Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Bu prosedürün genel amacı, drosophila larvalarından hayali diskleri incelemektir İmmünohistokimya için bu, önce larvalardan ağız, kancalar, göz ve tenal diskler ve beyinden oluşan kafa kompleksinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, kafa kompleksini sabitlemek ve onu birincil ve ikincil antikorlarla inkübe etmektir. Daha sonra, göz ve tenal diskler kafa kompleksinden ayrılır.

Son adım, hayali diskleri ağartma önleyici madde içinde bir cam slayt üzerine monte etmektir. Sonuç olarak, floresan veya LAC Z raportörleri ve antikor boyama, floresan mikroskobu kullanarak hayali dokulardaki genlerin ve proteinlerin uzamsal ve zamansal ekspresyonunu ortaya çıkarabilir. Bu teknik, enten hayali diskteki gen ve protein lokalizasyonu hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilir.

Kanat, bacak ve durma gibi diğer hayali dokulara da uygulanabilir. Burada. Deneye başlamak için, 35 milimetrelik bir Petri kabını diseksiyon tamponu ile doldurun. Petri kabına 10 ila 20 larva yerleştirin ve beş dakika boyunca yüzmelerine izin verin.

Bir haşere ile kendi kendini temizlemek için, pipetiniz silikon bazlı bir diseksiyon plakasının ortasında büyük bir diseksiyon tamponu havuzu oluşturur. Büyük havuzu çevreleyen üç küçük havuz yerleştirin ve larvaları alt havuza aktarmak için forseps kullanın. Daha sonra, beş numaralı forseps kullanarak, temizlenmiş tek bir larvayı küçük havuzdan daha büyük diseksiyon tamponu havuzuna aktarın.

Kaba diseksiyona başlamak için, ağız kancalarını tutmak için bir çift forseps ve larvaları nazikçe tutmak için diğer forseps çiftini kullanın. Vücut uzunluğunun üçte birinde, ağız kancasını sabit tutar. Vücudun geri kalanını ikinci bir forseps çifti ile hızla çekin.

Larvaları forsepsten serbest bırakın ve bağırsakların dökülmesine izin verin, bu da hayali disklerin normal onaylarında kalmasını sağlar. Daha sonra ağız kancalarını kavrayın ve iç bağırsaklar da dahil olmak üzere larvaların alt üçte ikisini çıkarmak için diğer forseps çiftini kullanın. Ardından, tükürük bezlerini, bacak disklerini ve diğer dokuları nazikçe çıkarın.

Kalması gereken tek doku, az miktarda üstteki kütiküldür. Ağız kancaları, göz ve tenal diskler, beyin yarım küreleri ve ventral ganglion. En fazla 20 dakika sonra, diseke edilen tüm dokuları paraform aldehit lizin paryasına aktarın.

Tarih sabitleyici veya PLP. Hayali disklerin diseksiyon tamponunda 20 dakikadan daha uzun süre kalmasına izin vermeyin, aksi takdirde diseksiyondan sonra bozulurlar. Diseke edilen dokuları 100 mikrolitrelik artışlarla soğuk PLP içeren bir saat camına aktarın.

Diseke edilen dokuların tamamen suya batırıldığından emin olmak için bir çift forseps kullanın. Disseke edilmiş dokuları soğuk PLP fiksatifinde çalkalama olmadan oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin. Daha sonra, 100 mikrolitre disseke edilmiş dokuyu PLP'den yıkama tamponuna aktarın.

Dokuların tamamen suya batırıldığından emin olun ve 45 dakika boyunca çalkalamadan oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra diseke edilen dokuları 1.5 mililitrelik bir mikro füj tüpüne aktarın. Yıkama tamponunu çıkarın ve 100 mikrolitre bloke edici solüsyonla değiştirin.

Dokuları oda sıcaklığında, bir masa üstü döndürücü üzerinde 10 dakika boyunca hafifçe döndürerek inkübe edin. Bloke ettikten sonra, çözeltiyi çıkarın ve% 10 Normal keçi serumunda 100 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ile değiştirin. Antikorun gücüne bağlı olarak dokuları oda sıcaklığında 16 saat boyunca hafif rotasyonla inkübe edin.

Ardından, birincil antikoru çıkarın ve 750 mikrolitre yıkama tamponu ile değiştirin. Tüpü 10 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mutatör üzerine yerleştirin. Tüpü mutatörden çıkarın ve kafaların tüpün dibine çökmesine izin verin.

