Name: Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster larvalarından hayali diskleri immünohistokimya için diseksiyon yöntemini. Bu teknik gen ve protein ekspresyonunu görselleştirerek gelişim biyolojisi çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz JPK orijinal hayali disk diseksiyonu işlemini öğretirken Donald hazır ve Kevin Musa&#39;yı teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, Şekil 1B genital disk ve Şekil 3 Şekil 2A Brandon Weasner, göz diski Bonnie Weasner ederiz, sinek lekelere Bloomington Drosophila Stok Merkezi ve antikor Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası. CMS Sağlık (NIH) GCMS Eğitim Grant National Institutes (T32-GM007757), Frank W. Putnam Araştırma Bursu ve Robert Briggs Araştırma Bursu bir nakit tarafından desteklenmiştir. JPK Ulusal Göz Enstitüsü bir hibe ile desteklenen (R01 EY014863)

Larva 1. Hazırlık <ol><li> Diseksiyon tamponu ile, bir 35 mm Petri kabı doldurun. </li><li> Petri kabındaki larva yerleştirin ve onları bir kaç dakika (kendi kendini temizleme adım) için etrafında yüzmek için izin verir. </li><li> Bir silikon bazlı diseksiyon plaka üzerinde diseksiyon tampon bir havuza larva transferi. Bu havuz, levhanın bir kenarına olmalıdır. Diseksiyon levha, cam bir Petri kabı içinde dökülmüş ve sertleştirilmiş olan bir silikon çözelti oluşur. </li><li> Bir pastör pipeti kullanılarak-, diseksiyon plaka ortasında tahlil tamponuna büyük bir havuz yerleştirin. </li><li> 5. forseps kullanarak, diseksiyon tampon büyük havuza küçük havuzda tek temizlenmiş larva transferi. </li></ol> Larva 2. Kaba Diseksiyon <ol><li> Larva diseksiyonu tampon büyük havuzun içinde hala ise forseps ile larva toka. Forseps ve diğer çift Anim tutmak için kullanılır ise forseps bir çift ağız kanca kapmak için kullanılmalıdırdiğerleri hala (1/3 vücut uzunlukta hafifçe larva kapmak). </li><li> Hızla forseps ikinci çifti ile uzak vücudun geri kalanını çekerken ağız kanca yakın manikür içeren forseps çifti sakinleştirmeye tutun. </li><li> Larva parçalıyorlar başlar zaman gerginlik hafif bir serbest hissedeceksiniz. Forseps larva bırakın ve dışarı dökmek için larva &quot;cesaret&quot; için izin verir. Bu, normal konformasyonda kalması için hayali diskler sağlar ve deforme edilmesini engeller. </li><li> Forseps bir çift ile yerde larva ön ucunu tutmak için tekrar ağız kanca kavramak. Forseps kullanılarak diğer çift de dahil olmak üzere, iç bağırsakta larvaların 2/3 alt çıkarın. Not: ağız kancaları, göz antennal diskleri, beyin hemisfer, ventral ganglion, tükürük bezleri, bazı bacak diskler içeren karmaşık ve örten manikür kalacaktır. </li><li> Forseps bir çift ile hafifçe örten manikür, tükürük bezleri, bacak diskleri ve kaldırmakdiğer doku. Not: Yalnızca ağız kancalar, göz