Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama
October 1st, 2014
Bu video protokolünde, modifiye edilmiş iki fotonlu bir mikroskopta orbital izleme yöntemini kullanarak, canlı hücreler içindeki floresan olarak işaretlenmiş lizozomları - yüksek hızda ve üç boyutta - izliyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, canlı bir hücre içinde 3D olarak hareket eden lizozomlar gibi hızlı hareket eden organellerin nasıl izleneceğini göstermektir. Bu, ilk olarak lizozomların ve mikrotübüllerin, kültürlenmiş canlı hücrelerin içindeki spesifik ticari boyalar kullanılarak boyanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bir lazer tarama mikroskobu kullanmak ve lizozom hareketini yüksek hızda takip etmek için yörünge izleme yöntemini kullanmaktır, yörüngenin boyutu ve sistemin frekans tepkisi gibi diğer parametreler daha sonra izleme deneyleri yapmak için seçilir.
Sonuç olarak, sonuçlar, hızlı hareket eden lizozomları üç boyutta takip etmenin ve izleme sırasında lazer yörüngesi boyunca karşılaşılan diğer floresan lekeli organellerle etkileşimleri tespit etmenin mümkün olduğunu göstermektedir. 3D izleme yönteminin, örneğin Astigmatlara dayanan diğer mevcut yöntemlere göre temel avantajları, 3D withal izleme yönteminin demansın çok geniş bir yelpazesini izlememize izin vermesidir. Bu yöntem, veziküler taşıma alanında, veziküllerin mikro tüpler boyunca nasıl hareket ettiği gibi önemli bir sorunun sorulmasına yardımcı olabilir.
Bu yöntem endozomal dinamikleri incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, go nanopartikülleri, membran reseptörleri, agrega nükleer port kompleksleri veya genetik lokuslar gibi izole edilmiş partikülleri floresan olarak etiketlemenin mümkün olduğu diğer sistemlerde de kullanılabilir: Metin protokolünde açıklandığı gibi Korunan Çin hamster yumurtalık hücreleri veya CH K tek hücreleri. Hücreleri topladıktan sonra, onları 14 milimetre çapında bir yere yerleştirin.
Yüzey kalınlığı 0.16 milimetre olan mikro kuyu Görüntüleme için optimum yoğunluk için tohum hücreleri yaklaşık% 60 ila 70 Co akıcılığı hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece CO2'de% 5 CO2'de inkübe edin, hücreleri Hank'in tamponlu tuzlu su çözeltisinde üç kez yıkayın veya H-B-S-S-H-B-S-S, kültür plakasından ölü hücreleri veya kalıntıları çıkarmak ve hücreleri boyama adımına hazırlamak için kullanılır. Daha sonra hücreleri, inkübasyonu takiben 37 santigrat derecede bir saat boyunca 50 ano molar lyo tracker ve 150 ano molar tubulin tracker green nihai konsantrasyonu içeren bir HBSS çözeltisinde inkübe edin. Bağlanmamış boyayı çıkarmak için hücreleri HBSS'de üç kez yıkayın.
Hücreleri görüntülemeden önce taze DMEM büyüme ortamı ekleyin. Video protokolünde açıklanan parçacık izleme mikroskobu, ticari olarak temin edilebilen ters çevrilmiş bir mikroskobun çerçevesi üzerine monte edilir. 690 nanometre ile 1040 nanometre arasında ayarlanabilir bir çıkış Dalga Boyu aralığı ile tutarlı bir bukalemun ultra iki titanyum safir femtosaniye lazer uyarma ışık kaynağı kullanılır.
Lazer ışınının mikroskobun arka portuna hizalandığından emin olun. Kızılötesi kaplı aynalar kullanılarak, lazer ışını, bir kalsit polarizörün önüne yerleştirilmiş dönen bir yarım dalga plakası kullanılarak zayıflatılır, ışını, numunedeki ortalama güç 0,5 ila iki miliwatt arasında olacak şekilde zayıflatır. Işık yoluna yüksek sayısal açıklıklı bir su objektifi yerleştirerek numuneden floresan ışığını toplayın.
Ardından, numuneyi motorlu bir tablaya yerleştirin ve mikroskop objektifinin ince hareketini ayarlayın. Objektif bir pizo denetleyicisi kullanma. Bir veya iki kanal konfigürasyonunda istenen emisyon dalga boylarına göre bir floresan filtre küpü seçin.
Emisyon bandı geçiren filtreler kullanın. Yayılan floresanın spektral aralığını daha fazla seçmek için, filtre küpünden gelen ışığı, sinyalin yükseltildiği ve ayırt edildiği ve hücreleri görüntülemek, onları sahneye yerleştirmek ve iletilen ışık aydınlatmasını kullanarak odaklamak için bir dijital giriş çıkış veri toplama kartına gönderildiği foto çoğaltıcı tüplere yönlendirin. Boyayı içeren hücreleri tanımlamak ve alttaki mikrotübülleri görselleştirmek için raster taramalı görüntülemeye geçin, vezikül hareketinin mevcut olduğu ilk alanı belirleyin.
