Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir mikroakışkan elektrokimyasal cihaz kullanarak DNA hibridizasyon olaylarının empedans spektrumları üzerindeki etkisini gözlemlemektir. Bunu yapmak için, bir dizi elektrot sensörünü etkinleştirmek için bir elektrokimyasal çip üretilir ve bir mikroakışkan PDMS çipi üretilir. Mikro hacimli numunelerin girişini kolaylaştırmak için, iki çip birbirine bağlanır ve tek sarmallı DNA probları ile işlevsel hale getirilir.

Hedef tek sarmallı DNA daha sonra DNA hibridizasyonunun üzerine eklenir, negatif yüklü çift sarmallı DNA ile negatif yüklü siyanür Ferris siyanür molekülleri arasındaki daha güçlü itme kuvveti, daha yüksek yük transfer direnci ile sonuçlanır. Sonuç olarak, DNA hibridizasyon olayları, elektrokimyasal empedans spektrumlarındaki değişiklikler ölçülerek tespit edilebilir. Bu tekniğin, bir plaka okuyucu veya J kaydırma testi kullanmak gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, cihazların aynı tekniği düşük numune hacmiyle ve hassasiyet veya özgüllükten ödün vermeden maliyetin çok altında gerçekleştirebilmesidir.

Bu yöntem, hızlı spesifik DNA dizisi taramasını ve tek sarmallı DNA dizilerinin ikili kinetiğinin araştırılmasını sağlayarak kanser araştırmaları, grip tespiti ve genetik mühendisliğindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu hızlı, yüksek verimli DNA hibridizasyon analiz yöntemi, düşük numune hacmiyle ve karmaşık numune hazırlama adımları olmadan gerçekleştirilebildiğinden, bu tekniğin etkileri genetik bozuklukların, çeşitli kanser türlerinin veya grip gibi spesifik DNA belirteçlerine sahip hastalıkların teşhisine kadar uzanır. Genel olarak, yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir çünkü mikro cihazların geliştirilmesi kontrol, işleme parametreleri ve çözelti sızıntısı gibi sorunları çözmek için yinelemeli bir yaklaşım gerektirir.

Cihazın montajından sonra Altın elektrotları elektrokimyasal çip üzerine desenlemek için, cımbızla boş bir birinci sınıf dört inç silikon gofret tutun ve gofretin her iki tarafının yüzeyini aseton, metanol ve ardından izopropanol ile durulamak için bir yıkama şişesi kullanın. Bu işlem bundan sonra deiyonize su akışı altında A MI temizliği olarak anılacaktır. İzopropanolü gofretten durulayın, ardından gofreti kurutmak için bir nitrojen tabancası kullanın.

Gofret'i plazma ile güçlendirilmiş kimyasal buhar biriktirme veya P-E-C-V-D ekipmanına yükleyin. Bir mikrometre kalınlığında bir silikon dioksit asyon tabakası elde etmek için parametreleri girin ve daha sonra otomatik işlemi başlatın, bir DC püskürtme aleti kullanarak gofret üzerine 200 angstrom kalınlığında bir krom tabakası biriktirin, ardından 2000 strom kalınlığında bir altın tabakası biriktirin. Gofret'i bir döndürücüye yükleyin, yüzeyin bir nitrojen tabancasıyla tozunu alın ve bir macun pipeti kullanarak, yaklaşık 1,6 mikrometre kalınlığında tek tip bir film oluşturmak için sıkma PR bir pozitif foto direnç sıkma uygulayın.

Daha sonra gofreti sıcak bir tabakta 100 santigrat derecede bir dakika önceden pişirin. Fotoğraf direncine sahip gofreti maske hizalama ekipmanına yükleyin. Ardından, maske hizalayıcının deklanşörü açacağı ve fotoğraf direncini tasarlanan özelliklere sahip bir maske aracılığıyla ışığa maruz bırakacağı 405 nanometrede santimetre kare başına 190 milijoule'lük bir pozlama başlatın.