antennal diskler, beyin hemisfer ise kalmalıdır doku ve ventral ganglion (Şekil 3). </li><li> Tekrar 15-20 dakika için ek larva ile 2,1-2,5 adımları. Not: uzun süre için diseksiyon tampon kalır hayali diskler aşağılamak eğilimindedir ve sonuçta çektirmek için ideal bir numunelere göre daha az gibi görünecektir. Böylece, tüm kesilmiş dokuları PLP sabitleyici aktarılması gerekmektedir 20 dakika sonrasında en (aşağıya bakınız). </li></ol> Antikorlar ile 3. Fiksasyon ve Doku Boyama <ol><li> P-200 Pipetman kullanarak, soğuk Paraformaldehit-Lizin-Periyodat (HUA) fiksatif içeren bir saat cam disseke dokuların aktarın. 50 ul transfer diseksiyon tampon sınırı hacmi PLP&#39;nin seyreltme en aza indirmek için. Ucu açılma disseke dokuları barındıracak kadar büyük olduğunu böylece bir jilet ile ucu kesmek için emin olun. Bir çift forseps kullanılması veyatungsten iğne disseke dokuların tamamen doğru tespit gerçekleşmesi için batık emin olun. 45 dakika boyunca soğuk HUA sabitleyici disseke dokuları inkübe edin. Bu inkübasyon ajitasyon olmadan oda ısısında gerçekleşebilir. </li><li> P-200 Pipetman kullanarak, 45 dakika boyunca bir kesim sarı ucu kullanılarak yıkama tamponu (RT) kesilmiş dokuları aktarın. 50 ul transfer PLP sınırı hacim yıkama tamponu ile seyreltme en aza indirir. Not: Tüm disseke dokuların tamamen sular altında olmalıdır. </li><li> 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp disseke doku 20-30 setleri aktarın. Not: Göz antennal disk kompleksleri daha çok sayıda boru içinde karıştırılması durumunda, borunun altındaki doku antikorlara uygun maruz kalmayacak bir olasılığı vardır. Optimal sonuçlar için fazla 20-30 göz antennal disk kompleksleri tek bir tüp içinde mevcut olmalıdır. Disseke doku mikrofuge&#39;ye tüpün dibine çökecektir. Bu yüzden, daha sonraki adımlar uçıkarın ve yıkama tamponu engelleme çözeltisi ve antikor yerine bir Pipetman se. </li><li> Yıkama tamponunu çıkarın ve bloklama çözeltisi 100 ul ile değiştirin: yıkama tamponu içinde% 10 normal keçi serumu. 10 dakika boyunca masa üstü bir karıştırıcı üzerine hafif bir döndürme ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Bloke çözeltisini çıkarın ve uygun bir şekilde,% 10 normal keçi serumu içinde seyreltilmiş olan birincil antikor 100 ul ile değiştirin. 16 saat süre ile hafif bir dönme ile oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Primer antikor çıkarın ve yıkama tamponu 750 ul ile değiştirin. Bir nutator tüpleri ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında nutate sağlar. Not: primer antikor (4 ° C&#39;de mağaza) kaydedilir ve daha sonra yeniden kullanılabilir. Antikorlardır birden çok kez yeniden kullanma spesifik olmayan bağlanma azaltılmasında yardımcı olabilir. </li><li> Kafaları, daha sonra