Daha sonra yıkama tamponunu çıkarın ve% 10 Normal serumda 100 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ekleyin. Tüpü, antikorun gücüne bağlı olarak en az iki saat boyunca hafif bir rotasyonla oda sıcaklığında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ikincil antikor çözeltisini dokudan çıkarın.

500 mikrolitre yıkama tamponu ile değiştirin ve dokunun tüpün dibine çökmesine izin verin. Bir silikon diseksiyon plakasına üç havuz yıkama tamponu yerleştirin. Diseke edilen tüm dokuları, diseksiyon kabına yerleştirilmiş olan büyük yıkama tamponu havuzuna aktarın.

Bu, ince diseksiyona başlamak için fazla ikincil antikorların çıkarılmasına, baş kompleksinin ventral tarafı aşağı gelecek şekilde yerleştirilmesine ve kütikülün ağız kancaları ile sıkıştırılmasına yardımcı olur. Beyin ve göz diskleri arasındaki boşluğa ikinci bir forseps çifti yerleştirin ve ağız kancalarını tutmaya devam ederken iki beyin lobunu çıkarmak için beyni hızla ağız kancalarından uzaklaştırın. Dokuyu, göz anten diskinin anten bölümü ile ağız kancası arasındaki bağlantıya mümkün olduğunca yakın bir şekilde sıkıştırın.

İstenilen tüm doku diseke edilene kadar devam edin. Ardından, diseksiyon kabının üzerine üç inç aralıklarla kapak kaymaları boyutunda iki küçük kağıt mendil parçası ekleyin. Sürgünün diseksiyon kabının silikon tabanına yapışmasını önlemek için bu kağıt parçalarının üzerine bir cam slayt yerleştirin.

Bir P 20 pipet kullanarak, aynı kesilmemiş uçla dokunun floresan ışığında ağartılmasını önlemek için cam mikroskop lamının ortasına dokuz mikrolitre ağartma önleyici madde ekleyin, tüm I ve tenal diskleri toplayın ve bunları ağartma önleyici reaktif damlasına ekleyin. Daha sonra, hiçbir hayali disk dokunmayana kadar göz ve tenal diskleri bir damla ağartma önleyici reaktif içinde ayırmak ve yaymak için forseps kullanın. İnce bir boya fırçası kullanarak, hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için bir kapak astarını ağartma önleyici maddenin üzerine nazikçe indirin.

Son olarak, ışık veya floresan mikroskobu kullanarak iyon tenal diskleri görüntülemeye ve görüntülemeye hazır olana kadar slaytları eksi 20 santigrat derecede saklayın. Bu yöntem, hayali disklerin bu konfokal görüntüleri tarafından iletilen analiz için güvenilir bir şekilde yüksek kaliteli malzeme üretir. Diskler, f aktine bağlanan ve bu nedenle her hücreyi ana hatlarıyla belirleyen foid ve konjuge bir floro dörtlü ile muamele edildi.

Ental diskin en çarpıcı özelliklerinden biri, dorsal ventral eksen boyunca uzanan doku içinde bir girinti olarak görülebilen morfogenetik oluktur. Karık göz alanı boyunca ilerledikçe, düzensiz hücreler denizi, periyodik aralıklarla yerleştirilmiş düzenli bir birim göz dizisine veya Oma Tedia'ya dönüştürülür. Klonal ekspresyonun doğrulanması ve I hayali diskin analizi, bu yöntemin olası aşağı akış uygulamalarıdır.

En üstteki üç panel, ilis, bir DPP, LAC Z transkripsiyonel raportör gibi farklı antikorlarla boyanmış diskleri ve bir pan nöronal, RNA bağlayıcı proteini kodlayan embriyonik, ölümcül, anormal görme veya vy gibi hücreye özgü belirteçleri gösterir. Alttaki üç panel, hücre popülasyonlarını işaretlemek için GFP'nin kullanıldığı diskleri göstermektedir. Kursa hakim olduktan sonra, 10 ila 20 larvadan kafa komplekslerinin izolasyonu yaklaşık 10 dakika sürecektir ve ek olarak, iyon tenal diskinin bu komplekslerden ince izolasyonu da yaklaşık 10 dakika sürecektir.