Kültürleme Caenorhabditis elegans Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Bu prosedürün genel amacı, çok sayıda aşağı akış uygulaması için CENIC sıvı ortamında deniz zarafetini tanıtmak ve büyütmektir. Bu, ilk önce aç agar plakalarından mezar solucanlarının ağartılmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, serbest bırakılan yumurtaların antibiyotiklerle M-C-E-H-R'ye aktarılması ve yedi ila 10 gün sürebilen mezar aşamasına kadar gelişmelerine izin vermektir.

Üçüncü adım, mezarları ağartmak ve ek antibiyotik kullanmadan mezar aşamasına ikinci kez gelişmelerine izin vermektir. Son adım, Axe solucanlarını senkronize etmek ve bunları solucan büyümesini ve gelişimini inceleyen beslenme çalışmaları için kullanmaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, vahşi C tipi zarafetin Axe Liquid ortamında iyi büyüdüğünü ve M-C-E-H-R ortamının bakteriyel yan ürünler olmadan solucanların beslenme ihtiyaçlarını incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu tekniğin, agar plakalarında veya bakterili sıvı ortamlarda solucan yetiştirme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, besin öğelerinin veya toksinlerin etkilerinin bakteriyel yan ürünleri karıştırmadan test edilebilmesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, ortam hazırlığı ve solucanların EMIC sıvı ortamına ilk adaptasyonu nedeniyle mücadele edeceklerdir. Bu prosedür, C zarafetinin bakteriyel bir besin kaynağı olmadan büyümesine izin veren M-C-E-H-R-A sıvı ortamının hazırlanmasını açıklar.

Bir başlık altında sıkı bir şekilde steril teknik kullanarak, M-C-E-H-R bileşenlerini aşağıdaki sırayla karıştırın. Kolin, diyak asit sitrat ile başlayın ve ardından vitamin ve büyüme faktörü ile devam edin. İnsan klorürü olan myo asetolü karıştırın ve son olarak DI suyunu ekleyin M-C-E-H-R karışımını emişli 0.22 mikronluk bir filtreden süzün.

Aşağıdaki sırayla daha sonra nükleik asidi ekleyin, mineral karışımını, lakt, albümin, hidrolizat, esansiyel amino asitleri, esansiyel olmayan amino asitleri, potasyum fosfat, deg, glikoz yığını, sodyum tuzu ve DI suyunu karıştırın. Şimdi karışımı tekrar emme ile süzün. Filtrelemeden sonra, ortama kolesterol ekleyin ve ardından bir ortamın pH'ını kontrol edin.

PH altı ile 6.5 arasında olmalıdır. Çözelti doğru bir şekilde yapıldıysa, titiz steril teknik kullanarak M-C-E-H-R ortamına pastörize sütün %20'sini ekleyin. Ortamı dört santigrat derecede saklayın.

Mevcut OP 50 E coli'nin çoğunu tüketmiş GR solucanlarıyla dolu 10 adet 60 milimetrelik NGM plakasını hazır bulundurun. Bu solucanları 50 mililitrelik konik bir tüpe durulayın. Plaka başına beş mililitre M dokuz tampon kullanarak, solucanların yerleşmesine izin verin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Bunu tekrarlayın, iki kez daha durulayın M dokuz tampon ekleyerek, solucanların çökelmesine izin vererek ve süpernatanı çıkararak, ardından solucan süspansiyonuna kıyasla solucan agregasına altı hacim 0.1 normal sodyum klorür ekleyin, bir hacim beş normal sodyum hidroksit ve iki hacim taze ağartıcı karışımı hazırlayın. Çözüm: Bu karışımı süspansiyona ekleyerek solucanları ağartın. Bir sonraki girdap, mezar solucanları çözülene kadar karıştırın ve süspansiyonda sadece yumurtalar kaldı.

Bu beş ila 10 dakika sürer. Tüpteki bu reaksiyonu izlemek için 10 x objektifli faz kontrast mikroskobu kullanın. Yumurtalar izole edildikten sonra, 45 saniye boyunca 800 G'de ve dört santigrat derecede pelet yapın, süpernatanı aspire edin ve peleti davlumbazda 10 mililitre steril suda iki kez durulayın, bu durulamalar için santrifüjleme ve aspirasyonu tekrarlayın.