borunun dibe yıkama tamponunu çıkarın ve uygun bir şekilde,% 10 normal serum içinde seyreltilmiş olan ikincil antikor, 100 ul ilave izin verin. Yumuşak devir için RT&#39;de inkübe 2̵1, 4 sa. </li><li> Dokudan ikincil antikor çözüm çıkarın ve yıkama tamponu ile 500 ul ile değiştirin. Doku tüpün dibine çökme eğilimi göstermesine izin verin. </li><li> P-200 ve bir kesme sarı ucu kullanarak, kesme tabağına yerleştirilmiş olan yıkama tamponu ile bir havuza tüm parçalara dokuları aktarın. Ince diseksiyon sonraki adıma geçmeden ederken, doku yıkama tamponunda inkübe olacak. Bu aşırı ikincil antikorlar kaldırmak için yardımcı olur. </li></ol> 4. Göz-Antennal Disk Kompleksleri Güzel Diseksiyon ve Slaytlar üzerine Montaj <ol><li> Aşağı bakacak kompleksinin ventral yüzü ile ağız kanca tarafından manikür kavrayabilirdim için forseps bir çift kullanın. Forseps ikinci bir çift göz ve beyin diskler arasındaki boşlukta (Şekil 3, kırmızı ok) ikinci forseps kapanış ve hızla ağzına kanca uzak beyin çekerek iki beyin lobu çıkarın. </li><li> Ağız kanca tutunmaya devam ederken, çimdikgöz antennal diskin antennal bölümü ile ağız kanca (Şekil 3, mavi ok) arasındaki bağlantının mümkün olduğu kadar yakın bir doku. Not: göz antennal disk kompleksleri tüm doku (Şekil 1A) ücretsiz olmalıdır. Slaytlar üzerine yerleştirilebilir istenen istenen tüm doku disseke olmuştur kadar devam edin. Bu protokol, kanat, haltere, bacak ve genital hayali diskleri (Şekil 1B-D) izole etmek için adapte edilebilir. </li><li> Kağıt mendil iki küçük parça (lamelleri boyut) yaklaşık 3 ekleyin. Ayrı diseksiyon çanak. Kabı üzerine bir cam slayt yerleştirin - ince kağıdın iki adet sürgünün uçları altında olmalıdır. Bu kesme çanak silikon tabanına yapışmasını slayt önleyecektir. </li><li> Kesilmemiş bir ucu olan bir P-20 kullanılarak cam mikroskop slayt ortasına da bir ağartma karşıtı maddenin 9 ul ekleyin. Floresan ile bakıldığında bu dokunun ağartma önlerışık. </li><li> Aynı kesilmemiş ucu kullanarak, tüm göz-antennal diskleri toplamak ve anti-ağartma reaktif damla ekleyebilirsiniz. Işlemine tabi tutulan, yıkama tampon miktarını en aza indirir. 10 ul veya daha az yıkama tampon miktarını sınırlamaya çalışın. </li><li> Ayırmak ve anti-ağartma reaktif damla içindeki göz antennal diskleri yaymak için bir çift forseps kullanın. Diskler birçok dakika için ağartma karşıtı ayraç inkübe izin verin. Not: doku ağartma karşıtı ayraç emdiğinde diskler berrak dönecek. </li><li> Ince bir fırça kullanarak hafifçe numune üzerine bir lamel indirin. Bu hava kabarcıklarının oluşumunu engeller. </li><li> Mağaza ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak göz antennal veya başka bir hayali diskleri görüntülemek için hazır olana kadar -20 ° C&#39;de kayar. </li></ol>

