>
<li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+VI+Steps+via+a+Hand-over-Hand+Mechanism+with+Its+Lever+Arm+Undergoing+Fluctuations+when+Attached+to+Actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).</li>
<li>Yildiz, A., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Imaging+with+One+Nanometer+Accuracy%3A+Application+to+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).</li>
<li>Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+kinesin+is+so+processive%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why kinesin is so processive.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).</li>
<li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+melanosomes+inside+a+cell+to+study+molecular+motors+and+their+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).</li>
<li>Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+high-resolution+imaging+with+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).</li>
<li>Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer-localized+multiple+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).</li>
<li>Churchman, L. S., Ökten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+high-resolution+colocalization+of+Cy3+and+Cy5+attached+to+macromolecules+measures+intramolecular+distances+through+time%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+Super-Resolution+Imaging+with+Photo-Switchable+Fluorescent+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+international%22%5BJournal%5D)">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li>
<li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li>
<li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li>
<li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li>
<li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Fiona 1 msn 4 8 aşağı nanometre hassas ve zamansal çözünürlüğe sahip bir floresan yayıcı (organik flüorofor ya da kuantum nokta) konumunu lokalize bir tekniktir. Yeterli fotonlar toplandığı zaman, bu tekniğin çok daha doğru kırılma sınırı (~ 200 nm) daha floresan emitörün konumunu belirlemek için izin verir ve bu nedenle bu tekniği geleneksel / konvansiyonel optik mikroskopi 4 ile görülmemiştir ne gözlemlemek için bir yol açar - 8. Onun icadından bu yana, Fiona başarılı şekilde Miyosinle...