Daha sonra, yumurta peletini M-C-E-H-R ortamı ile yeniden süspanse edin ve salınan yumurtaları bir doku kültürü şişesine aktarın. Şişedeki yumurtalara mililitre tetrasiklin başına 100 mikrogram ekleyin. Bu adım laminer bir akış başlığında gerçekleştirilmelidir.

Sıkı steril teknikler kullanarak, sıvı kültürleri 20 santigrat derecelik bir inkübatöre aktarın ve bunları yörüngesel bir platformda kültürleyin. 70 RPM'de çalkalayıcı, solucanların gelişimini günlük olarak izler. Yedi ila 10 gün sonra, solucan Ravi aşamasına gelmeli, solucanları konik bir tüpe aktarmalı ve sallanan bir kova rotorunda dört santigrat derecede beş dakika boyunca 800 G'de pelet haline getirilmelidir.

Süpernatanı aspire ettikten sonra, solucan peletini bir hacim 0.1 molar sodyum klorür içinde yeniden süspanse edin ve solucanların beş dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin. Şimdi, yukarıda belirtilen ağartma prosedürünü tekrarlayın ve yumurtaları cenic sıvı ortamda kültürleyin. Daha önce olduğu gibi, solucan müttefikini kültürlendirirken steril tekniklerin kullanılması önemlidir.

Antibiyotik kullanımından kaçınmak, deniz zarafeti kültürlerinin gerçekten de kirletici bakterilerden arınmış olmasını sağlar. Kültür işlemi tekrarlandığında, ikinci nesil ortamdan tetrasiklin yayar. Bu noktada, senkronize kültürler senkronizasyon için hazırlanabilir.

GR solucanlarının ağartılmasının ardından salınan yumurtalara 10 mililitre M dokuz tampon ekleyin ve yörüngesel bir platformda gece boyunca 20 santigrat derecede yumurtadan çıkmalarına izin verin. Ertesi gün çalkalayın, larvaları 800 G'de beş dakika boyunca peletleyin ve L bir larvayı tekrar süspanse edin. 10 mililitre M-C-E-H-R'de, süspansiyonu 25 santimetre karelik bir şişeye aktarın ve maksimum yoğunluklarına kadar büyütün.

Solucanların büyümesini birkaç günde bir kontrol etmek, solucanların çok kalabalık hale gelmemesini ve ortamdaki mevcut besin maddelerini tüketmemesini sağlamak için gereklidir. Bir balta solucanı kültürünü saklamak için, reçine bir solucan peletini saklama şişelerinde 0,5 mililitre S tamponunda askıya alın, %30 gliserol içeren bir hacim S tamponu ekleyin. Daha sonra şişeleri eksi 80 santigrat dereceye aktarın, ardından solucanları çözmek için sıvı nitrojen içinde uzun süreli depolama, şişeyi neredeyse tüm buz eriyene kadar 37 santigrat derecede inkübe edin, bu da yaklaşık iki dakika sürer.

Daha sonra steril koşullar altında bunları M-C-E-H-R ortamına geri aktarın. M-C-E-H-R kullanmanın bir avantajı, solucan gelişimi üzerindeki kesin besin gereksinimini inceleyen çalışmalarda görülmüştür. Solucanlar, düşük, optimal ve toksik heme seviyelerini belirlemek için artan miktarlarda heme ile desteklenmiş M-C-E-H-R'de yetiştirildi.

Ek olarak, solucanların hem durumunu daha küçük bir konsantrasyon aralığında dolaylı olarak değerlendirmek için ters duyarlı bir raportör suşu kullanıldı. Dört mikromolar hemde yetiştirilen bu solucanlar, solucanların düşük bir heme ortamında olduğunu gösteren yüksek floresan gösterdi. Hem konsantrasyonu sekiz mikromolar seviyeye yükseltildiğinde, GFP ekspresyonu azaldı.

Heme konsantrasyonu 10 mikromolar kısma yükseltildiğinde, solucanlar çok az GFP ekspresyonu gösterdi ve 20 mikromolar heme'de GFP ekspresyonu göstermediler. Bu prosedürü denerken, kültürlerin emik olduğundan emin olmak ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için titizlikle steril teknikler kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, M-C-E-H-R'ın çok sayıda deniz zarafeti gerektiren çok sayıda uygulama için kullanılabilecek bir xenex sea elegance kültürü oluşturmasını ve sürdürmesini sağlayabilmelisiniz.