Name: Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Öğrenin, modifiye iki foton mikroskop kullanarak canlı hücrelerde lizozomların üç boyutlu orbital takip yöntemini. Bu teknik, hızlı organel dinamiklerini ve veziküler taşımayı incelemek için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 ve P50-GM076516 hibeleri ile desteklenmiştir.

1. Numune Hazırlama <ol><li> % 10 fetal sığır serumu ve penisilin streptomisin 50 ng / ml, 100 IU / ml ile takviye edilen DMEM kullanılarak doku kültürü şişelerinde CHOK1 hücreleri korumak. 37 ° C sıcaklıkta 5% CO2 nemlendirilmiş inkübatör hücreleri inkübe edin. </li><li> Hasat daha sonra 0.16 mm kadar bir kalınlığı olan bir yüzey 14 mm çaplı mikro çukuruna CHOK1 hücreleri ve plaka. 60-70% konfluansa çevresinde görüntüleme için en uygun yoğunluk için, tohum hücreleri. </li><li> 37 ° C&#39;de gece boyunca inkübe hücreleri,% 5 CO2. Yeşil ve tübülin izci yeşil 150 nM Lysotracker DND26 50 nM ihtiva eden bir çözelti içinde hücreleri HBSS (Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi) içindeki hücreleri üç kez yıkayın ve inkübe edilir. 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca hücrelerin inkübe edin. İsteğe bağlı adım: kuluçkalamadan önce, bir mitokondrial matris boyama boyasının (25 nM) ilave bir leke gerçekleştirir. </li><li> Herhangi bağlanmamış boya kaldırmak için HBSS&#39;de hücreleri üç kez yıkayın. Imag öncesinde taze DMEM büyüme ortamı ilave edinhücreleri ing. </li></ol> 2. Mikroskop Yapılandırmaları Video protokolde tarif parçacık takibi için mikroskop, bir ticari olarak temin edilebilir, ters çevrilmiş mikroskop (Şekil 4) şasisi üzerine monte edilir. 3D yörünge parçacık izleme Ancak ticari modülleri artık mevcuttur. <ol><li> 690 nm-1040 nm arasında ayarlanabilir bir çıkış dalga boyu aralığında, Sa femtosaniye lazer uyarım ışık kaynağı: Tutarlı Bir Bukalemun-Ultra II Ti kullanın. </li><li> Lazer ışını IR-kaplı aynalar kullanılarak mikroskop arka limanında hizalanmış olduğundan emin olun. Lazer ışını, bir kalsit doğrusal polarizörün ardından dönen yarım dalga plakası kullanılarak azaltılır. Örnek olarak, ortalama güç 0.5 mW 2 arasında olacak şekilde ışını zayıflatır. NOT: Lazer ışını, örnek düzlemde odaklanmış demetin konumunda ve yörüngesini kontrol etmek için kullanılır galvano-motor tahrikli bir çift ayna tarafından yansıtılır. Birkısa geçişli renkli aynadan yansıması sonrasında mikroskop objektif arka girmeden önce, bir ışın genişletici geçen galvanometre aynalar çıkan dengesi ayarlanmış lazer ışını genişletilmiş tipik yapılandırma (10X). </li><li> Işık yoluna yüksek sayısal açıklık su hedef (60X NA 1.2) yerleştirerek numuneden floresan ışığı toplamak. Bir ya da iki kanal konfigürasyonunda, istenen emisyon dalga boyuna göre, bir floresan filtre küpü seçin. Ayrıca yayılan floresan spektral aralığını seçmek için emisyon band geçiren filtreler kullanır. </li><li> Motorlu bir sahneye örnek yerleştirin ve objektif bir piezo-kumandayı kullanarak mikroskop objektif ince hareketini ayarlayın. </li><li> Sinyal tefrik ve dijital I / O veri toplama kartı