İzole edilmiş bir vezikül tanımlandıktan sonra, yörünge takibi için parametreleri ayarlayın. İlk olarak, izlenen parçacığın boyutuna göre dairesel taramanın boyutunu tanımlamak için yörüngenin yarıçapını seçin. Bir nokta yayıcı için, yörüngenin yarıçapını, nokta yayılma fonksiyonunun beline veya uyarma ışınının PSF'sine eşit olarak ayarlayın.
Hassasiyeti ve yanıtı en üst düzeye çıkarmak için. Eksenel yön boyunca parçacık konumunu lokalize etmek için gerçekleştirilen iki yörünge arasındaki mesafeyi tanımlamak için eksenel mesafeyi ayarlayın. Eksenel mesafeyi PSF atığının 1,5 ila üç katı olarak ayarlayın.
Yörüngenin her noktasında harcanan süreyi ayarlamak için parçacığın parlaklığına göre bekleme süresini tanımlayın, bu aynı zamanda foto ağartma oranını da belirleyecektir. 10 ila 100 mikrosaniye arasında bir bekleme süresi kullanın. Dört ila 32 milisaniye mertebesinde yörünge periyotları elde etmek için her yörüngedeki nokta sayısını 64 veya 128'e ayarlayın ve parçacık konumunu belirlemek için yüksek bir zamansal çözünürlük sağlayın.
Raster taranan görüntüde bir imleç seçimi aracılığıyla grafik kullanıcı arayüzü aracılığıyla ışını parçacık üzerinde ortalamak için aynalara gönderilen DC ofset sinyalini değiştirin. Mikroskop modunu raster görüntülemeden orbital taramaya geçirerek izlemeye başlayın. Yörünge analizi için geri bildirimi ve veri toplamayı etkinleştirin.
Yörünge boyunca her noktada ve her zaman noktasında toplanan floresansı bir yoğunluk halısı şeklinde görüntülemek için yazılımı kullanın. Halı boyunca toplanan yoğunluk, parçacığın diğer parlak nesnelerle etkileşimi hakkında bilgi sağlar. Hem yörünge bilgilerini hem de zaman içinde foto çarpan tüpünden toplanan floresan yoğunluğunu zaman serileri şeklinde görüntüleyin.
Yörüngede yalnızca bir ilgi alanı seçmek için zaman serisi gösterimini ve yoğunluk halısı bilgilerini kullanın. Ardından, parçacık yörüngesinin seçilen kısmının 2B projeksiyonunu görüntüleyin. Parçacık floresan yoğunluğuna göre yörüngeyi renk kodlaması yapmak için uygun kontrolleri seçin.
Parçacık yörüngesini 3D olarak görüntüleme seçeneğini seçin ve floresan yoğunluğuna göre renk kodlaması yapın. Mikrotübül boyunca lizozom hareketinin özelliklerini görselleştirmek için kontrolleri kullanarak yörüngeyi 3D olarak döndürün. Lizozomların ve mikrotübüllerin floresan yeşil boya boyası kullanılarak, veziküllerin mikrotübül boyunca yüksek hızlı hareketini iki fotonlu lazer tarama mikroskobu ile görüntülemek mümkündür.
Bununla birlikte, raster tarama görüntüleme, orbital izleme kullanılıyorsa daha hızlı endozomların hareketini doğru bir şekilde takip etmek için gerekli zamansal çözünürlüğe sahip değildir. Bunun yerine veriler, 32 milisaniyelik zamansal çözünürlükle x, y, Z yer değiştirme yörüngeleri elde etmenin mümkün olduğunu göstermektedir. Bu yer değiştirmeye karşı zaman yörüngelerinde, halı analizi her yörünge boyunca kaydedilen yoğunluğu gösterir.
Zamanla, yoğunluk yörüngesi parçacığın floresan çevresi hakkında bilgi sağlar. Kutulu bölge, yörüngenin iki sıçrama arasındaki kısmına karşılık gelir. Kutulu bölgenin dışındaki parlak noktalar, parçacığın diğer parlak nesnelerle etkileşimlerine karşılık gelir ve yörüngeler en parlak floresan kaynağında yeniden merkezlenirken yörüngedeki sıçramalarla ilişkilidir.
İzleme sırasında, yayılan floresansın entegre yoğunluğu kaydedilebilir. Yeniden yapılandırılmış 3B yörünge, mikrotübül ağı üzerinde hareket eden bir vezikülden beklenebileceği gibi yönlendirilmiş bir hareket gösterir. Ek olarak, 3B yörüngeyi bir RA'larla ilişkilendirmek veya çevredeki bölgenin görüntüsünü taramak mümkündür.
