Name: Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Öğrenin, kemirgen lenf düğümü stromal hücrelerini izole etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırma yöntemlerini. Bu teknik, hücre canlılığını ve yüzey belirteci ifadesini koruyarak immünolojik araştırmalar için standart bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, mevcut lenf nodu sindirim protokolünün oluşturulmasındaki yararlı tartışmalar için Sanjiv Luther ve meslektaşlarına teşekkür eder. Bu çalışma, SNF hibeleri PPOOA-_119204 ve SWR'ye PPOOP3_144918 tarafından desteklenmiştir.

Bu görüntü yayını ve protokol, tüm hayvan prosedürleri Kanton Kurumu, Basel-Stadt, İsviçre tarafından onaylanan hayvan protokole uygun olarak yapılmıştır. 1. Lenf düğümleri Hazırlama ve Sindirim <ol><li> Isıtma plakası ile bir manyetik karıştırıcı üzerinde 37 ° C bir cam kapta Ön-ısıtma su. </li><li> Aşağıdaki gibi temel Orta hazırlayın: DMEM ortamı (piruvat olmadan),% 2 FCS ile takviye edilmiş, 1.2 mM CaCl2 ve pen / strep (penisilin 100 birim, streptomisin, 100 ug). </li><li> Kullanmadan önce tüm diseksiyon aletleri sterilize edin. </li><li> CO 2 boğulma başına lenf nodu donör fareler Euthanize ve aseptik lenf düğümleri teşrih. Çevreleyen yağ teşrih etmeyin. NOT: Bu protokol periferik cilt-lenf düğümünde (inguinal, brakiyal, aksiller) için optimize edilmiştir. </li><li> 2 ml buz soğukluğunda bazik ortam ihtiva eden steril bir Petri kabı, lenf düğümleri yerleştirin. </li><li> Lenf nodu ca Disrupt1 ml şırınga sabit iki 25 G iğne kullanılarak psule. </li><li> 1 mg / ml kollajenaz IV, 40 ug / ml DNAz I ile takviye edilmiş 750 ul Temel ortamı içeren 5 ml&#39;lik bir polipropilen yuvarlak dipli tüp içinde kesintiye lenf nodu doku aktarın </li><li> Her bir tüp bir manyetik karıştırıcı, steril ekleyin. </li><li> 37 ° C ile çanak içinde yer tüpün artık su ısıtılır ve 30 dakika boyunca yavaş bir hızda (1 tur / sec) tüplerini karıştırın. </li><li> Isıtma plakası ile manyetik karıştırıcı gelen tüp çıkarın ve lenf nodu fragmanları halledelim. </li><li> Dikkatle &quot;non-stromal hücre&quot; zenginleştirilmiş süpernatant kaldırmak. NOT: T, B, dendritik hücreler ve CD45 analizi ise - gp38 - CD31 - öngörülen, &quot;non-stromal hücreler&quot; kısmını kaydedin. </li><li> Yıkama 750 ul ortam maddesi ile bazik lenf düğümü dokusu kalmıştır. NOT: Bu adım, bağışıklık yetkin fareler ile çalışan sadece gereklidir. </li><li> Lenf nodu fragmanları halledelim. </li><li> Kaldırolmayan stromal hücre-yüzen fraksiyonu. </li><li> 750 ul temel orta 3,5 mg ile takviye lenf nodu fragmanları Ekle / ml kollajenaz D ve 40 ug / ml Dnase I. </li><li> Lütfen 37 ° C de içeren beher içinde yer tüpün artık su ısıtılır. </li><li> Yavaş yavaş karıştırılırken buna 5 dakika boyunca lenf nodu dokusu Digest. </li><li> Pipetleme ve çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 10 döngü boyunca 700 ul karıştırılarak Ayrık lemf nod dokusu parçalan olabilir. NOT: Bu sindirim geliştirmek için lenf nodu doku bozar. </li><li> 37 ° C&#39;ye ısıtılmış su ile tekrar beher tüpü yerleştirin. </li><li> Yavaş yavaş karıştırılırken buna 10 dakika daha Özet lenf nodu dokusu parçalan olabilir. </li><li> Pipetleme lemf nod dokusu parçaları parçalamak ve bir çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 99 çevrim için karıştırılması. </li><li> Tek bir hücre süspansiyonu bakımı için, 0.5 M EDTA, 7.5 ul ekleyin. </li><li> Boru itibariyle ayrılmış lemf nod dokusu parçalantting ve çok kanallı otomatik pipet kullanılarak maksimal hızda, 99 çevrim için karıştırılması. </li><li> 750 ul temel orta ekleyin ve 70 mikron naylon örgü ile hücrelere geçerler. </li><li> Santrifüj Hücre süspansiyonu 1500 xg&#39;de 5 dakika, 4 ° C. </li><li> Stromal hücreler, bundan başka analizler için de kullanılabilir. </li></ol> Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin 2. Boyama <ol><li> Başarılı bir şekilde TRC LEC BEC DN hücreleri tanıyan anti-CD45, anti-podoplanin (gp38), anti-CD31 antikorlarının bir kombinasyonu kullanılır. </li><li> Anti-gp38-PE (1: 200), anti-CD31-APC (1: 200), 100 ul HBSS içinde 2 ihtiva eden: Canlı / Ölü izleyici, bir anti-CD45-FITC (200 1) ile sindirilmiş lenf düğümü dokusu inkübe karanlıkta en az 20 dakika, 4 ° C,% FCS için. </li><li> % 2 FCS ihtiva eden HBSS 500 eklenmesinin Hücreleri yıkamak </li><li> Santrifüj Hücre süspansiyonu 1500 xg&#39;de 3 dakika, 4 ° C. </li><li> % 2 FCS içeren HBSS 100 ul yeniden askıya. </li><li> Equipp bir akış sitometresinde boyalı hücrelerin çalıştırınAşağıdaki optik ile ed: uyarma kadar üç lazer ile kaynak: mavi (488 nm, hava soğutmalı, 20 mW katı hal), kırmızı (633 nm, 17 mW HeNe), mor (405 nm, 30 mW katı hal) . </li><li> Kapısı CD45 - hücreler hematopoietik hücreleri hariç. </li><li> Kapısı mayoları (FSC-W) ve canlı hücreleri (CANLI / DEAD izci) ikilileri ve ölü hücreleri hariç. </li><li> , LEC (gp38 + CD31 +), BEC (gp38 - CD31 +) ve DN (gp38 - CD31 -) hücreleri (Şekil 1) - CD31 vs Arsa gp38 TRC (gp38 + CD31) görselleştirmek için. </li></ol>