1882 civarında, Ernst Abbe bir görünür ışık mikroskobu çözünürlüğü olduğu bulundu ~ λ / 2NA, (λ dalga boyu ve NA sayısal açıklık olduğu) 1,2 ~ 200 nm veya. Bu nedenle, bu boyutundan daha küçük bir amacı, bir optik mikroskop bir kırınım sınırlı bir leke olarak görülecektir. Bununla birlikte, daha yüksek bir hassasiyet ile 3, bir nokta merkezini, nesnenin konumunu belirlemek mümkündür. Bir nanometre doğruluk (Fiona) ile floresan görüntüleme xy düzleminde 4 nanometre hassasiyetle tek florosforlar lokalize için basit ama kullanışlı bir tekniktir. Lokalizasyon hassasiyet, σ μ (yani, ortalamanın standart hatası) toplandı, fotonların sayısına bağlıdır <img alt="Denklem 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100"> N foton sayısı olduğu, s floresan noktanın standart sapmasıdır, a,piksel görüntü detektörünün büyüklüğü, ve b, 3,4 arka standart sapmasıdır. ~ 10.000 fotonları yayan bir flüorofora için, Fiona ~ 1 nm hassasiyet 4 elde edebilirsiniz. FIONA hassas bir şekilde sabit bir yayıcı konumunu, ya da (yeterince hızlı alınabilir görüntü varsayılarak) hareketli bir belirlemek için kullanılabilir. Fiona filmin kareleri sırayla uygulanan ve böylece tek bir molekülün 4 8 hareketini takip edilebilir. Foto-koruyucu reaktifler örnek ışıkla olmamasını sağlamak için gerekli olabilir. Ayrıca, flüoresan nesnenin kendisi herhangi bir boyutta olabilir, örneğin kısıtlayıcıları kırınım daha küçük ya da daha büyük, kendi zar üzerinde dağıtılmış çok sayıda floresan proteinleri ile bir organel (~ 1 mm) teşekkül edebilir. Fiona hala ortalama merkezden-of-kütlesinin çok doğru (nanometre) ortalama verim kullanma. FIONA tarafından yerelleştirme hassasiyetle büyük bir gelişme nanome çözme sağlarzaman içinde tert-ölçekli hareketleri. Bu moleküler uzunluk ölçüsü 4 8 içine mikroskopi itti. Onun icadından bu yana, Fiona çeşidi geliştirilmiştir. Örneğin, parlak-alan bir-nanometre doğruluk (bFIONA) 9, FIONA hafif bir varyantı, görüntüleri ile görüntüleme ve iletilen ışık ile böyle Melanozomlar in vivo (pigment melanin içeren koyu nesneler) gibi yoğun nesneleri lokalize. Buna ek olarak, birden fazla boyayı Fiona gidermek için kullanılmıştır. Örneğin, ışıkla ağartma (karides) ile birlikte tek bir molekül yüksek çözünürlüklü bir 10,11 veya tek molekül yüksek çözünürlüklü ko (SHREC) 12 yaklaşık 10 nm olan, iki boya çözmek için geliştirilmiştir. (Bu kararın bu bir arayla aynı boyaları söyleyebilirim ne kadar doğru, yani dikkat edin.) Daha yakın zamanlarda, Fiona analizi bazı süper çözünürlük mikroskopi yerelleştirme sürecine katkıda böyle Stokastik optik reco gibinstruction mikroskobu (STORM) 13-15 ve geçici koyu flüoroforlar heyecan ve floresan lokalize edildiği fotoaktif localisation mikroskobu (PALM) 16,. Defalarca heyecanlı oldukça düşük boyaların yoğunluğu (az bir başına kırılma sınırlı nokta), ve daha sonra FIONA her bunların analiz, floresan toplayarak, tek bir yüksek çözünürlüklü haritayı kurabilirsiniz. Çözünürlüğü sonra sadece her bir boya dışarı koyar fotonların sayısı, yanı sıra satın alma sırasında (örneğin dahil, mikroskop sahne) numune sabit tutmak gibi şeyler sınırlıdır. Bu makalede, bir Fiona tekniğin bir özeti ve kısaca Fiona bildirilmektedir kullanılarak yapılmıştır araştırma örneklerini tarif eder. İlk olarak, nasıl optik hizalama hakkında ayrıntılar yani Fiona deneylerde, toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için gerekli ekipman kurmak, tarif edilir. Sonra nasıluygun protokolleri kullanarak hareketsiz Cy3-DNA tek moleküllerini lokalize basit Fiona deneyi yürütmek, gösterilmektedir. Bundan sonra, Fiona'yla kullanımı kuantum nokta ile işaretlenmiş tek bir tepe bölümü kesik miyozin Va motorun 36 nm aşaması boyutunu ölçmek için sunulmuştur. Miyozin Va aktin filamentler boyunca translocating Hücresel kargo taşıyan bir temel süreçsel motoru proteindir. Burada Va kesik oluşturmak miyozin adım boyutuyla ilgisiz etki ayrılması için kullanılan ve bir FLAG etiketi C-terminaline ilave Anti-Flag antikorları ile işlevselleştirilmiş kuantum noktaları ile etiketleme kolaylığı sağlamak için. Bu deney miyozini yavaşlatmak ve her karede iyi bir foton sayısı almak için yeterince uzun pozlama süreleri kullanımına izin düşük ATP altında yapılır. Herhangi yeterince parlak floresan etiket aşağıdaki protokolde ikame edilebilir. Son olarak, kalın örnekleri FIONA uygulamasını uzanan son çaba bildirdi. Proof-of-prensip olarak, kuantum noktalar batırılmışSol-jel ve tavşan gözü kornealar ve sonra yansıması ve FIONA'sı kullanılarak lokalize. Görüntüleme için, NA ile 60X su daldırma objektif bu hedefi daha önceden kullanılan 100X immersiyon yağı hedefi daha uzun çalışma mesafesi vardır, çünkü 1.2 kullanıldı =. Objektifine büyütmede kaybını