gönderilir photomultiplier tüpler içine filtre küp ışık yönlendirin. NOT: Bilgisayar dalga I / O kartının analog çıkış ve provid vardır oluşturulantarayıcılar için ed elektronik kontrol. Fotomultiplikatörler tarayıcılar için çıkış sinyalinden foton sayma girişi ölçülür ve Floresan Dynamics SimFCS yazılımı Laboratuvarı tarafından I / O kartı üzerinden kontrol edilir. </li></ol> 3. Görüntüleme <ol><li> Sahnede hücreleri yerleştirin ve iletilen ışık aydınlatma kullanarak odaklanın. </li><li> Boya dahil olan hücreleri tespit etmek ve altında yatan mikrotübülleri görselleştirmek için raster tarama görüntüleme geçin. Vezikül hareketi varsa ilk alan tanımlayın. </li><li> Izole bir kese tespit edildikten sonra, yörünge takibi için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: <ol><li> Parçacığın boyutu izleniyor göre dairesel tarama boyutunu tanımlamak için yörüngenin yarıçapını seçin. Bir nokta Verici için, duyarlılık ve tepki maksimize etmek uyarma kirişin Noktası Yayılması Fonksiyonu (PSF) bel eşit yörüngenin yarıçapı ayarlayın. </li><li> Eksenel ayarlamaeksenel yön boyunca parçacık konumunun belirlenmesi için gerçekleştirilen iki yörünge arasındaki mesafeyi belirlemek için mesafe. 1,5-3 kat PSF bel eksenel mesafeyi ayarlayın. </li><li> Ayrıca fotoğraf ağartmak oranını belirleyecek yörüngesinin her noktasında harcanan zamanı ayarlamak için parçacığın parlaklığına göre bekleme süresini tanımlayın. 10-100 mikro-saniye arasında bir bekleme süresi kullanın. </li><li> 4-32 msn sırayla yörünge dönemleri verim ve parçacık konumunu belirlemek için bir yüksek temporal çözünürlük sağlamak için 64 veya 128, her yörüngede noktalarının sayısını ayarlayın. </li></ol></li><li> DC raster taranan görüntüde bir imleç seçim yoluyla grafiksel kullanıcı arabirimi yoluyla parçacık üzerindeki kiriş ortalamak için aynalara gönderilen ofset sinyali değiştirin. </li><li> Yörünge tarama tarama-görüntüleme gelen mikroskop moduna geçerek izlemeye başlayabilirsiniz. </li><li> Geribildirim ve veri toplama etkinleştirin. </li></ol> 4. TrajectORY Analizi <ol><li> Yörünge boyunca ve bir &quot;yoğunluk halı&quot; şeklinde, her bir zaman noktasında her bir noktada toplanan floresan görüntülemek için yazılımı kullanın. Halının boyunca alınmış yoğunluğu başka parlak nesneler ile parçacığın etkileşimi hakkında bilgi sağlar. Hem de zaman serisi şeklinde zaman foto-çoğaltıcı tüp toplanan floresan yoğunluğu (x, y ve z tarayıcılar -piezo arasında zamanla DC yerinden yani) yörünge bilgileri hem görüntülemek için yazılımı kullanın. </li><li> Yörünge ilgi sadece bir bölgeyi seçmek için zaman serisi temsil ve &#39;şiddeti halı&#39; bilgileri kullanın. </li><li> Partikül yörünge seçilmiş bir bölümünün 2D çıkıntısının görüntülemek için yazılımı kullanın. Parçacık floresan yoğunluğuna göre renk kodu yörüngesini uygun kontrolleri seçiniz. </li><li> S görüntülemek için seçeneğini seçinfloresan yoğunluğuna göre 3D makale yörünge ve renk-kod. Mikrotubullerin boyunca lizozom hareket özelliklerini görselleştirmek için denetimlerini kullanarak 3D yörünge döndürün. </li></ol>