<ol><li>Weismann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+nachembryonale+entwicklung+der+Musciden+nach+beobachtungen+an+Musca+vomitoria+und+Sarcophaga+carnaria%5BTitle%5D)+AND+%22Zeit.+Wiss.+Zool%22%5BJournal%5D)">Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria.</a> Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.</li>
<li>Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+SM+%22Imaginal+disc+development%22">Imaginal disc development</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).</li>
<li>Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeld%2C+LI+%22Developmental+and+Cell+Biology+Series%22">Developmental and Cell Biology Series</a>. 39, Cambridge Press. 460(2002).</li>
<li>Miall, L. C., Hammond, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+head+of+the+imago+of+Chironomus%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+Linn.+Soc.+Zool%22%5BJournal%5D)">The development of the head of the imago of Chironomus.</a> Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.</li>
<li>Kellog, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+homologies+of+the+mouth+parts+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The development and homologies of the mouth parts of insects.</a> Am. Nat. 36, 683-706 (1902).</li>
<li>Eassa, Y. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+imaginal+buds+in+the+head+of+Pieris+brassicae+Linn.+%28Lepidoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Entomol.+Soc.+Lond%22%5BJournal%5D)">The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera).</a> Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).</li>
<li>Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage%2C+growth%2C+and+determination+in+the+imaginal+leg+discs+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).</li>
<li>Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+analysis+of+development+in+Drosophila+melanogaster%3A+morphogenesis%2C+determination+and+growth+in+the+wild+type+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna.</a> Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).</li>
<li>Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Developmental+Systems%22">Developmental Systems</a>. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).</li>
<li>Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+polyclones+in+insect+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Compartments and polyclones in insect development.</a> Science. 189, 340-347 (1975).</li>
<li>Wieschaus, E., Gehring, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+primordial+disc+cells+in+the+early+embryo+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).</li>
<li>Lawrence, P. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+development+of+mesothoracic+compartments+in+Drosophila.+An+analysis+of+cell+lineage+and+fate+mapping+and+an+assessment+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods.</a> Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).</li>
<li>Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+the+dynamics+of+growth+of+imaginal+discs+and+histoblast+nests+during+the+larval+development+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux+Archive%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster.</a> Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+determination+the+beginning+of+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinal determination the beginning of eye development.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((My+what+big+eyes+you+have%3A+how+the+Drosophila+retina+grows%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows.</a> Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59, 499-509 (1989).</li>
<li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li>
<li>Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+loci+required+for+follicular+patterning+using+directed+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics.</a> Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TGF+beta+homolog+dpp+and+the+segment+polarity+gene+hedgehog+are+required+for+propagation+of+a+morphogenetic+wave+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina.</a> Cell. 75, 913-926 (1993).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+segment+polarity+gene+hedgehog+is+required+for+progression+of+the+morphogenetic+furrow+in+the+developing+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye.</a> Cell. 75, 927-938 (1993).</li>
<li>Heberlein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+in+the+Drosophila+eye+coordinated+by+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog.</a> Nature. 373, 709-711 (1995).</li>
<li>Dominguez, M., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+directly+controls+initiation+and+propagation+of+retinal+differentiation+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye.</a> Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).</li>
<li>Pignoni, F., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Drosophila+eye+development+by+Decapentaplegic%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic.</a> Development. 124, 271-278 (1997).</li>
<li>Borod, E. R., Heberlein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutual+regulation+of+decapentaplegic+and+hedgehog+during+the+initiation+of+differentiation+in+the+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina.</a> Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).</li>
<li>Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern-specific+expression+of+the+Drosophila+decapentaplegic+gene+in+imaginal+disks+is+regulated+by+3%27+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements.</a> Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).</li>
<li>Blackman, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+3%27+cis-regulatory+region+directs+the+imaginal+disk+expression+of+decapentaplegic%2C+a+member+of+the+TGF-b+family+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila.</a> Development. 111, 657-665 (1991).</li>
<li>Campos, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+the+locus+elav+in+Drosophila+melanogaster%3A+a+gene+whose+embryonic+expression+is+neural+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific.</a> Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).</li>
<li>Robinow, S., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+locus+elav+of+Drosophila+melanogaster+is+expressed+in+neurons+at+all+developmental+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages.</a> Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).</li>
<li>Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeo+domain+protein+rough+is+expressed+in+a+subset+of+cells+in+the+developing+Drosophila+eye+where+it+can+specify+photoreceptor+cell+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype.</a> Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).</li>
<li>Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atonal%2C+rough+and+the+resolution+of+proneural+clusters+in+the+developing+Drosophila+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina.</a> Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).</li>
<li>Kumar, J. P., Moses, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+Receptor+and+Notch+signaling+act+upstream+of+Eyeless%2FPax6+to+control+eye+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification.</a> Cell. 104, 687-697 (2001).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu prosedür, büyük ölçüde izole edilmesi ve göz antennal diskler daha ilerideki muamelesi odaklanmış olmakla beraber, bu izole etmek ve kanat, haltere, bacak ve genital diskleri (Şekil 4) analiz etmek için kullanılan elverişlidir. (Göz antennal diske karşı), bu diskleri izole edilmesi için protokol tek gerekli modifikasyon kaba Diseksiyon (protokol, Bölüm 2) &#39;nin bir yöntemdir. İlk göğüs ayağı (T1), bir çift larva anterior bulunur ve göz antennal disk izolasyonu için protokol takip edilerek elde edi...