Pozlamadan sonra, gofreti 3 5 2 geliştirici içeren bir cam kaba batırın ve hafifçe çalkalayarak 30 saniye inkübe edin. Daha sonra gofreti bir di su akışı altında durulayın ve daha önce olduğu gibi nitrojen tabancasıyla kurulayın. Daha sonra, gofreti altın aşındırma çözeltisi içeren bir cam tabağa daldırın ve hafifçe çalkalayarak 1,5 dakika inkübe edin.

Daha sonra gofreti belirtilen krom içeren bir cam kaba aktarın ve gofret üzerindeki krom izleri kaybolana kadar hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Bu yaklaşık 30 saniye sürmelidir. Gofret'i di su ile durulayın ve nitrojen tabancasıyla kurulayın, gofret'i cımbızla tutun.

Bir MI temizleme prosedürünü kullanarak fotoğraf direncini çıkarın. Daha sonra DI su ile durulayın ve iki kat eldiven giyerek nitrojen tabancasıyla kurulayın. Gofretleri bir dakika boyunca piranha temiz solüsyonu ile bir Teflon tabağa batırın.

Daha sonra gofreti di su ile durulayın ve nitrojen tabancasıyla kurulayın. Platin elektrotları desenlemenin yanında, gofreti bir döndürücüye yükleyin. Bir nitrojen tabancası kullanarak yüzeyin tozunu alın ve bir macun pipeti kullanarak, yaklaşık 1,4 mikrometre kalınlığında düzgün bir film oluşturmak için yüzey dönüşünde PR iki pozitif foto direnç dağıtın.

Gofretleri 100 derecelik sıcak bir tabağa koyun ve bir dakika önceden pişirin. Ön pişirmeden sonra, gofretleri bir fotoğraf maskesi ile santimetre kare 405 nanometre başına 30 milijoule maruz bırakın. Daha sonra gofreti 125 derecelik sıcak bir tabağa koyun ve 45 saniye pişirin.

Maskeyi maskeden, hizalayıcıdan ve taşmadan çıkarın. Gofret'i fotoğraf maskesi olmadan 405 nanometre dalga boyunda santimetre kare başına 1000 milijoule ile ortaya çıkarın. Maruz kaldıktan sonra, gofretini altıya bir Z 400 K geliştirici solüsyonu içeren bir cam kaba daldırarak geliştirin.

Hafifçe çalkalayarak iki dakika inkübe edin. Daha sonra gofreti di su ile durulayın ve nitrojen tabancasıyla kurulayın. Bir E-ışını buharlaştırma sistemi kullanarak, gofret üzerinde 400 angstrom kalınlığında bir titanyum tabakası ve ardından 1600 angstrom kalınlığında bir platin tabakası biriktirin.

Gofretleri asetonla doldurulmuş bir cam tabağa yerleştirin ve fotoğrafı kaldırmak için tabağı beş dakika boyunca ultrasonik bir banyoya koyun. Daha sonra gofreti cımbızla tutmaya direnin. Gofretin her iki yüzeyini de aseton ve ardından izopropanol ile durulamak için bir yıkama şişesi kullanın.

Gofretleri di su ile durulayın ve nitrojen tabancası ile kurulayın. Kalıbı tahlil kanallarına hazırlamak için, dört inçlik boş bir test sınıfı kaliteli silikon gofreti bir MI temizleme prosedürü ile durulayın. Daha önce olduğu gibi, gofretten izopropanolü di su ile durulayın, ardından bir nitrojen tabancası ile kurutun.

Gofret'i bir döndürücüye yükleyin, gofretin yüzeyinin bir nitrojen tabancasıyla tozunu alın ve bir macun pipeti kullanarak, yaklaşık 100 mikrometre kalınlığında tek tip bir film oluşturmak için yüzeye PR üç negatif foto direnç dağıtın. İki aşamalı bir pişirme prosedürü kullanarak önceden pişirmek için gofreti sıcak bir tabağa koyun. İlk olarak, sıcaklığı oda sıcaklığından saatte 300 santigrat derece ile 65 santigrat dereceye yükseltin.