telafi etmek için fazladan bir büyütme merceği (3.3X veya 4.0x) emisyon yoluna yerleştirilen edilmiştir. Buna ek olarak, epi-floresans (değil TIR) mikroskopisi kalın örneklerde derin bölgeleri ulaşmak için kullanılması gerekir. Bu sol-jel ve 2-3 nm hassasiyetle lokalize edilebilir tavşan gözü kornealar (Z&gt; 200 mikron) derin batırılmış kuantum noktalar gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Çift taraflı bant</td><td>3M</td><td></td> <td>~ 75 & # 181; m kalınlığında</td></tr><tr><td>EMCCD kamera</td><td>Andor Teknolojisi</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonik temizleyici</td><td>Branson</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>Floresan filtre seti</td><td>Chroma</td><td>49016</td><td></td></tr><tr><td>Aktin polimerizasyon tamponu&nbsp;</td><td>Hücre iskeleti&nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>Biotin G-aktin</td><td>Hücre İskeleti&nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>G-aktin&nbsp;</td><td>Hücre iskeleti&nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>Genel aktin tamponu&nbsp;</td><td>Hücre iskeleti&nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>Lazer deklanşör (sürücülü)</td><td>Elektro-Optik Ürünler A.Ş.</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>Exelis Görsel Bilgi Çözümleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>Lamel</td><td>Fisherbrand&nbsp;</td><td>22X30-1.5</td><td>0.16-0.19 mm kalınlığında</td></tr><tr><td>Mikroskop slayt</td><td>Altın Mühür Microslides&nbsp;</td><td>30103X1</td><td>0.93-1.05 mm kalınlığında</td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick Plazma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt tabak&nbsp;</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-DNA oligos</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>5'-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3'Bio</td></tr><tr><td>Floresan boncuklar&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-streptavidin ve nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Antikor Konjugasyon Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optik tablo</td><td>Newport Corp</td><td></td><td>RS4000 Serisi</td></tr><tr><td>60X Objektif</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100X Objektif</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 100X/1.45 Yağ &infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60X Objektif</td><td>Olympus</td><td>UPlanApo 60X/1.20W</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX70/IX81</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3755</td><td>Tavşan kasından Kreatin Fosfokinaz</td></tr><tr><td>CP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937</td><td>Fosfokreatin di(tris) tuzu</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td>DL-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) -N, N, N ve prime;, N & prime; -tetraasetik asit</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>PCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03930590</td><td>Protocatechuic asit&nbsp;</td></tr><tr><td>PCD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8279</td><td>Protocatechuate-3,4-dioksijenaz&nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341436-25G</td><td>Tetrametil ortosilikat</td></tr><tr><td>Tris-HCl&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilroman-2-karboksilik asit</td></tr><tr><td>1 "çaplı geniş bant dielektrik aynalar</td><td>, Thorlabs ve nbsp;</td><td>BB1-E02, KM100</td><td>Miktar: 2</td></tr> <tr><td>& frac12; &rdquo; çap direkleri</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR4</td><td>Adet > 6</td></tr><tr><td>10X ışın genişletici</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>2" çap f = 300 mm lens</td><td>, Thorlabs yuvalı&nbsp;</td><td>LA1256-A, LMR2</td><td>TIR lens</td></tr><tr><td>Floresan hizalama hedefi&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td></td><td></td>VRC2SM1</tr><tr><td>Lazer güvenlik gözlüğü</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LG3</td><td></td></tr><tr><td>ND filtre(ler)</td><td>iThorlabs&nbsp;</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>Optik ışın profilleyici</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>BP209-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Direğe monte iris diyaframı</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ID25</td><td>Miktarı: 2</td></tr><tr><td>Kesme interferometresi</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ çeviri aşaması, &frac12; &rdquo; Seyahat&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Lazer</td><td>Dünya Yıldızı Teknolojileri&nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 nm, 30 mW</td></tr></tbody></table>