Yüzyılı aşkın bir meyve sineği Drosophila melanogaster için, geliştirme, davranış ve fizyolojisini incelemek için önde gelen bir sistem olmuştur. Ikincisi alma yere kadar olan embriyonik ve post-embriyonik tek tabaka epitellerinden içinde hayali diskler 1-3 seslendi: sinek Kalkınma iki geniş aşamadan ayrılabilir. Hayali diskler çizimleri ilk böcek gelişimine 1 onun geniş monografi parçası olarak Ağustos Weismann tarafından 1864 yılında yayımlandı. Bu diskler 1-14 yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açan nihai olarak ilk pupa safhalarının yoğun doku çözülmesi hayatta ve larva aşamalarında desenli embriyojenez sırasında gelişme başlar. Larva gelişimi sırasında her bir disk kaderi, şekli ve büyüklüğü ile ilgili pek çok kritik kararlar alır. Birinci ve ikinci larva instars içinde, diskler, birincil kaderi benimseyerek establis görevliDoğru şekli alarak ve hücrelerin 15-16 arasında gerekli sayıda üretilmesi, bölme sınırları hing. Üçüncü larva ve erken pre-pupa aşamasında, hayali diskler bölünmeye devam ve hücreleri terminali kaderlerini 16 evlat gibi desenli. Drosophila gelişimsel biyoloji erken tarih boyunca, hayali diskler normal gelişim bağlamında ve bir kazanç ya da kayıp fonksiyon-mutant canlı olduğu hangi sınırlı durumlarda neredeyse sadece çalışıldı. X-ışınlarının kullanımı ölümcül mutasyonlar izin mitotik rekombinasyon larva ve yetişkin dokularda hücre klonlarının analiz edilecek ikna etmek. Bu yöntem larva ve yetişkin dokularda hem de mutasyonlar kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-transgenik yöntemler giriş tarafından geliştirilmiştir. Vahşi tipli ve mutant Dokuların moleküller manzara tanımlamak için antikorlar, transkripsiyonel raportörler, ve protein tuzaklar sayısı da const &#39;tırantly büyüyen. Mutant hücre klonları kaybını analiz etmek ve kazanç fonksiyon-bu moleküler işaretlerini kullanarak giderek mümkün mutant hücreler gelişim sırasında, kendi vahşi tip kuzenleri sapan nasıl bir gerçek zamanlı anlayış kazanmak için yaptı. Doğru bu araçları ve reaktiflerin yararlanmak için bu inceledi fotoğraflandı ve analiz edilebilir hayali diskler yüksek kaliteli hazırlıklarını kritik öneme sahiptir. Bu yazının amacı göz antennal diski kompleksinin (Şekil 1A) &#39;nin izolasyonu ve hazırlanması için optimize edilmiş bir protokol sağlamaktır. Ayrıca, başarılı bir şekilde kanatlar, halteres, T1-T3 bacak ve cinsel organların (Şekil 1B-D) yol da dahil olmak üzere ek disklerin çok çeşitli izole etmek için kullanılabilir. Minör modifikasyonlarla bu prosedür, yaklaşık seksen yıldır Drosophila &#39;dan gelen hayali diskleri izole etmek için kullanılmıştır. En genler mu sırasında ifade edildiği gibi, yukarıda tarif edilengelişme ve dokuların çok sayıda aşamaları ltiple, bu hayvan Üçüncü dönem larva aşamasından önce ölür null mutantlar tüm göz olması etkilerini incelemek imkansızdır. Dört yöntemler, önemli ölçüde daha uysal retina gibi daha gelişmiş dokuların çalışma yaptık. Birinci bir başka vahşi tip doku 17-19 olan mutant hücre klonları jenere arasında Flippase (FLP) / Flippase rekombinasyonu hedeflemek (STT) yöntemidir. Bu durumda, mutasyona uğramış doku, yeşil flüoresan protein (GFP) gibi bir görsel işaretin olmaması ile tanımlanır ve GFP mevcut olduğu çevre vahşi tip doku (Şekil 2B) mukayese edilebilir. İkinci bir transgen hücrelerinin 20 bir popülasyonunda ifade edildiği &quot;Flp üzerinden&quot; yöntemidir. Bu durumda, hücre klonları, GFP raportör yoksun çevresindeki yabani tip doku (Şekil GFP varlığı ile tanımlanan ve karşılaştırılmıştır2E). Üçüncü FLP / FRT mutant klon ve bdp-dışarı ekspresyon sistemleri 21 unsurlarını birleştiren bir Baskılanabilir Hücre Marker (MARCM) tekniği ile Mozaik Analizi&#39;dir. Bu yöntem ile, bir transgen, aynı anda tek bir genetik lokus için mutant bir hücre popülasyonu içinde ifade edilebilir. Flp üzerinden klonları gibi, klonlar MARCM GFP varlığı ile tanımlanan ve GFP işaretleyici (Şekil 2F) yoksun çevreleyen vahşi tip doku ile karşılaştırılır. Ve son olarak, genler ve RNAi