<ol><li>Mueller, S. N., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+stroma+in+the+initiation+and+control+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses.</a> Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).</li>
<li>Roozendaal, R., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Cell+-+Immune+Cell+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stromal Cell - Immune Cell Interactions.</a> Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).</li>
<li>Turley, S. J., Fletcher, A. L., Elpek, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stromal+and+haematopoietic+antigen-presenting+cells+that+reside+in+secondary+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (12), (2010).</li>
<li>Bajénoff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell+networks+regulate+lymphocyte+entry%2C+migration%2C+and+territoriality+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes.</a> Immunity. 25 (6), 989-1001 (2006).</li>
<li>Katakai, T., Hara, T., Sugai, M., Gonda, H., Shimizu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+construct+the+stromal+reticulum+via+contact+with+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells construct the stromal reticulum via contact with lymphocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 200 (6), 783-795 (2004).</li>
<li>Link, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+in+lymph+nodes+regulate+the+homeostasis+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells in lymph nodes regulate the homeostasis of naive T cells.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1255-1265 (2007).</li>
<li>Malhotra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+stroma+from+inflamed+and+resting+lymph+nodes+defines+immunological+hallmarks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of stroma from inflamed and resting lymph nodes defines immunological hallmarks.</a> Nature Immunology. 13 (5), 499-510 (2012).</li>
<li>Gretz, J. E., Norbury, C. C., Anderson, A. O., Proudfoot, A. E., Shaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph-borne+chemokines+and+other+low+molecular+weight+molecules+reach+high+endothelial+venules+via+specialized+conduits+while+a+functional+barrier+limits+access+to+the+lymphocyte+microenvironments+in+lymph+node+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph-borne chemokines and other low molecular weight molecules reach high endothelial venules via specialized conduits while a functional barrier limits access to the lymphocyte microenvironments in lymph node cortex.</a> The Journal of experimental medicine. 192 (10), 1425-1440 (2000).</li>
<li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conduit+system+transports+soluble+antigens+from+the+afferent+lymph+to+resident+dendritic+cells+in+the+T+cell+area+of+the+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The conduit system transports soluble antigens from the afferent lymph to resident dendritic cells in the T cell area of the lymph node.</a> Immunity. 22 (1), 19-29 (2005).</li>
<li>MartIn-Fontecha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dendritic+cell+migration+to+the+draining+lymph+node%3A+impact+on+T+lymphocyte+traffic+and+priming%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Regulation of dendritic cell migration to the draining lymph node: impact on T lymphocyte traffic and priming.</a> The Journal of experimental medicine. 198 (4), 615-621 (2003).</li>
<li>Luther, S. A., Tang, H. L., Hyman, P. L., Farr, A. G., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+of+the+chemokines+ELC+and+SLC+by+T+zone+stromal+cells+and+deletion+of+the+ELC+gene+in+the+plt%2Fplt+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Coexpression of the chemokines ELC and SLC by T zone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (23), 12694-12699 (2000).</li>
<li>Braun, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Afferent+lymph-derived+T+cells+and+DCs+use+different+chemokine+receptor+CCR7-dependent+routes+for+entry+into+the+lymph+node+and+intranodal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Afferent lymph-derived T cells and DCs use different chemokine receptor CCR7-dependent routes for entry into the lymph node and intranodal migration.</a> Nature Immunology. 12 (9), 879-887 (2011).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+isolation+of+lymph+node+stromal+cells+reveals+site-dependent+differences+in+fibroblastic+reticular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Reproducible isolation of lymph node stromal cells reveals site-dependent differences in fibroblastic reticular cells.</a> Frontiers in immunology. 2, 35(2011).</li>
<li>Lukacs-Kornek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+release+of+nitric+oxide+by+nonhematopoietic+stroma+controls+expansion+of+the+activated+T+cell+pool+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulated release of nitric oxide by nonhematopoietic stroma controls expansion of the activated T cell pool in lymph nodes.</a> Nature Immunology. 12 (11), 1096-1104 (2011).</li>