Ardından 65 santigrat derecede 10 dakika tutun. Saatte 300 santigrat derecede 95 santigrat dereceye kadar artırın ve ardından 30 dakika bekleyin. Gofret'i bir fotoğraf maskesi aracılığıyla 405 nanometre dalga boyunda santimetre kare başına 2.500 milijoule ile ortaya çıkarın.

Daha sonra gofreti sıcak bir tabağa koyun ve oda sıcaklığından saatte 300 santigrat derecede 95 santigrat dereceye yükselterek gofreti pişirin. 95 santigrat derecede 10 dakika tutun. Gofret'i propilen glikol, monometil eter asetat veya PGME geliştirici içeren bir cam kaba daldırın ve 10 dakika boyunca gelişmesine izin verin.

Gofret'i izopropanol ile durulayın ve kalıp gofretinin etrafında alüminyum folyo ile bir muhafaza bulmak için tahlil kanalları oluşturmak için bir nitrojen tabancasıyla kurulayın ve kürlenmemiş poli dimetil suboksan veya PDMS'yi kalıbın üzerine yavaşça dökün. Sıcaklığın beş dakika içinde oda sıcaklığından 80 santigrat dereceye yükseldiği ve 17 dakika boyunca 80 santigrat derecede kaldığı iki aşamalı bir pişirme prosedürü kullanarak kalıbı PDMS ile bir kutu fırında pişirin. Kalıp soğuduktan sonra, PDMS'yi kalıptan soyun ve alüminyum folyo üzerine yerleştirin.

Tahlil çiplerini cerrahi bir bıçakla kesin ve burada gösterildiği gibi bir biyopsi delme aletiyle delikler tanımlayın. PDMS tahlil kanallarını elektrokimyasal çip üzerindeki çalışma elektrotlarıyla manuel olarak hizalayın. PDMS, elektrokimyasal çipe iyi yapışır, kanalları kapatır ve sızıntıyı önler.

Dikey mikro kanalları işlevsel hale getirmek için adaptör olarak kısa esnek bir tüp kullanarak esnek boruyu plastik bir dirseğe veya düz konektöre bağlayın. Tek sarmallı DNA probunu içeren bir şırıngayı tüpe bağlayın ve bir şırınga pompasına yerleştirin. Konektörleri, cihazdaki tüm delikli girişlerin her birine takın.

Bu prosedürün en zor yönü, çözeltiyi kabarcıklar oluşturmadan mikro kanallarda akıtmaktır. Başarıyı sağlamak için, çözeltiyi çok yavaş akıtın Kanalın homojen bir şekilde doldurulmasını sağlamak için, üç ayrı mikro kanalın her birini farklı bir tek sarmallı DNA probu inkübasyon çözeltisi ile yavaşça doldurmak için pompayı saatte 200 mikrolitrelik bir akış hızında çalıştırın. Bir saat inkübe ettikten sonra, mikrokanalları PBS ile durulamak için şırınga borusunu ve konektörünü değiştirin, Daha sonra mikrokanalı 10 milimolar PBS 100 milimolar sodyum klorür içinde bir milimolar altı mer CAPTO bir H etanol MCH'den oluşan bir çözelti ile doldurmak için şırınga tüpünü ve konektörlerini değiştirin ve 1.395 milimolar TCEP bir saat inkübe edin.

Daha sonra cımbız kullanmadan önce olduğu gibi PBS ile durulayın. PDMS'yi kaldırın, 90 derece döndürülmüş ve yatay bir yöne yerleştirin. Bu, DNA hibridizasyon analizi için benzersiz bir sayaç ve referans elektrot içeren her sıra ile ayrı reaksiyon odaları sıralarını ortaya çıkaracaktır.