<ol><li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li>
<li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li>
<li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li>
<li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li>
<li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li>
<li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li>
<li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li>
<li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li>
<li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosome+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li>
<li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Multiphoton+Microscopy+in+the+Biomedical+Sciences%22%5BJournal%5D)">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li>
<li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li>
<li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Yüksek zamansal çözünürlüğe sahip üç boyutlu floresan parçacıkların yörüngeleri elde son yıllarda floresan mikroskopi teknikleri ve instrumentations, muazzam gelişmelere rağmen alanında bir meydan okuma kalmıştır. Yüksek zamansal çözünürlüğü, iki boyutta izleme parçacıkları elde edilmişse, eksenel yöne uzantısı genellikle, sistemin 10 bir frekans yanıtı şiddetli bir azalma getirir. Bu video protokolde iki foton mikroskop kullanılarak yüksek temporal çözünürlük (bu deneyde 32 msn) ...

Yaklaşımlar çok sayıda, bir mikroskop kullanılarak üç boyutlu olarak floresan parçacıkların izlemek için bugüne kadar geliştirilmiştir. En ideal yaklaşımlar, tipik olarak, eksenel yönde izleme elde etmek için mikroskop emisyon optik özel modifikasyonları ile birlikte, iki boyutlu izlemek için uygun, hızlı kameraların kullanımına dayanmaktadır. Bu işlem, uygun bir zaman çözünürlüğü (10 Hz), tipik olarak zaman alıcı ve verir, ancak geleneksel bir partiküldür izlenen halinde, Z yığınlarının bir zaman dizisi gerçekleştirerek, floresan partikül izleyebilir (konfokal ya da iki ya da foton) lazer tarama mikroskobu Etkin bir geri besleme mekanizması 2 ile küçük bir raster görüntüleme bölgenin merkezinde tuttu. Kilitleme-in parçacığa fikri yörünge izleme yönteminin temelidir. Bunun yerine, bir raster dairesel bir yörünge floresan de yaklaşık tarama gerçekleştirilir. Boyunca floresans yoğunluğuyörünge tam parçacık pozisyonunu 4 lokalize. Parçacığın lokalize konumu daha sonra mikroskop tarayıcıları ve yeniden merkezi partikül yörünge konumu üzerinde harekete geçirmek için kullanılabilir. Mikroskop galvanometre tarayıcılar bir analog voltaj ile tahrik edilmektedir. Bu gerilimin AC bileşeni, bir sinüs ve dairesel bir yörünge performans sağlayacak X ve Y, tarama ayna uygulanan bir kosinüs dalgası, yani, odaklı lazer ışını ile bir yörüngeye da yapılabilir. Sinyalinin offset DC yörünge merkezinin pozisyonunu değiştirerek kolaylaştırır. Bir yörünge süresi belirlenir ve AC sinyali için dalga yapılandırıldıktan sonra, geri besleme sistemi bir sinyalin DC bileşenini güncellemek gerekir. Dedektörler toplanan floresan sinyalini okumak mümkün bir yazılım DC kapalı, tarayıcılar ve dedektörleri kontrol etmek parçacığın konumunu hesaplamak için ve güncelleme gereklidirayarlayın. Yörünge parametrelerine (boyut ve zamanlama) dikkatli bir seçim görüntüleme başarılı bir geribildirim için gerekli ve bu parametreler o izlemek için gerekli olan floresan parçacıkların özelliklerine dayalı ayarlanması gerekiyor edilir. Tekniğinin fiziksel ve matematiksel temelleri 2D ve 3D uygulamaları için geçmiş 4,5&#39;den tarif edilmiştir. Bu protokolde kısaca kurulum ana donanım bileşenlerini tanımlamak ve daha ayrıntılı parametrelerin seçimi ve numune hazırlama canlı bir hücrenin içinde yüksek bir zamansal çözünürlükte bir lizozomun yerinden takip etmemizi sağlayan tipik bir deney için gerekli.

<table><tbody><tr><td>Lysotracker DND 26</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L-7526</td><td></td></tr><tr><td>Tübülin izci Yeşil</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>T34075</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker KIRMIZI</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>Tutarlı Bumelon-ultra II TI</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glan Taylor Kalsit Polarize Melles</td><td>Griot</td><td>03PTA001</td><td></td></tr><tr><td>Galvanometre-motor aynası</td><td>Cambridge Technologies</td><td>M 6350</td><td></td></tr><tr><td>Dikroik ayna</td><td>Chroma Technologies</td><td>700 DCSPXR</td><td></td></tr><tr><td>Motorlu sahne</td><td>ASI</td><td>MS2000</td><td></td></tr><tr><td>Piezo&nbsp;</td><td>PI</td><td>P721-LLQ</td><td></td></tr><tr><td>Fotoçoğaltıcı tüp</td><td>Hamamatsu</td><td>H7422P-40</td><td></td></tr><tr><td>Veri toplama kartı</td><td>IO tech</td><td>PCI 1128-4000</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüler için görüntüleme yazılımı</td><td>LFD</td><td>Global-SimFCS</td><td></td></tr></tbody></table>