<li>Siegert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+from+lymph+nodes+attenuate+T+cell+expansion+by+producing+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells from lymph nodes attenuate T cell expansion by producing nitric oxide.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27618(2011).</li>
<li>Khan, O., Headley, M., Gerard, A., Wei, W., Liu, L., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+priming+by+lymphoid+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell priming by lymphoid stroma.</a> PLoS ONE. 6 (11), e26138(2011).</li>
<li>Svensson, M., Maroof, A., Ato, M., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+direct+local+differentiation+of+regulatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stromal cells direct local differentiation of regulatory dendritic cells.</a> Immunity. 21 (6), 805-816 (2004).</li>
<li>Onder, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-specific+lymphotoxin-%CE%B2+receptor+signaling+is+critical+for+lymph+node+and+high+endothelial+venule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-specific lymphotoxin-β receptor signaling is critical for lymph node and high endothelial venule formation.</a> The Journal of experimental medicine. 210 (3), 465-473 (2013).</li>
<li>Fletcher, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+fibroblastic+reticular+cells+directly+present+peripheral+tissue+antigen+under+steady-state+and+inflammatory+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node fibroblastic reticular cells directly present peripheral tissue antigen under steady-state and inflammatory conditions.</a> The Journal of experimental medicine. 207 (4), 689-697 (2010).</li>
<li>Fletcher, A. L., Malhotra, D., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+stroma+broaden+the+peripheral+tolerance+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node stroma broaden the peripheral tolerance paradigm.</a> Trends in Immunology. 32 (1), 12-18 (2011).</li>
<li>Cohen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node-resident+lymphatic+endothelial+cells+mediate+peripheral+tolerance+via+Aire-independent+direct+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).</li>
<li>Lee, J. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+antigen+display+by+lymph+node+stroma+promotes+T+cell+tolerance+to+intestinal+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral antigen display by lymph node stroma promotes T cell tolerance to intestinal self.</a> Nat Immunol. 8, 181-190 (2006).</li>
<li>Nichols, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+self-tolerance+to+a+melanocyte%2Fmelanoma+antigen+derived+from+tyrosinase+is+mediated+by+a+radio-resistant+cell+in+peripheral+and+mesenteric+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Deletional self-tolerance to a melanocyte/melanoma antigen derived from tyrosinase is mediated by a radio-resistant cell in peripheral and mesenteric lymph nodes.</a> J Immunol. 179, 993-1003 (2007).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletional+tolerance+mediated+by+extrathymic+Aire-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Deletional tolerance mediated by extrathymic Aire-expressing cells.</a> Science. 321, 843-847 (2008).</li>
<li>Gardner, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+Aire-expressing+cells+are+a+distinct+bone+marrow-derived+population+that+induce+functional+inactivation+of+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Extrathymic Aire-expressing cells are a distinct bone marrow-derived population that induce functional inactivation of CD4+ T cells.</a> Immunity. 39, 560-572 (2013).</li>
<li>Magnusson, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+presentation+of+antigen+by+lymph+node+stromal+cells+protects+against+CD8+T-cell-mediated+intestinal+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Direct presentation of antigen by lymph node stromal cells protects against CD8 T-cell-mediated intestinal autoimmunity.</a> Gastroenterology. 134, 1028-1037 (2008).</li>
<li>Tewalt, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+endothelial+cells+induce+tolerance+via+PD-L1+and+lack+of+costimulation+leading+to+high-level+PD-1+expression+on+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells.</a> Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Lenf nodu stromal hücrelerin çalışması nedeniyle son zamanlarda yayımlanmış iki sindirim protokolleri 6,13 gelişimine bir araştırma odağı haline geldi. Her iki protokol tek bir lenf düğümü stromal hücreler elde etmek için yeterli, ancak sindirim enzimlerinin kullanılması ve sindirim zaman içinde farklılık gösterir. Stromal hücreler ve onların yüzey belirteçleri enzimatik sindirim ve mekanik strese karşı hassas olduğu için, optimize edilmiş bir protokol gereklidir. Taze kesilmiş le...