Mikro kanalları Forex konsantre tuzlu sodyum sitrat SSC tamponunun bir kontrol ölçüm çözeltisi ile doldurmak için şırınga borusunu ve konektörleri değiştirin, inkübasyondan sonra 20 dakika inkübe edin, mikro kanalları PBS çözeltisinde beş milimolar Ferris siyanür, beş milimolar Firavun siyanürü ile doldurmak için şırıngayı değiştirin. Ardından, elektrokimyasal empedans spektroskopisi veya EIS ile farklı frekanslar için elektrokimyasal sistemin arka plan empedans değerlerini kaydetmek için, prob uçlarını kullanarak çalışma sayacına ve referans elektrotlarına potansiyel bir stat bağlayın. EIS ölçümünün parametrelerini bilgisayar yazılımına girin ve ardından ölçümü başlatın.

Her ücretsiz ve tamamlayıcı tek sarmallı DNA hedef değişimi için DNA hibridizasyonunu ölçmek için mikro kanallardaki her çalışan elektrot için bu ölçümü tekrarlayın. Şırınga borusu ve konektörü. Mikro kanalları, hedef tek sarmallı DNA'nın bir mikromolarını içeren dört x konsantre bir SSC tamponu ile doldurun ve 20 dakika inkübe edin.

Biyo chipp döngüsel hacmin elektrokimyasal aktivitesini doğrulamak için her hedef tek sarmallı DNA çözeltisi için bilgisayardaki bir yazılımla EIS ölçümünü başlatarak ölçümler yapın. Telemetri ölçümleri, elektroaktif bir redoks ile doldurulmuş mikro kanallarda alınmıştır Burada gösterilen çift siyanür siyanür, dokuz çalışma elektrodunun döngüsel vol telgraflarıdır. Tüm elektrotlar için benzer şekil, tepe yükseklikleri ve tepe ayrımı, biyoçiplerin DNA hibridizasyon olaylarını tespit etme yeteneğini göstermek için yüksek tekrarlanabilirlik gösterir.

Üç tek sarmallı DNA probu ile bunların tamamlayıcı ve ücretsiz tek sarmallı DNA hedefleri arasındaki hibridizasyon olayları için elektrokimyasal empedans varyasyonları ölçüldü; biyosensörün duyarlılığını göstermek için ücretsiz olmayan tek sarmallı DNA hedeflerinin tanıtılmasına kıyasla, ücretsiz tek sarmallı DNA hedefi sokulduğunda ve prob ile hibritlendiğinde daha yüksek yük transfer direnci değişiklikleri gözlendi. Algılama probuna farklı konsantrasyonlarda ücretsiz tek sarmallı DNA hedefi tanıtıldı, burada gösterilen elektrokimyasal empedans spektroskopisi ölçümlerinin bir grafiği, grafik üzerindeki okla gösterilen artan hedef tek sarmallı DNA konsantrasyonlarının tanıtılmasını takiben bir nyquist grafiğidir. Çift sarmallı DNA ile ferro siyanür Ferris siyanür molekülleri arasındaki daha güçlü itme kuvvetleri nedeniyle daha yüksek hedef, tek sarmallı DNA konsantrasyonları için yaklaşık 15 hertz düşük frekanslarda artan empedans değerleri görülmüştür.

Genel olarak, BIOCHIPS, DNA hibridizasyon olaylarının varlığını hızlı bir şekilde algılama yeteneğini gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, bir mikroakışkan elektrokimyasal cihazın nasıl geliştirileceğini ve üretileceğini ve DNA hibridizasyon olaylarını tespit etmek için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben sinyal-hemşire oranı, kararlılık ve hassasiyet gibi çeşitli bios parametrelerini optimize etmeyi unutmamak önemlidir.

DNA mutasyonu, kombinasyonu ve rekabet gibi ek soruları yanıtlamak için biraz farklı nükleik asit dizilerine sahip tek sarmallı DNA hedeflerinin tanıtılması gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Mikro fabrikasyon proses çözümleriyle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken vücut göz ve el korumasının her zaman uyarması gerektiğini unutmayın.