modifiye İki foton mikroskop 3d orbital takip: hücre içi veziküllerin İzlemeye bir uygulama

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Bu Video protokolün amacı, bir modifiye iki-foton mikroskop 1 kullanarak üç boyutlu floresan yörünge parçacık izleme deneyi gerçekleştirmek ve analiz nasıl tartışmaktır. Geleneksel yaklaşımlar (raster tarama veya kare bir yığın tabanlı geniş alan) aksine, 3D yörünge izleme lokalize ve yüksek uzaysal (10 nm doğruluk) ve temporal çözünürlük (50 Hz frekans tepkisi) 3D deplasman ile takip sağlar mikron 2 yüzlerce uzunluğu-ölçeklerde hareketli bir floresan parçacık. Bu yöntem takip edilecek nesnenin etrafında dairesel bir yörünge gerçekleştirmek için bir iki-fotonlu lazer tarama mikroskobu donanım kontrol eden bir geri besleme algoritmasına dayanır: geri besleme mekanizması yer değiştirme kontrol ederek merkezinde floresan nesne koruyacaktır tarama ışın 3-5. Bu tekniğin avantajlarını göstermek için, biz al içinde hızlı bir hareket organelini, lizozom, takipiving hücre 6,7. Hücreler, standart protokollere göre kaplama, ve bir ticari olarak lizozom boya ile boyandı. Biz yaşayan hücrelerin içinde bir 3D yörünge izleme deneyi gerçekleştirmek için, kısaca donanım yapılandırması ve daha detaylı kontrol yazılımı tartışmak. Ayrıntılı olarak tarama mikroskobu kontrol ve parçacık etrafında kapalı bir yörüngede kirişin hareketi mümkün kılmak için gerekli parametreleri tartışırlar. Bu yöntem etkili bir şekilde canlı hücre içinde 3D mikrotübüller boyunca bir etiketli lizozom hızlı hareketi izlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteren sonucuna varmaktadırlar. Lizozomlar tipik olarak mikrotübül ağı 8 boyunca yönlendirilmiş hareketini görüntüleyen, 0.4-0.5 mm / sn aralığında hızlarla hareket edebilir.

Bu protokole göre hızlı 3D tek parçacık izleme floresan etiketli lizozomların değiştirmesini izlemek için değiştirilmiş iki-fotonlu mikroskop kullanılarak canlı hücreler içinde gerçekleştirilebilir. Yapılan deney endozom olgunlaştırma işlemi 9 sonra hücre içinde hareket eden, izole edilmiş bir lizozom izleme oluşur. Lizozomlar floresan yeşil boya kullanılarak boyandı ve 2-foton uyarma istismar 930 nm'de heyecanlandırdı. Bizim veriler 32 milisaniye (Şekil 1a) bir zamansal çözünürlüğe sahip <em...