yapıları, GAL4 spesifik promotör-yapılarının kontrol altında hayali dokularda ifade edilebilir. Mutant veya aşırı ifadesi ya da klonlar desenler doğrudan bitişik vahşi tip dokuya göre olabilir çünkü Bu dört yöntem hayali diskleri okuyan ilgiyi artırmıştır. Bu prosedürde açıklanan gibi bir yöntem geliştirilmiştir ve böylece Drosophila yetişkin dokuların sonrası embriyo gelişimini çalışan araştırmacılar,Özellikle göz-antennal diskten türetilenler, analiz için yüksek kaliteli doku elde etmek mümkün olacaktır. Bireysel araştırmacılar küçük değişiklikler yapmış olsa da, bu prosedüre (biz burada açıklamak olan) çekirdek büyük ölçüde değişmeden kalmıştır. Yüksek kaliteli dokusu elde biz bu yazılı bir protokol ve beraberindeki görüntü değerli bir öğretim kaynağı olarak hizmet umuyoruz hayali disklerin çalışmaya kritik olduğundan.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KİTİ 0.5 KG</td><td>Diseksiyon plakası için taban oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Pryex Cam Petri Kabı 150 x 20 mm</td><td>Dow Corning</td><td>3160-152CO</td><td>Diseksiyon plakası # 5 için kapağı kullanın</td></tr> <tr><td>Diseksiyon Forseps</td><td>Ted Pella</td><td>525</td><td>Forseps çok keskin tutulmalıdır</td></tr><tr><td>9 kuyu izleme camı</td><td>Vairous Satıcıları</td><td></td><td>Hayali disk komplekslerinin sabitlenmesi için kullanılır</td></tr><tr><td>50 ml Erlenmeyer Şişesi</td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük Karıştırma Çubuğu</td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td></td><td>Erlenmeyer Şişesine sığacak kadar küçük</td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüpler</td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Mikrofüj Tüpleri</td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td></td><td>Uygulamaya bağlı olarak Açık veya Koyu</td></tr><tr><td>Mikrofüj Rafı</td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Döndürücü</td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td></td><td>100 & # 956; l hacim düşük ayarda sıçramamalıdır</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Macron Chemicals</td><td>2-26555-1</td><td>Sabitleyici olarak hizmet eder</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-3139</td><td>Diseksiyon ve yıkama tamponları yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>71636</td><td>Diseksiyon yapmak ve tamponları yıkamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organics</td><td>125221000</td><td>Fiksatif çözeltide kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum Periodat</td><td>Sigma Chemical Co</td><td>S-1878</td><td>Fiksatif çözeltide kullanılır</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Kimyasallar</td><td>MTX1568-1</td><td>Hayali diskleri delmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit</td><td>EM Science</td><td>SX0593-3</td><td>Paraformaldehiti çözmek için kullanılır</td></tr><tr><td>%100 Normal Keçi Serumu</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>005-000-121</td><td>Bloke edici bir çözüm olarak hizmet eder</td></tr><tr><td>Birincil Antikorlar</td><td></td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td>Üretici tarafından yönlendirildiği şekilde %10 keçi serumu içinde seyreltin</td></tr><tr><td>İkincil Antikorlar</td><td></td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td>Üretici Vectashield tarafından yönlendirildiği şekilde %10 keçi serumu içinde seyreltin</td></tr><tr><td></td><td>Moleküler Problar</td><td>H-1000</td><td>Numunelerin ağartılmasını önler</td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Fischer Scientific</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kapak Astarları 18 x 18 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-542A</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe Mendil</td><td>Çeşitli Satıcılar Cam slaytların</td><td></td><td>silikon tabana yapışmasını önler</td></tr><tr><td>Panit Fırça 000</td><td>Çeşitli Satıcılar</td><td></td><td>Lameli numunelere nazikçe indirmek için kullanın</td></tr></tbody></table>