Lenf düğümleri, yabancı ve öz-antijenlere karşı adaptif immün yanıtları başlatılan ve koordine özelleşmiş bölmeleri bulunmaktadır. Burada sunulan prosedür lenf düğümü, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek ve çeşitli moleküllerinin yüzey ekspresyonunu korumak uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin erişmek için kullanılan otomatik mekanik pipetleme ile birlikte kısa bir enzimatik sindirim açıklanmaktadır. Lenf nodu stromal hücre üç önemli fonksiyonları lenf nodu iskele oluşturacak ve yerine: ilk onlar vücut sıvıları antijenleri, patojenleri ve onların patojen ilişkili moleküler pattern (PAMP) yanı sıra, sitokinler ve tehlike ilişkili moleküler model örnek filtre (Damps) mevcut Vücutta. İkincisi, etkileşim ve adaptif immün yanıtları başlatmak için antijen sunan hücreler (APC) ve lenfositler çekmek ve talimat; ve üçüncüsü, lenfosit 1 homeostası farklılaşması için yapısal bir ortam sağlamak-3. Inflamasyon lenf düğümü, stromal hücreleri büyüme faktörleri, sitokinler ve kemokinlerin üretimi sırasında, dendritik hücreler (DCler) arasındaki etkileşimi düzenlemek ve böylece, T-ve B-hücrelerinin adapte şişme. Bağışıklık tepkilerinin düzenleme, farklı stromal hücre popülasyonları tarafından meydana getirilen kompleks yapısal mimarisine mümkündür. Lenf nodülü hücreleri, stromal, CD45 negatif hücrelerdir ve fibroblastik ve endotel hücreleri 1 -6 &#39;de CD31 ile gp38 ifadesi ya da ayırt edilebilir. CD31 + kan endotel hücreleri tanımlar (BEC) -, gp38 + CD31 + lenfatik endotel hücreleri (LIK), gp38 tanımlar: - Gp38 + CD31 (fibroblastik retikulum hücreleri de FRC olarak bilinen TRC) T bölgesi retiküler hücreleri tanımlar. Bundan başka, alt-popülasyonlarının tanımlanması diğer lenf nodu stromal hücrelerin varlığını ortaya çıkarmıştır. Gerçekten de, küçük bir perisit benzeri hücre popülasyonu içinde karakterize edilmiştirgp38 - CD31 - nüfus 7. Bu nedenle, izolasyon prosedürü adaptasyonu farklı lenf düğümü stromal hücrelerin fonksiyonel özelliklerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için avantajlıdır. Lenf düğümü hücreleri, stromal sindirim geliştirilmesi önce lenf düğümü stromal hücrelerin doku çalışma bölümü ve mikroskopi kullanılarak yerinde gözlemlerle sınırlıydı protokolleri. Bununla birlikte, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar lenf düğümü stromal hücrelerin önemli özellikleri gösterdi. Lenf nodülü hücreleri, stromal yüksek endotelial lenf nodu subkapsüler sinüs lenf ve ilgili-düşük molekül kütlesi, protein nakil kanal sistemi olarak adlandırılan karmaşık bir 3 boyutlu bir yapı oluşturmak üzere podoplanin, kolajen ve hücre dışı matris (ECM), proteinleri ile ilişkili T hücreleri bölgesinde 8 Venüller. DCler, stroma hücreleri ile yakın temas halinde olan ve boru şeklindeki con içine uzanan gözlemlenebilirDuit yapısı sıvı örneklemek ve antijenleri 8 algılamak için. DCler ile lenf düğümü stromal hücreler (Kızılay ve LECS) etkileşimi, kemokinler CCL21 ve CCL19 9,10 serbest bırakılması ve sunum aracılık eder. CCL19 ve CCL21 lenf nodu T hücre bölgesine 4,11 göç etmek DH&#39;leri ve T hücrelerini kolaylaştırılması CCR7 reseptörü tarafından tanınır. Benzer kemokinlerle kullanarak rağmen, DC&#39;ler ve T hücreleri lenf düğümlerine 12 içine farklı göç yolları var. Daha sonra, lenf düğümü ve saf lenf düğümü stromal hücrelerin izolasyonu enzimatik sindirim kullanılarak, fonksiyonel çalışmalar çeşitli lenf nodu stromal hücrelerin rolü DC&#39;ler ve T / B hücreleri 6,13 ile etkileşim yetenekleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. İlk olarak, IFN-γ üreten efektör T hücrelerinin ve lenf düğümü stromal hücreler arasındaki karışma, ikincil lenfoid organların 14-16 T hücre yanıtları ve çoğalmasını azaltmak için gösterilen metabolit nitrik oksit üretimini indükler. İkinci olarak, lenf Kgazel stromal hücreler, IL-10, 17 üretimi ile düzenleyici DC alt kümelerinden farklılaşmasını desteklemek için ve IL-7 6,18 üretilmesi yoluyla saf T hücre homeostazının modüle bildirilmiştir. Üçüncü olarak, lenf düğümü stromal hücrelerde TLR sentezleme stromal hücreler, doku yaralanması sırasında ortaya çıkan bir enfeksiyon ya da kendi kendini moleküllerden türetilmektedir sinyale duyarlı olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, TLR3 