Bu video protokolünde, modifiye edilmiş iki fotonlu bir mikroskopta orbital izleme yöntemini kullanarak, canlı hücreler içindeki floresan olarak işaretlenmiş lizozomları - yüksek hızda ve üç boyutta - izliyoruz.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı bir hücre içinde 3D olarak hareket eden lizozomlar gibi hızlı hareket eden organellerin nasıl izleneceğini göstermektir. Bu, ilk olarak lizozomların ve mikrotübüllerin, kültürlenmiş canlı hücrelerin içindeki spesifik ticari boyalar kullanılarak boyanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, bir lazer tarama mikroskobu kullanmak ve lizozom hareketini yüksek hızda takip etmek için yörünge izleme yöntemini kullanmaktır, yörüngenin boyutu ve sistemin frekans tepkisi gibi diğer parametreler daha sonra izleme deneyleri yapmak için seçilir.Sonuç olarak, sonuçlar, hızlı hareket eden lizozomları üç boyutta takip etmenin ve izleme sırasında lazer yörüngesi boyunca karşılaşılan diğer floresan lekeli organellerle etkileşimleri tespit etmenin mümkün olduğunu göstermektedir. 3D izleme yönteminin, örneğin Astigmatlara dayanan diğer mevcut yöntemlere göre temel avantajları, 3D withal izleme yönteminin demansın çok geniş bir yelpazesini izlememize izin vermesidir. Bu yöntem, veziküler taşıma alanında, veziküllerin mikro tüpler boyunca nasıl hareket ettiği gibi önemli bir sorunun sorulmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem endozomal dinamikleri incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, go nanopartikülleri, membran reseptörleri, agrega nükleer port kompleksleri veya genetik lokuslar gibi izole edilmiş partikülleri floresan olarak etiketlemenin mümkün olduğu diğer sistemlerde de kullanılabilir: Metin protokolünde açıklandığı gibi Korunan Çin hamster yumurtalık hücreleri veya CH K tek hücreleri. Hücreleri topladıktan sonra, onları 14 milimetre çapında bir yere yerleştirin.Yüzey kalınlığı 0.16 milimetre olan mikro kuyu Görüntüleme için optimum yoğunluk için tohum hücreleri yaklaşık% 60 ila 70 Co akıcılığı hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece CO2'de% 5 CO2'de inkübe edin, hücreleri Hank'in tamponlu tuzlu su çözeltisinde üç kez yıkayın veya H-B-S-S-H-B-S-S, kültür plakasından ölü hücreleri veya kalıntıları çıkarmak ve hücreleri boyama adımına hazırlamak için kullanılır. Daha sonra hücreleri, inkübasyonu takiben 37 santigrat derecede bir saat boyunca 50 ano molar lyo tracker ve 150 ano molar tubulin tracker green nihai konsantrasyonu içeren bir HBSS çözeltisinde inkübe edin. Bağlanmamış boyayı çıkarmak için hücreleri HBSS'de üç kez yıkayın.Hücreleri görüntülemeden önce taze DMEM büyüme ortamı ekleyin. Video protokolünde açıklanan parçacık izleme mikroskobu, ticari olarak temin edilebilen ters çevrilmiş bir mikroskobun çerçevesi üzerine monte edilir. 690 nanometre ile 1040 nanometre arasında ayarlanabilir bir çıkış Dalga Boyu aralığı ile tutarlı bir bukalemun ultra iki titanyum safir femtosaniye lazer uyarma ışık kaynağı kullanılır.Lazer ışınının mikroskobun arka portuna hizalandığından emin olun. Kızılötesi kaplı aynalar kullanılarak, lazer ışını, bir kalsit polarizörün önüne yerleştirilmiş dönen bir yarım dalga plakası kullanılarak zayıflatılır, ışını, numunedeki ortalama güç 0,5 ila iki miliwatt arasında olacak şekilde zayıflatır. Işık yoluna yüksek sayısal açıklıklı bir su objektifi yerleştirerek numuneden floresan ışığını toplayın.Ardından, numuneyi motorlu bir tablaya yerleştirin ve mikroskop objektifinin ince hareketini ayarlayın. Objektif bir pizo denetleyicisi kullanma. Bir veya iki kanal konfigürasyonunda istenen emisyon dalga boylarına göre bir floresan filtre küpü seçin.Emisyon bandı geçiren filtreler kullanın. Yayılan floresanın spektral aralığını daha fazla seçmek için, filtre küpünden gelen ışığı, sinyalin yükseltildiği ve ayırt edildiği ve hücreleri görüntülemek, onları sahneye yerleştirmek ve iletilen ışık aydınlatmasını kullanarak odaklamak için bir dijital giriş çıkış veri toplama kartına gönderildiği foto çoğaltıcı tüplere yönlendirin. Boyayı içeren hücreleri tanımlamak ve alttaki mikrotübülleri görselleştirmek için raster taramalı görüntülemeye geçin, vezikül hareketinin mevcut olduğu ilk alanı belirleyin.