Bu, parçacığın bir mikro tübül demeti yönü boyunca hareketini doğrular. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, denerken düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse birkaç saat içinde yapılabilir. Bu prosedür, bu protokolde gösterildiği gibi fotonik alıntı yaparken numuneniz için zararlı olmayan lazer güç seviyesini kullanmayı unutmamak önemlidir, hedeflerden yaklaşık iki milivolt sonra güç seviyeleri korunmalıdır.
Bu videoyu izledikten sonra, çok geniş bir Z aralığındaki nesneleri izlemeye izin veren 3D yörünge izleme yöntemini kullanarak bir deneyin nasıl kurulacağını çok iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu video protokolü, modifiye edilmiş bir iki-foton mikroskobu kullanarak canlı hücreler içinde üç boyutta hızlı hareket eden lizozomların izlenmesini göstermektedir. Yörünge takip yöntemi, lizozom hareketinin ve diğer organellerle etkileşimlerinin yüksek hızda gözlemlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre Biyolojisi
- Mikroskopi Teknikleri
- Organel Dinamiği
Arka Plan
- Lizozomlar, hücresel taşımada rol oynayan kritik organellerdir.
- Organel hareketinin izlenmesi, hücresel süreçleri anlamak için önemlidir.
- Mevcut yöntemler, izleme hızı ve doğruluk açısından sınırlamalar içerebilir.
- Yörünge takip yöntemi, geleneksel tekniklere göre avantajlar sunar.
Çalışmanın Amacı
- Canlı hücrelerde lizozomların izlenmesi için bir yöntemi göstermek.
- Yüksek hızlı 3D izleme kabiliyetlerini göstermek.
- Lizozomlar ve diğer organeller arasındaki etkileşimleri keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Lizozomların ve mikrotübüllerin belirli boyalarla boyanması.
- Gözlem için bir lazer taramalı mikroskop kullanımı.
- Yüksek hızlı izleme için yörünge takip yönteminin kullanılması.
- Yörünge boyutu ve frekans tepkisi gibi parametrelerin ayarlanması.
Ana Sonuçlar
- Üç boyutta lizozomların başarılı bir şekilde izlenmesi.
- Diğer floresan boyalı organellerle etkileşimlerin tespiti.
- Yöntemin geniş bir aralık üzerinde etkinliğinin gösterilmesi.
- Mikrotübüller boyunca veziküler taşıma hakkında içgörüler.
Sonuçlar
- Yörünge takip yöntemi, organel dinamiğini incelemek için güçlü bir araçtır.
- Bu yaklaşım, veziküler taşıma mekanizmalarına olan anlayışımızı geliştirebilir.
- Gelecek araştırmalar, bu bulgulara dayanarak hücresel süreçleri keşfedebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution, real-time tracking of intracellular vesicles in live cells, providing critical insights into vesicular transport mechanisms relevant to drug delivery and target validation. The ability to monitor fast-moving organelles with nanometer spatial and millisecond temporal resolution supports mechanistic de-risking in early discovery by clarifying intracellular trafficking pathways. Such predictive confidence aids in prioritizing therapeutic candidates based on subcellular localization and transport dynamics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing lysosomal movement along microtubules, clarifying intracellular transport pathways.
- Operational Value: Provides quantitative 3D displacement data with 10 nm accuracy and 50 Hz frequency response, supporting functional target validation through direct observation of organelle dynamics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible trajectories of vesicle motion, enabling reliable comparison across experimental conditions for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable implementation in live-cell imaging platforms, allowing high-throughput assessment of compound effects on intracellular trafficking.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links discovery-phase observations to preclinical relevance by tracking lysosomes in disease-relevant cellular models, supporting biomarker alignment.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by correlating vesicular transport phenotypes with functional outcomes in translational models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing dynamic, quantitative readouts of intracellular trafficking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of lysosomal motility along cytoskeletal networks.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs (x, y, z trajectories) with high temporal resolution, enabling reliable compound screening for modulators of vesicular transport.
- Analytics: Generates time-series and intensity carpet data that allow teams to track particle interactions and detect deviations in motion patterns indicative of biological responses.
- Translational Research: Connects vesicular dynamics to preclinical continuity by enabling tracking in live cells under physiological conditions, relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying organelle dynamics across multiple targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in intracellular trafficking pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through feedback-controlled beam tracking, minimizing user-dependent variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into lysosomal transport, reducing late-stage failures due to poor subcellular delivery.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of candidates based on validated intracellular delivery and organelle co-localization profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in two-photon microscopy, fluorescence labeling, and live-cell imaging techniques.
- Depends on a modified laser scanning microscope with feedback control hardware and real-time data acquisition systems.
- Necessitates standardization of staining protocols, orbit parameters, and dwell times across laboratories for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types, fluorescent labels, and subcellular targets beyond lysosomes.
- Limited by phototoxicity risks at high laser powers, requiring careful power management to maintain sample viability during extended tracking.
