Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Lenf nodu stromal hücrelerinin izolasyonu, fibroblastik retiküler hücreler, lenfatik ve kan endotel hücreleri elde etmek için enzimatik sindirim ve mekanik ayrıştırmayı içeren çok aşamalı bir prosedürdür. Tarif edilen prosedürde, canlı lenf nodu stromal hücrelerinin yüzey işaretleyici bozulmasını en aza indirmek için kısa bir sindirim otomatik mekanik ayrıştırma ile birleştirilir.

Bu prosedürün genel amacı lenf nodu stromal hücrelerini izole etmektir. Bu, önce lenf nodu kapsülünün bozulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci aşamada, lenf nodu parçaları kollajenaz dört ve D naz bir ile sindirilir.

Enzimler daha sonra kollajenaz D ve D naz bir ile değiştirilir ve fragmanlar otomatik çok kanallı bir pipet ile mekanik olarak ayrıştırılır. Sonuçta, izole edilmiş lenf nodu hücrelerinin hücre yüzey molekülü ekspresyonu akış sitometrisi ile karakterize edilebilir. Bu tekniğin mevcut yönteme göre en büyük avantajı, bu yöntemle lenf nodu SHR hücrelerinin, hücrelerin canlılığını ve yüzey molekülü ekspresyonunu koruyan mekanik ayrıştırma ile tamamlanan standart bir enzimatik prosedür kullanılarak sindirilmesidir.

Diseke edilmiş lenf düğümlerini iki mililitre buz gibi soğuk ortam içeren steril bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. Ardından, lenf nodu kapsüllerini bozmak için 25 gauge iğnelerle donatılmış iki adet bir mililitrelik şırınga kullanın. Daha sonra, bozulmuş dokuyu 750 mikrolitre ortam içeren beş mililitrelik konik bir tüpe aktarın, kollajenaz dört ve DNA bir ve manyetik bir karıştırma ile desteklenmiştir.

Daha sonra tüpü manyetik bir karıştırıcı üzerinde önceden ısıtılmış 37 santigrat derece su içeren bir behere yerleştirin ve hücre bulamaçlarını 30 dakika boyunca saniyede bir tur karıştırın. Karıştırdıktan sonra, lenf nodu parçasının çökmesine izin verin ve ardından süpernatanı dikkatlice çıkarın. Şimdi stromal olmayan hücreler için zenginleştirilmiş, lenf nodu fragmanlarına 750 mikrolitre taze ortam aktarın, kollajenaz D ve D naz ile desteklenmiş ve daha sonra dokuyu 37 santigrat derecede beş dakika daha karıştırın.

Daha sonra, lenf nodu doku parçalarını 700 mikrolitrelik bir hacimde maksimum hızda 10 döngü boyunca ayırmak için otomatik çok kanallı bir pipet kullanın ve ardından doku parçalarını 10 dakika sonra tekrar karıştırın. Ayrıca, doku kümelerini otomatik çok kanallı pipet ile maksimum hızda 99 döngü boyunca ayırın. Daha sonra tüpe 7,5 mikrolitre 0,5 molar EDTA ekleyin ve doku süspansiyonunu otomatik pipet ile 99 döngü daha karıştırın.

Son ayrıştırma döngüsünden sonra, hücre çözeltisine 750 mikrolitre ortam ekleyin ve hücreleri 70 mikrometrelik bir naylon ağdan süzün. Daha sonra hücreleri 1500 Gs ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca peletleyin. Lenf nodu stromal hücre popülasyonlarını akış sitometrisi ile görselleştirmek için, uygun hücre örneklerini canlı ölü izleyici ve ilgilenilen antikorları karanlıkta dört santigrat derecede en az 20 dakika boyunca% 2 FCS içeren 100 mikrolitre HBSS ile boyayın.

Daha sonra hücreleri 500 mikrolitre HBSS'de FCS ile yıkayın ve tekrar süspanse edin. 100 mikrolitre HBSS ve FCS'deki peletler, hematopoietik hücreleri dışlamak için CD 45 pozitif hücreleri dışarı atan bir akış sitometresi üzerinde hücreleri çalıştırır, daha sonra canlı singlet popülasyonu üzerinde yürür. Son olarak, T bölgesi retiküler hücrelerini, lenfatik endotel hücrelerini, kan endotel hücrelerini ve çift negatif hücreleri görselleştirmek için GP 38'e karşı CD 31'i çizin.

Hücre popülasyonları. Lenf nodu stromal hücre alt kümelerinin sindiriminden sonra geri kazanılan toplam hücre sayısı, az önce gösterilen protokolde, bağlantı ve Fletcher protokollerine kıyasla biraz daha yüksekti ve bu protokol ile izolasyondan sonra lenf nodu stromal hücrelerinin canlılığının, yayınlanmış protokoller kullanılarak kurtarılana benzer olduğunu gösterdi. Bu ve bağlantı yoluyla izole edilen T bölgesi retiküler hücreleri ve lenfatik endotel hücreleri ve Fletcher protokolleri IAB, CD bir, CD 40, CD 80, PD L one ve CD 40 ekspresyonu için karşılaştırıldı.

Beş yüzey molekülünün tümünün ekspresyonu, her iki stromal hücre alt kümesi için az önce gösterilen protokol ve bağlantı protokolü ile sindirim üzerine daha yüksekti, bu da bazı yüzey moleküllerinin kollajenaz dört ve D tarafından bozunmasının, kollajenaz p ve DYS uzayından daha az sağlam olduğunu düşündürdü. Bu videoyu izledikten sonra, lenf nodu stroma hücrelerinin dört ana alt popülasyonunu başarılı bir şekilde izole ederken, daha fazla karakterizasyon ve analiz için yararlı olan birkaç yüzey molekülünün ekspresyonunu nasıl koruyacağınızı iyi anlamış olmalısınız.