bir nanometre hassasiyet floresans görüntüleme (fiona)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Bir nanometre doğruluk (Fiona) ile floresan görüntüleme xy düzleminde nanometre hassasiyetle tek florosforlar lokalize için basit ama kullanışlı bir tekniktir. Burada FIONA tekniğin bir özeti ve rapor edilir FIONA&#39;sı kullanılarak yapılmıştır araştırma örnekleri kısaca tarif edilmektedir. İlk olarak, nasıl optik hizalama hakkında ayrıntılar yani Fiona deneylerde, toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) için gerekli ekipman kurmak, tarif edilir. O kadar bir kuantum nokta ile işaretlenmiş tek bir tepe bölümü kesik miyozin Va motorun 36 nm Adım boyutunu ölçmek için FIONA kullanılması, ardından uygun olan protokolü kullanılarak immobilize Cy3 DNA tek molekülleri lokalize basit Fiona deneyi yürütmek için görüntülenmiştir. Son olarak, kalın örnekleri FIONA uygulama genişletmek için son çaba bildirilmiştir. &gt; (Bu bir suya daldırma objektif kullanılarak, olduğu gösterilmiştir ve kuantum noktaları, sol-jel ve tavşan gözü kornealar derin batırılmış200 um), 2,3 nm yeri hassas elde edilebilir.