İzole edilmiş bir vezikül tanımlandıktan sonra, yörünge takibi için parametreleri ayarlayın. İlk olarak, izlenen parçacığın boyutuna göre dairesel taramanın boyutunu tanımlamak için yörüngenin yarıçapını seçin. Bir nokta yayıcı için, yörüngenin yarıçapını, nokta yayılma fonksiyonunun beline veya uyarma ışınının PSF'sine eşit olarak ayarlayın.Hassasiyeti ve yanıtı en üst düzeye çıkarmak için. Eksenel yön boyunca parçacık konumunu lokalize etmek için gerçekleştirilen iki yörünge arasındaki mesafeyi tanımlamak için eksenel mesafeyi ayarlayın. Eksenel mesafeyi PSF atığının 1,5 ila üç katı olarak ayarlayın.Yörüngenin her noktasında harcanan süreyi ayarlamak için parçacığın parlaklığına göre bekleme süresini tanımlayın, bu aynı zamanda foto ağartma oranını da belirleyecektir. 10 ila 100 mikrosaniye arasında bir bekleme süresi kullanın. Dört ila 32 milisaniye mertebesinde yörünge periyotları elde etmek için her yörüngedeki nokta sayısını 64 veya 128'e ayarlayın ve parçacık konumunu belirlemek için yüksek bir zamansal çözünürlük sağlayın.Raster taranan görüntüde bir imleç seçimi aracılığıyla grafik kullanıcı arayüzü aracılığıyla ışını parçacık üzerinde ortalamak için aynalara gönderilen DC ofset sinyalini değiştirin. Mikroskop modunu raster görüntülemeden orbital taramaya geçirerek izlemeye başlayın. Yörünge analizi için geri bildirimi ve veri toplamayı etkinleştirin.Yörünge boyunca her noktada ve her zaman noktasında toplanan floresansı bir yoğunluk halısı şeklinde görüntülemek için yazılımı kullanın. Halı boyunca toplanan yoğunluk, parçacığın diğer parlak nesnelerle etkileşimi hakkında bilgi sağlar. Hem yörünge bilgilerini hem de zaman içinde foto çarpan tüpünden toplanan floresan yoğunluğunu zaman serileri şeklinde görüntüleyin.Yörüngede yalnızca bir ilgi alanı seçmek için zaman serisi gösterimini ve yoğunluk halısı bilgilerini kullanın. Ardından, parçacık yörüngesinin seçilen kısmının 2B projeksiyonunu görüntüleyin. Parçacık floresan yoğunluğuna göre yörüngeyi renk kodlaması yapmak için uygun kontrolleri seçin.Parçacık yörüngesini 3D olarak görüntüleme seçeneğini seçin ve floresan yoğunluğuna göre renk kodlaması yapın. Mikrotübül boyunca lizozom hareketinin özelliklerini görselleştirmek için kontrolleri kullanarak yörüngeyi 3D olarak döndürün. Lizozomların ve mikrotübüllerin floresan yeşil boya boyası kullanılarak, veziküllerin mikrotübül boyunca yüksek hızlı hareketini iki fotonlu lazer tarama mikroskobu ile görüntülemek mümkündür.Bununla birlikte, raster tarama görüntüleme, orbital izleme kullanılıyorsa daha hızlı endozomların hareketini doğru bir şekilde takip etmek için gerekli zamansal çözünürlüğe sahip değildir. Bunun yerine veriler, 32 milisaniyelik zamansal çözünürlükle x, y, Z yer değiştirme yörüngeleri elde etmenin mümkün olduğunu göstermektedir. Bu yer değiştirmeye karşı zaman yörüngelerinde, halı analizi her yörünge boyunca kaydedilen yoğunluğu gösterir.Zamanla, yoğunluk yörüngesi parçacığın floresan çevresi hakkında bilgi sağlar. Kutulu bölge, yörüngenin iki sıçrama arasındaki kısmına karşılık gelir. Kutulu bölgenin dışındaki parlak noktalar, parçacığın diğer parlak nesnelerle etkileşimlerine karşılık gelir ve yörüngeler en parlak floresan kaynağında yeniden merkezlenirken yörüngedeki sıçramalarla ilişkilidir.İzleme sırasında, yayılan floresansın entegre yoğunluğu kaydedilebilir. Yeniden yapılandırılmış 3B yörünge, mikrotübül ağı üzerinde hareket eden bir vezikülden beklenebileceği gibi yönlendirilmiş bir hareket gösterir. Ek olarak, 3B yörüngeyi bir RA'larla ilişkilendirmek veya çevredeki bölgenin görüntüsünü taramak mümkündür.Bu, parçacığın bir mikro tübül demeti yönü boyunca hareketini doğrular. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, denerken düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse birkaç saat içinde yapılabilir. Bu prosedür, bu protokolde gösterildiği gibi fotonik alıntı yaparken numuneniz için zararlı olmayan lazer güç seviyesini kullanmayı unutmamak önemlidir, hedeflerden yaklaşık iki milivolt sonra güç seviyeleri korunmalıdır.Bu videoyu izledikten sonra, çok geniş bir Z aralığındaki nesneleri izlemeye izin veren 3D yörünge izleme yöntemini kullanarak bir deneyin nasıl kurulacağını çok iyi anlamış olmalısınız.