poli ligandla lenf düğümü stromal hücrelerin tedavisi (I: C) ile sonuçlanan büyük histo-uyumluluk kompleksi sınıf I ve eş-ifade önleyici molekülün PD-L1 upregülasyonu mütevazı bir düzenlenişini uyarmaktadır değil, birlikte uyaran moleküllerin periferal dokuda dramatik değişiklikler ifadesini 19 antijenleri. Çeşitli gruplar, lenf düğümü, stromal hücreleri periferal doku antijenleri ifade eder ve kendinden reaktif T hücrelerinin 19,21-27 indüklenmesidir göstermiştir. Bu nedenle, lenf düğümü hücreleri ve diğer göçmen ve yeniden arasındaki etkileşimleri anlamaksident lenf düğümü hücreleri iltihap sırasında aktivasyonu ya da bağışıklık tepkilerinin bastırılması sağlamak için yeni bir hedef moleküller bulmak için yardımcı olacaktır. Bu nedenle, lenf düğümü yayınlanmış enzimatik ayırma uygulanması gereklidir. Daha önce yayınlanmış protokoller düşük mekanik stres 6,19,20 ile kollajenaz tabanlı enzimatik sindirim farklı kombinasyonları kullanın. Bununla birlikte, sindirim enzimlerinin veya sindirim enzim farklı bir kombinasyonu ile uzun inkubasyon aktivasyon durumunu analiz etmek ve yeni lenf nodu stromal hücreleri tanımlamak için gereken çeşitli yüzey molekülleri düşürebilir. Stromal hücre analiz türüne bağlı olarak, bağlantı veya Protokol Protokol Fletcher daha uygun olabilir. Tarif edilen prosedürde, biraz daha kısa bir enzimatik sindirim uygun bir lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey işaretleyici zararın en aza düşürülmesi için otomatik mekanik ayrıştırma ile bir araya getirilmektedir. Bu işlem, yüksek ölçüde tekrarlanabilir ayrılmasını sağlayan vedüşük değişkenlik ve% 95 daha fazla canlılığı ile lenf nodu stromal hücre popülasyonlarının ayrım. Taze olarak izole edilen lenf nodülü hücreleri, stromal, doğrudan in vitro fonksiyonel deneyleri gerçekleştirmek için, stromal hücreleri hatlarının yüzey markeri ekspresyonu, protein analizi ve transkripsiyon çalışmalar, hem de kurulması için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>LifeTechnologies-Gibco</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td></td><td></td><td>Nihai konsantrasyon% 2</td></tr> <tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>499609</td><td>Nihai konsantrasyon 1.2 mM</td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td></td><td>> mg kuru ağırlık başına 160 birim, 1 mg / ml nihai konsantrasyonda kullanın</td></tr><tr><td>Kollajenaz D</td><td>Roche 11088882001</td><td></td><td>3.5 mg / ml</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche&nbsp'de kullanın;</td><td>40 &</td><td>mikroda 11284932001 kullanım; g/ml</td></tr><tr><td>Karıştırma mıknatısları</td><td>FAUST</td><td></td><td>5 mm uzunluğunda-2 mm &oslash;</td></tr><tr><td>Polistiren yuvarlak tabanlı tüpler 5 ml</td><td>Falcon-BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isıtma fonksiyonlu manyetik karıştırıcı</td><td>IKA-RCT standardı</td><td>9720250</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları 100 mm, steril</td><td>TPP</td><td>6223201</td><td></td></tr><tr><td>25 G iğneler</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti fare CD45 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klon 30-F11</td></tr><tr><td>anti fare CD11c Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klonu N418</td></tr><tr><td>anti fare Podoplanin Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klonu 8.1.1</td></tr><tr><td>anti fare CD31 Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klonu MEC13.3</td></tr><tr><td> Eppendorf Xplorer plus, Çok Kanallı</td><td>Eppendorf</td><td>4861 000.821/830</td><td>1.250 & mikro; hacim</td></tr><tr><td>anti fare CD140a</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klonu APA5</td></tr><tr><td>anti fare CD80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klonu 16-10A1</td></tr><tr><td>anti fare CD40</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klonu 1C10</td></tr><tr><td>anti fare I-Ab</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klonu AF6-120.1</td></tr><tr><td>anti fare CD274 (PD-L1)</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Klonu 10F.9G2</td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Düzeltilebilir Yakın IR Ölü Hücre boyama kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr></tbody></table>