diseksiyon ve hayali disklerin immün itibaren drosophila melanogaster

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

Post-embriyonik meyve sineğinin gelişimi, Drosophila melanogaster önemli bir kısmı, hayali olarak adlandırılan diskler kese gibi yapıların bir dizi içinde yer alır. Bu diskler, yetişkin sinek içinde bulunan ergin yapılara yüksek bir yüzdesine yol açar. Burada bu diskleri kurtarmak ve antikorlar, transkripsiyon gazetecilere ve protein tuzakları ile analiz için onları hazırlamak için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu işlem en iyi hayali diskler gibi ince dokular için uygundur, ancak kolay gibi, larva ve yetişkin beyin yumurtalık kalın dokuları ile kullanılmak üzere modifiye edilebilir. Yazılı bir protokol ve beraberindeki Video üçüncü larva, doku fiksasyonu ve antikorlar ile hayali diskler tedavisi diseksiyon ile okuyucu / izleyiciye rehberlik edecektir. Protokol da daha küçük olan, birinci ve ikinci instar larvalarından hayali diskleri incelemek için kullanılabilir. Bu protokolün avantajı nispeten kısa olduğunu ve olması vardırdisseke doku yüksek kalite korunması için optimize tr. Diğer bir avantaj kullanıldığı sabitleme işlemi, Drosophila proteinleri tanıyan antikorların ezici sayı ile çalışır. Bizim tecrübelerimize göre, bu prosedürü ile iyi çalışmaz duyarlı antikorların çok küçük bir sayı vardır. Bu durumlarda, çare biz diseksiyon adımlar ve antikor inkübasyonlarının için belirlenen adres yönergeleri takip devam ederken alternatif bir sabitleme kokteyl kullanmak gibi görünüyor.

Güvenilir bir şekilde yukarıda tarif edildiği gibi bir yöntem, in situ probları, transkripsiyonel raportörler, protein tuzakları ve antikorlarda analiz için yüksek kaliteli malzeme üretmektedir. Şekil 1 de rutin olarak bu yöntemle iyileşti göz anteni, genital, kanat, haltere ve bacak diskleri görüntüler. Bu diskler, F-aktine bağlanan ve bu nedenle de her bir hücreyi ortaya koyan bir falloidin-konjüge edilmiş fluorophore ile tedavi edilmiştir. Doku daha sonra düzgün bir göz diskin morfo...