Tipik amaç tipi TIRFM kurulumu, Şekil 3 'de gösterilmiştir. İlk olarak, yüzey hareketsizleştirilmiş Cy3 DNA örneği görüntülenmiştir. Tipik bir görüntü Şekil 4a'da gösterilmektedir. Görüntü EM kazanç = 50 ve CCD hassasiyet = kamera için 12,13 ile, pozlama süresi ile 0.5 sn alınmıştır. Tek bir Cy3 ile DNA molekülünün bir nokta-yayılmış bir fonksiyonu (PSF) Şekil 4b'de gösterilmiştir renk çubuğu piksel yoğunluğunun ölçeğini göstermektedir (Şekil 4a'da ok i...

Tek flüoroforlar FIONA&#39;sı kullanarak nanometre hassasiyetle lokalize edilebilir. Burada FIONA tekniğin bir özet bilgi ve nasıl Fiona deneyleri tarif edilir.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

Bu prosedürün genel amacı, floresan görüntülemenin bir nanometre hassasiyetle veya Fiona deneyleriyle nasıl gerçekleştirileceğini göstermektir. Bu, önce gerekli ekipmanın kurulması ve optiklerin toplam iç yansıma, floresan, mikroskopi veya çim için hizalanmasıyla gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, CY 3D NA'yı bir numune odasının iç yüzeyinde hareketsiz hale getirmek ve CY 3D NA tek moleküllerini nanometre hassasiyetinde lokalize etmektir.Daha sonra, Fiona, bir kuantum noktası ile etiketlenmiş tek bir kesilmiş miyozin beşinin hareketini incelemek için uygulanır. Sonuçta, miyozinin yürürken adım boyutu, Acton Fiona analizi ile 36 nanometre olarak ölçüldü. Bu yöntem moleküler motorlar hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre zarı üzerindeki reseptörlerin izlenmesi gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Deneysel detayların öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Kurulum sırasında her zaman lazer koruyucu gözlük takmak önemlidir. Toplam iç yansıma, floresan, mikroskopi veya çim için.Başlamak için, tüm optik bileşenlerin yüksekliklerini mikroskobun merkezinin, arka bağlantı noktasının yüksekliğine ayarlayın, lazeri, lazer deklanşörünü ve ND filtrelerini monte edin. Işını görünür tutarken lazer gücünü mümkün olduğunca azaltmak için ND filtreleri kullanın. Vidaları uygun altıgen anahtarlarla sıkın.Noktalı mavi çizgilerle gösterildiği gibi bir ışın yolu planlayın. Bu şemada, ışın yolunu optik tabla üzerinde bant veya işaretleyici ile işaretleyin. Ayna M1'i ilk dik açılı dönüşe yerleştirin, iki süseni planlanan kiriş yolunun ikinci düz bölümü boyunca yerleştirin.M1'in hem konumunu hem de eğimini, lazer iris yer aynası M iki'den geçecek şekilde ayarlayın. İkinci dik açı dönüşünde, 10 x ışın genişleticiyi yolun üçüncü düz bölümü boyunca yerleştirin. Eğimini, ışın genişletici hem optik tablaya hem de planlanan ışın yoluna paralel olacak şekilde ayarlayın.Bir sonraki adım, M1 ve M'yi iki, lazer her iki merceğin merkezlerinden düz bir şekilde geçecek şekilde, ışın genişleticinin L bir ve L iki'sinden geçecek şekilde yinelemeli olarak ayarlamaktır. Işın profilini gözle kontrol etmek için ışın genişleticiden sonra ışını engellemek için bir parça beyaz kağıt kullanın. Genişletilmiş kirişin ışın profili ED olmayana kadar ayarlayın.Gauss, L bir ve L iki arasındaki mesafeyi, ışın harmanlanmış deklanşör olacak şekilde ayarlar. Lazer, mikroskop objektifini sökün ve bir floresan hizalaması vidalayın. Genleşmiş ışını mikroskop portuna ve dikroik aynaya yönlendirmek için hedef yer aynaları M üç ve M dört.Taretin içinde. Işının en parlak kısmını floresan hedef üzerinde ortalamak için M üç'ü ve ışının dikey olarak eğilmesini sağlamak için M dördü ayarlayın, lazeri kapatın ve hedefi tekrar vidalayın. İyi. Lazer gücünü ve objektiften ışın profilini optimize etmek için M üç ve M dört'ün eğimlerini ayarlayın.Bir E-M-C-C-D kamerayı mikroskoba monte edin ve kamerayı bir bilgisayara bağlayın. Kamera için yazılımı başlatın. Mikroskobun üzerine bir floresan numunesi monte edin.Kameradaki parlak floresan noktaya bakın. Odak değiştiği için ekranda noktanın kaymadığını kontrol edin. TIR merceğini, objektifin arka odak düzleminden odak uzaklığına, yaklaşık 30 santimetre olan L üçe eşit bir mesafeye XY, Z öteleme aşamasına yerleştirin.L üç'ün konumunu, lazer lensin merkezinden geçecek şekilde ayarlayın. Işın harmanlamasını ayarlamak için L üç'ü ışın yolu boyunca çevirin. Işının hala monitörde ortalandığından ve şekil olarak simetrik olduğundan emin olun.Işını objektiften dışarı eğmek için L üçünü ışın yoluna dik olarak çevirin. Bir Fiona gerçekleştirmeden önce TIR lensini TIR elde edilecek şekilde çevirmeye devam edin. CY 3D NA'yı yerelleştirme ve mobilize etme deneyi. Tek moleküller, protokol metninde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi numune odaları oluşturur.Kızağın üzerine uzun kenarlar boyunca iki şerit çift taraflı bant uygulanır, merkezde üç ila beş milimetre boşluk bırakılır ve daha sonra kaydırağın üstüne temizlenmiş bir kapak sürgüsü yerleştirilir, odanın sağdan ve önden yan görünümleri gösterilir. Haznenin açık uçları açık bırakılır ve numune haznesinin iç yüzeylerinde SI 3D NA'yı hareketsiz hale getirmek için giriş ve çıkış görevi görür. Hazneye 10 mikrolitre BSA biotin pipetleyin.Beş dakika bekleyin. Numune haznesine 40 mikrolitre T 50 BSA pipetleyerek yıkayın. Daha sonra hazneye 10 mikrolitre nötr travain pipetleyin ve beş dakika inkübe edin.Hazneyi 40 mikrolitre T 50 BSA pipet, 20 mikrolitre SI 3D NA ile numune haznesine tekrar yıkayın ve beş dakika inkübe edin. Son olarak, hazneyi 80 mikrolitre T 50 BSA ile yıkayın. Çim M altında SI 3D NA tek moleküllerini görüntüleme prosedürüne başlamak için, numune odasına 30 mikrolitre görüntüleme tamponu pipetleyin ve sekiz ila 10 dakika bekleyin.Numuneyi görüntüleme için yeşil bir lazer, 100 X yağa daldırma objektifi ve bir EMCD kamera ile donatılmış bir çim mikroskobuna monte edin. Pozlama süresini ve EM kazancını ayarlayın. 