kemirgen lenf düğümü stromal hücrelerinin İzolasyonu

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Lenf nodlarını içeren sekonder lenfoid organlar, lenfositlerin homeostazı, aktivasyonu ve farklılaşması için yapısal bir ortam sağlayan stromal hücrelerden oluşur. Adezyon molekülü CD31 ve glikoprotein podoplanin (gp38), T zonu retiküler hücreleri veya fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik endotel hücreleri, kan endotel hücreleri ve çift negatif hücre popülasyonu içinde FRC benzeri perisitlerin ekspresyonu ile çeşitli stromal hücre alt kümeleri tanımlanmıştır. Tüm popülasyonlar için, farklı bölmelerin ayrılması ve astarlanması, farklı hücre tiplerinin çekilmesi ve bunlarla etkileşimi, drenaj akışkanlarının filtrasyonu ve lenfatik damarların kasılması dahil olmak üzere farklı işlevler tanımlanmıştır. Son yıllarda, farklı gruplar, konakçı için potansiyel olarak tehlikeli olan sitotoksik T hücresi yanıtlarını düzenlemede ve düzenlemede stromal hücrelerin ek bir rolünü tanımlamışlardır. 
Lenf düğümleri, birçok farklı hücre tipine sahip karmaşık yapılardır ve bu nedenle istenen hücre popülasyonlarının izolasyonu için uygun bir prosedür gerektirir. Şu anda, lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu için protokoller, değişen inkübasyon süreleri ile enzimatik sindirime dayanmaktadır; Bununla birlikte, stromal hücreler ve yüzey molekülleri bu enzimlere duyarlıdır, bu da yüzey işaretleyici ekspresyonunun kaybına ve hücre ölümüne neden olur. Burada, yüzey molekülü ekspresyonlarını koruyarak canlı tek hücrelerin süspansiyonu, lenf nodu stromal hücrelerinin süspansiyonu elde etmek için otomatik mekanik bozulma ile birleştirilmiş kısa bir enzimatik sindirim protokolü önerilmektedir.

Mevcut protokol nedeniyle bir çok kanallı otomatik pipet ile mekanik çözümlemesiyle kısa bir sindirim süre (45 dk maksimum) ile Bağlantı ve ark., 6, 2007 tarafından yayınlanan bir modifiye sindirim protokoldür. Buna ek olarak, işlem, daha standart, farklı lenf düğümü stromal hücrelerin yüzey markerlerinin bozulmasını en aza indiren ve aynı anda birden fazla numunenin kullanılması mümkün olur. Collagenasein IV ve Kollagenaz D Fletchers protokolünde 13 Bağlantıla...