Drosophila'nın yetişkin yapıları, hayali diskler adı verilen kese benzeri yapılardan türetilmiştir. Bu disklerin analizi, doku tayini, kompartman sınırı oluşturma, hücre proliferasyonu, hücre kaderi spesifikasyonu ve düzlemsel hücre polaritesi dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreç hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, ışık/floresan mikroskobu için hayali diskleri hazırlamak için kullanılır.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Bu prosedürün genel amacı, drosophila larvalarından hayali diskleri incelemektir İmmünohistokimya için bu, önce larvalardan ağız, kancalar, göz ve tenal diskler ve beyinden oluşan kafa kompleksinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kafa kompleksini sabitlemek ve onu birincil ve ikincil antikorlarla inkübe etmektir. Daha sonra, göz ve tenal diskler kafa kompleksinden ayrılır.Son adım, hayali diskleri ağartma önleyici madde içinde bir cam slayt üzerine monte etmektir. Sonuç olarak, floresan veya LAC Z raportörleri ve antikor boyama, floresan mikroskobu kullanarak hayali dokulardaki genlerin ve proteinlerin uzamsal ve zamansal ekspresyonunu ortaya çıkarabilir. Bu teknik, enten hayali diskteki gen ve protein lokalizasyonu hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir.Kanat, bacak ve durma gibi diğer hayali dokulara da uygulanabilir. Burada. Deneye başlamak için, 35 milimetrelik bir Petri kabını diseksiyon tamponu ile doldurun. Petri kabına 10 ila 20 larva yerleştirin ve beş dakika boyunca yüzmelerine izin verin.Bir haşere ile kendi kendini temizlemek için, pipetiniz silikon bazlı bir diseksiyon plakasının ortasında büyük bir diseksiyon tamponu havuzu oluşturur. Büyük havuzu ç

dissection-immunostaining-imaginal-discs-from-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, 3. instar aşamada Drosophila larvaları hayali diskler izole etmek için kullanılan diseksiyon tekniği göstermektedir. Söyleyerek sonra doku sabitleme ve kanat, bacak ve göz diskleri çıkarmadan Yöntemleri sonraki görünüm için doğrudan bir mikroskop lamı üzerine göstermiştir.

3. Instar Drosophila Larva hayali Disklerin Diseksiyon

Biz özellikle ifade edilir bir roman kırmızı floresan proteini (RFP) muhabiri...

Göz hayali Disk Görselleştirme Yardım Roman RFP Reporter Drosophila</em

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Larva, Pupa ve Erişkin diseksiyonu ve İmmünohistokimya<em&gt; Drosophila</em&gt; Retinaları

Drosophila hayali diskleri boyanırken, genellikle disklerin açıkta kaldığı ancak vücuda bağlı kaldığı kaba bir diseksiyon yapılır. Lekelendikten sonra, ilgilenilen diskler izole edilir ve monte edilir. Örnek protokol, kanat hayali disk diseksiyonu ve montajı için bir prosedürü göstermektedir.

Drosophila Larva Hayali Disk Diseksiyonu: Gelişmekte Olan Epiteli Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Bu tekniğin amacı, araştırmacıların herhangi bir yaştaki Drosophila melanogaster'den pupa göz disklerinin diseksiyonunu, immün boyama ve montajını gerçekleştirmelerini sağlamaktır.

Diseksiyon ve montajı<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Göz Diskler

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Canlı Drosophila kanadı hayali disklerindeki bitişik epitel tabakalarındaki hücreler arasındaki temasları GFP sulandırma tabanlı bir yaklaşım kullanarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Bu makale, reaktiflerle ekonomik olan ve az sayıda hayali disklerin işlenmesini kolaylaştıran verimli bir imaginal disk diseksiyon ve antikor boyama protokolünü tanımlar.

Drosophila melanogaster'den Göz-Antenli ve Kanat Hayali Disklerinin Küçük Ölçekli Diseksiyonu ve Antikor Boyama

Öğrenin Drosophila melanogaster larvalarından hayali diskleri immünohistokimya için diseksiyon yöntemini. Bu teknik gen ve protein ekspresyonunu görselleştirerek gelişim biyolojisi çalışmalarına katkı sağlar.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Daha fazla video keşfet