1000 kare için örneğin bir filmini alın.Fiona analizi için Fiona Pro'yu derleyin ve çalıştırın. Etkin piksel boyutunu ve yoğunluktan foton sayısına dönüştürme faktörünü girmek ve Fiona analizi için noktaları seçmek üzere elde edilen görüntüyü içe aktarmak için bu IDL programını kullanın. Sonunda, program, 2D Gauss fonksiyonlarının yanı sıra toplam foton sayıları ve lokalizasyon hassasiyeti ile montaj sonuçlarını çıkaracak ve pH sayımı pro'yu çalıştıracaktır.Foton sayısını karakterize etmek için, bir flora tarafından yayılan ortalama foton sayısını ölçmek için bu DL programını kullanın. Elde edilen görüntüyü içe aktarmak ve yoğunluktan foton sayısına dönüşüm faktörünü girmek için fotoğraf ağartmadan önce dört. Program floresan noktaları algılayacak, foton sayımlarını çerçeve numarasının bir fonksiyonu olarak otomatik olarak hesaplayacak ve foton sayımlarının izlerini çıkaracaktır.DD H2O'da mililitre başına bir miligramda 20 mikrolitre biyotinile BSA'yı bir numune haznesine pipetleyerek numuneyi bu deney için hazırlayın. 10 dakika inkübe edin. 30 mikrolitre D ddh, mililitre nötr travain başına 0.5 miligramda iki O pipet ile durulayın ve iki dakika inkübe edin.Hazneyi 30 mikrolitre M beş PSA ile yıkayın. Bu deney için acton, protokol metninde açıklandığı gibi bir önceki gün hazırlanmalıdır. Hazırlanan f aktini genel olarak 25 kez seyreltin, aktin tamponunu mililitre başına yaklaşık 0.004 miligramlık bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin.Aktin solüsyonunu hazneye pipetleyin ve 10 dakika bekleyin. Hazneyi 30 mikrolitre tamponla durulayın, miyozin beş A'yı bayrak etiketleriyle 30 oranında seyreltin. Bir M beş tamponu 250 nano molar nihai konsantrasyona katlayın.Bir mikrolitre seyreltilmiş miyozini bir mikrolitre Anti-Flag Q.Do 7 0 5 ile karıştırın. 10 mikrolitreye doldurmak için sekiz mikrolitre M beş ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.Miyozin Q nokta içeren 20 mikrolitre görüntüleme tamponunu numune haznesine pipetleyin. Sekiz ila 10 dakika kuluçkaya yatırın. Numuneyi çim mikroskobunda 30 milisaniyelik bir pozlamada görüntüleyin.Veri analizine başlamak için en az 1000 çerçeve edinin. Video dosyasını görüntü J'de açın ve videoyu hareketli bir nokta etrafında kırpın. Videonun her karesine Fiona analizi uygulayarak piksel cinsinden zaman içinde X ve Y koordinatları oluşturmak için videodaki noktayı takip edin.Pikselleri protokol metninde açıklandığı gibi nanometreye dönüştürün. Zamanın bir fonksiyonu olarak başlangıç konumundan yer değiştirmeyi hesaplayın. Miyozin yürüyüşünün adımlarını elde etmek için yer değiştirme üzerinde bir T-testi yapın.Adım boyutu sütunundan tüm sıfır değerlerini silin. Başlangıç veya matlab kullanarak adım boyutlarının dağılımını çizin. Histograma bir Gauss sığdırın.Bu tipik yüzey görüntüsünde SI 3D NA'yı hareketsiz hale getirin. Sarı ok, nokta yayılma fonksiyonu veya PSF'si burada gösterilen tek bir SI 3D NA molekülüne işaret eder. PSF, iki boyutlu bir Gauss fonksiyonu ile donatılmıştır ve montaj kalıntıları da gösterilmiştir. Bu grafik, kare sayısına karşı foton sayısının tipik bir izidir ve üstel uydurma, miyozin adım boyutunu ölçmek için yaklaşık 1.4 çarpı 10'a altıncı ortalama foton sayısını verir, tek bir miyozinin gürültüsüne iyi bir sinyale sahip bir video dosyası.Yürürken, bir aktin filamenti yakalanır. Üç örnek çerçeve gösterilmiştir. Fiona'nın her kareye uygulanması, kırmızı ile çizilmiş bir mesafeye karşı zaman izi verir.Tek tek adımları çıkarmak için T-testine dayalı bir adım bulma algoritması kullanılır ve çıktı beyaz Adım boyutları üzerine yerleştirilir ve nanometreler beyaz olarak etiketlenir. Birden fazla izden gelen adımlar bir histogramda birleştirildiğinde, ölçülen adım boyutları yaklaşık 35.8 artı veya eksi 0.4 nanometre Gauss dağılımındadır. Bu videoyu izledikten sonra, çim mikroskobu kurmak da dahil olmak üzere Fiona deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız En iyi sonuçları elde etmek için Bu prosedürlerle, zemin kuvveti kullanımına ve deneylere yönelik fotoğraf hasarını en aza indirmek önemlidir.Çim mikroskobu ve Fiona ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken koruyucu gözlük gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