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Bu prosedürün genel amacı lenf nodu stromal hücrelerini izole etmektir. Bu, önce lenf nodu kapsülünün bozulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci aşamada, lenf nodu parçaları kollajenaz dört ve D naz bir ile sindirilir.Enzimler daha sonra kollajenaz D ve D naz bir ile değiştirilir ve fragmanlar otomatik çok kanallı bir pipet ile mekanik olarak ayrıştırılır. Sonuçta, izole edilmiş lenf nodu hücrelerinin hücre yüzey molekülü ekspresyonu akış sitometrisi ile karakterize edilebilir. Bu tekniğin mevcut yönteme göre en büyük avantajı, bu yöntemle lenf nodu SHR hücrelerinin, hücrelerin canlılığını ve yüzey molekülü ekspresyonunu koruyan mekanik ayrıştırma ile tamamlanan standart bir enzimatik prosedür kullanılarak sindirilmesidir.Diseke edilmiş lenf düğümlerini iki mililitre buz gibi soğuk ortam içeren steril bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. Ardından, lenf nodu kapsüllerini bozmak için 25 gauge iğnelerle donatılmış iki adet bir mililitrelik şırınga kullanın. Daha sonra, bozulmuş dokuyu 750 mikrolitre ortam içeren beş mililitrelik konik bir tüpe aktarın, kollajenaz dört ve DNA bir ve manyetik bir karıştırma ile desteklenmiştir.Daha sonra tüpü manyetik bir karıştırıcı üzerinde önceden ısıtılmış 37 santigrat derece su içeren bir behere yerleştirin ve hücre bulamaçlarını 30 dakika boyunca saniyede bir tur karıştırın. Karıştırdıktan sonra, lenf nodu parçasının çökmesine izin verin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın. Şimdi stromal olmayan hücreler için zenginleştirilmiş, lenf nodu fragmanlarına 750 mikrolitre taze ortam aktarın, kollajenaz D ve D naz ile desteklenmiş ve daha sonra dokuyu 37 santigrat derecede beş dakika daha karıştırın.Daha sonra, lenf nodu doku parçalarını 700 mikrolitrelik bir hacimde maksimum hızda 10 döngü boyunca ayırmak için otomatik çok kanallı bir pipet kullanın ve ardından doku parçalarını 10 dakika sonra tekrar karıştırın. Ayrıca, doku kümelerini otomatik çok kanallı pipet ile maksimum hızda 99 döngü boyunca ayırın. Daha sonra tüpe 7,5 mikrolitre 0,5 molar EDTA ekleyin ve doku süspansiyonunu otomatik pipet ile 99 döngü daha karıştırın.Son ayrıştırma döngüsünden sonra, hücre çözeltisine 750 mikrolitre ortam ekleyin ve hücreleri 70 mikrometrelik bir naylon ağdan süzün. Daha sonra hücreleri 1500 Gs ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca peletleyin. Lenf nodu stromal hücre popülasyonlarını akış sitometrisi ile görselleştirmek için, uygun hücre örneklerini canlı ölü izleyici ve ilgilenilen antikorları karanlıkta dört santigrat derecede en az 20 dakika boyunca% 2 FCS içeren 100 mikrolitre HBSS ile boyayın.Daha sonra hücreleri 500 mikrolitre HBSS'de FCS ile yıkayın ve tekrar süspanse edin. 100 mikrolitre HBSS ve FCS'deki peletler, hematopoietik hücreleri dışlamak için CD 45 pozitif hücreleri dışarı atan bir akış sitometresi üzerinde hücreleri çalıştırır, daha sonra canlı singlet popülasyonu üzerinde yürür. Son olarak, T bölgesi retiküler hücrelerini, lenfatik endotel hücrelerini, kan endotel hücrelerini ve çift negatif hücreleri görselleştirmek için GP 38'e karşı CD 31'i çizin.Hücre popülasyonları. Lenf nodu stromal hücre alt kümelerinin sindiriminden sonra geri kazanılan toplam hücre sayısı, az önce gösterilen protokolde, bağlantı ve Fletcher protokollerine kıyasla biraz daha yüksekti ve bu protokol ile izolasyondan sonra lenf nodu stromal hücrelerinin canlılığının, yayınlanmış protokoller kullanılarak kurtarılana benzer olduğunu gösterdi. Bu ve bağlantı yoluyla izole edilen T bölgesi retiküler hücreleri ve lenfatik endotel hücreleri ve Fletcher protokolleri IAB, CD bir, CD 40, CD 80, PD L one ve CD 40 ekspresyonu için karşılaştırıldı.Beş yüzey molekülünün tümünün ekspresyonu, her iki stromal hücre alt kümesi için az önce gösterilen protokol ve bağlantı protokolü ile sindirim üzerine daha yüksekti, bu da bazı yüzey moleküllerinin kollajenaz dört ve D tarafından bozunmasının, kollajenaz p ve DYS uzayından daha az sağlam olduğunu düşündürdü. Bu videoyu izledikten sonra, lenf nodu stroma hücrelerinin dört ana alt popülasyonunu başarılı bir şekilde izole ederken, daha fazla karakterizasyon ve analiz için yararlı olan birkaç yüzey molekülünün ekspresyonunu nasıl koruyacağınızı iyi anlamış olmalısınız.