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu video, nöronal veziküllerin hareketlerini görselleştirmek için belirli floresan proteinlerle nasıl etiketlendiğini gösterir. İlk olarak, bir floresan proteini kodlayan bir plazmit, bir transfeksiyon ajanı ile inkübe edilir ve daha sonra bir nöron kültürüne sokulur. Daha sonra, veziküllerin hareketini izlemek için nöronların görüntüleri elde edilir ve analiz edilir.

Floresan Görüntüleme Kullanılarak Nöronlardaki Vezikül Motilitelerinin Görselleştirilmesi

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Membran kaçakçılığının araştırılması, nöronal işlevleri anlamada çok önemlidir. Burada, nöronlarda vezikül hareketliliğini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu, sinir sistemindeki zar ticaretinin miktarına uyarlanabilen uygun bir yöntemdir.

Floresan Probları Kullanan Kültürlü Nöronlarda Endozom ve Lizozom Hareketlerinin Nicelendirilmesi

İnşaat ve gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme mikroskop izleme Nano floresan yetenekli probları yüksek diffusive hızları ve düşük foton sayısı oranları bu protokolü ayrıntıları.

Gerçek zamanlı 3D tek parçacık izleme için bir iletişim kuralı

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Bu protokol, çok renkli 4d (zaman atlama 3D) Konfokal mikroskobu kullanarak mantar tomurcuklanan içinde floresan etiketli hücre içi bölmeler Analizi açıklanmaktadır. Görüntüleme parametreleri, fotodamat kısıtlarken yeterli sinyalleri yakalamak için seçilir. Özel ımagej eklentileri etiketlenmiş yapıların izlenmesini ve niceli olarak analiz edilmesini sağlar.

Maya 4D mikroskopisi

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Görüntüleme kaynaklı ortalama kare yer değiştirme (iMSD) analizi, makropinozomlara yapısal ve dinamik özellikler açısından içsel zaman evrimleşen doğalarını vurgulamak için uygulanır. Makropinozomlar daha sonra zaman değişmez ortalama yapısal / dinamik özelliklere sahip hücre altı yapılar için bir referans olarak insülin salgı granülleri (ISG'ler) ile karşılaştırılır.

Spatiotemporal Dalgalanma Spektroskopisi ile Kaçakçılık Yapan Hücre Altı Nanoyapıların Yapısal ve Dinamik Özelliklerinin İncelenmesi

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin, modifiye iki foton mikroskop kullanarak canlı hücrelerde lizozomların üç boyutlu orbital takip yöntemini. Bu teknik, hızlı organel dinamiklerini ve veziküler taşımayı incelemek için güçlü bir araç sunar.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

Daha fazla video keşfet