fluorescence-imaging-with-one-nanometer-accuracy-fiona

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz elektron mikrograflarında fluoresan ışığı ile işaretlenmiş proteinler yerelleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Floresans ilk ince kesitler üzerinde fotoğraf ile aktive localisation mikroskopi kullanılarak yerelleştirilmiştir. Bu görüntüler daha sonra aynı bölümde elektron mikroskop ile hizalanır.

Nano-fem: Foto-aktif Yerelleştirme Mikroskobu ve Elektron Mikroskop Kullanarak Protein Yerelleştirme

Biz tek-molekül floresan görüntüleme için minimize hidrodinamik büyüklüğü ile kolloidal Kuantum noktalarının hazırlanması tarif. Konvansiyonel kuantum noktaları ile karşılaştırıldığında, bu nanopartiküller globüler proteinlerin boyut olarak benzer ve tek-molekül parlaklık, fotodegradasyon karşı kararlılık ve proteinleri ve hücreleri nonspesifik bağlanma direnci için optimize edilmiştir.

Tek molekül Görüntüleme için kompakt Kuantum Noktaları

Hücreler içinde birden fazla floresan etiketli molekül türünü aynı anda görüntülemek için floresan fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobunun (FPALM) kullanımını gösteriyoruz. Açıklanan teknikler, tek hücreler içinde onlarca nanometrelik bir hassasiyetle binlerce ila yüz binlerce ayrı floresan etiketli proteinin lokalizasyonunu sağlar.

Floresan Fotoaktivasyon Lokalizasyon Mikroskobu ile Biyolojik Yapıların Eş Zamanlı Çok Renkli Görüntülenmesi

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Biz yapışık memeli hücrelerinde aktin hücre iskeletinin görüntüleme, interferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi (iPALM), 3-boyutlu tek-molekül yerelleştirme süper çözünürlük mikroskopi yöntemi uygulaması için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım, aksi takdirde geleneksel kırınım sınırlı optik mikroskopi ile çözülmemiş kalacağını nano yapısal özellikleri ışık tabanlı görselleştirme sağlar.

Üç boyutlu Süper İnterferometrik photoactivated Yerelleştirme Mikroskopi F-aktin Filament Çözünürlük Mikroskobu (iPALM)

TIRF mikroskobu ile büyük verici-alıcı ağlardan smFRET verilerini elde etmek için kurulum ve deneysel prosedürü sunuyoruz. Bu ölçümlerin Bayes çıkarım yazılımı Fast-NPS ile adım adım analizi, uyarlanmış boya modellerinin uygulanması yoluyla yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler verir.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Bu metodoloji genel amacı en iyi deneysel koşullar numune hazırlama resim alma ve yeniden yapılanma için 2D çift renk dSTORM görüntülerini mikrotübüller ve ara filamentler sabit hücrelerde gerçekleştirmek için...

Ara filamentler ve mikrotübüller 2 boyutlu doğrudan Stokastik optik imar mikroskobu ile görüntüleme

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Bu iş akışı, kriyojenik üç tesadüfi görüntüleme platformu kullanarak küçük (eksenel kapsamda &lt;1 μm) ve nadir (hücre başına 1 kopya) floresan etiketli biyolojik yapıları hedefleyen lamel üretimini mümkün kılar. Bu platform, floresan mikroskobu, odaklanmış iyon ışını frezeleme ve taramalı elektron mikroskobunu tek bir odak konumunda birleştirir ve frezeleme sırasında eş zamanlı floresan mikroskobuna olanak tanır.

Hücrelerin Hedeflenen Frezelenmesi için Kriyojenik Tesadüfi Floresan, Elektron ve İyon Işını Mikroskobu Kullanan İş Akışı

Öğrenin, tek molekül lokalizasyonu için FIONA tekniğini; miyozin motorlarının 36 nanometrelik adım boyutunu yüksek hassasiyetle ölçerek hücresel süreçleri anlamanıza yardımcı olur.

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Daha fazla video keşfet