isolation-of-murine-lymph-node-stromal-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Miltenyi MAC kiti kullanılarak lenfositlerin İzolasyon tüm lenfoid doku homojenatlarında hücreleri arındırmak için güvenilir bir yol. Miltenyi sistemini kullanarak saflaştırılmış Hücreler genellikle ≥% 96 saf. Burada, CD4 + T hücreleri, Miltenyi tarafından sunulan birçok kitleri biri izole etmek için atılan adımları göstermektedir.

CD4 İzolasyon Miltenyi MACS Arıtma Fare lenf düğümleri + T hücreleri

Fare genital lenfosit yalıtmak için verimli bir şekilde tarif edilmiştir. Bu yöntem verimli izolasyonu sağlamak için enzim sindirim ve Percoll degrade ayrılık yararlanır. Bu teknik, diğer tür kullanım için de...

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Diğer T hücresi alt kümelerinin farklı efektör işlevleri ile, Th17 hücreleri merkezi inflamatuar otoimmün implike edilmiştir. Bu in vitro Th17 farklılaşma protokolü naif CD4 + T lenfositleri Th17 hücrelerine ayırt edebilir, ve daha fazla otoimmün ve konak cevabı rollerini incelemek belirlemek için bir araç sağlar.

İzolasyon ve naif CD4 T Lenfositler Th17 Farklılaşma

Lenf nodu stromal hücre orijininin incelenmesi için lenf nodu/yağ yastığı kimeralarının oluşturulması anlatılmaktadır. Yöntem, yeni doğan farelerden ve embriyonik yağ yastıkçıklarından lenf düğümlerinin izolasyonunu, kimerik lenf nodu yağ yastıkçıklarının oluşturulmasını ve bunların bir konakçı farenin böbrek kapsülü altına transferini içerir.

Lenf düğümü Stromal Hücre Menşe Çalışmaları Lenf-yağ Pad Kimeralar Üretimi

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Bağırsak lenfositlerinin kantitatif karakterizasyonuna, bu hücrelerin çeşitli bağırsak ve sistemik hastalıklarda kritik bir rol oynadığının giderek daha fazla tanınması nedeniyle artan bir ilgi vardır. Bu protokolde, sonraki akış sitometrik karakterizasyonu için tek hücreli popülasyonların farklı ince bağırsak bölmelerinden nasıl izole edileceğini açıklıyoruz.

Fare Küçük Bağırsak Lenfositler izolasyonu ve Akım Sitometrisi Karakterizasyonu

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Burada biz lenfositler gut ilişkili lenfoid doku Peyer's yamalar ve boşaltma Mezenterik lenf düğümleri de dahil olmak üzere İndüktif sitelerinden ve lamina propria dahil efektör mekanları ekran koruyucu yalıtım için detaylı bir protokol tanımlamak ve bağırsak epitel küçük bağırsak bağışıklık sisteminin.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Bu makale, murin endotel hücrelerinin dermal lenfatik kılcal damarlardan manyetik boncuk bazlı izolasyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. İzole edilmiş lenfatik endotel hücreleri, aşağı akış in vitro deneyler ve protein ekspresyon analizi için kullanılabilir.

Murin Dermal Lenfatik Endotel Hücre İzolasyonu

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Bu protokol, mezenterik lenf düğüm zinciri boyunca dört istasyonun her biri için güvenli ve iyi tolere edilen fare mezenterik lenfadenektomyatı için bir hayatta kalma prosedürünü tanımlar. Bu prosedür, distal kolon, proksimal kolon ve/veya ince bağırsak ile lenfatik iletişimin seçici olarak bozulmasına olanak tanıyacak şekilde uyarlanabilir.

Bölgeye Özgü Bağırsakla Lenfatik İletişimin Seçici Bozulması İçin Molin Mezenterik Lenfadenektomi

Öğrenin, kemirgen lenf düğümü stromal hücrelerini izole etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırma yöntemlerini. Bu teknik, hücre canlılığını ve yüzey belirteci ifadesini koruyarak immünolojik araştırmalar için standart bir yaklaşım sunar.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Daha fazla video keşfet