TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki tek tek klatrin kaplı çukurların dinamiklerini görselleştirmek ve ölçmektir. Bu, önce floresan etiketli endositik ve kargo proteinlerinin bir yapışma hücre hattına geçirilmesiyle gerçekleştirilir. Bir sonraki adım, hücreleri toplam iç yansıma, floresan veya çim mikroskobu ile görüntülemektir.

Klatrin kaplı çukurların küçük setlerinin ömürleri daha sonra bir görüntü işleme ve analiz programı kullanılarak manuel olarak ölçülür. Son adım, klatrin kaplı çukurların ömürlerini objektif otomatik algılama ve analiz ile ölçmektir. Sonuç olarak, çim mikroskobu, G-proteinine bağlı reseptörlerin klatrin aracılı endositozunu araştırmak için tek olay çözünürlüğünde tek tek klatrin kaplı çukurların dinamiklerini ölçmek için kullanılır.

Bu yöntem, mevcut farklı endositik proteinlere ve kargo proteinlerine bağlı olarak endositozun montajı ve dinamiklerinin nasıl değişebileceği gibi membran kaçakçılığı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. HEC 2 93 hücrelerini, etiket G proteinine bağlı reseptörleri veya GPCR'leri ve/veya Claro makinesinin bileşenlerini kodlayan plazmitlerle transfekte etmeye başlamak için. Metin protokolünde detaylandırıldığı gibi 12 oyuklu bir plakada, transfeksiyondan bir gün sonra, her birine bir milimolar EDTA ile 0.5 mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin.

Daha sonra üç tur steril 25 milimetre kapak fişlerini altılı ayrı kuyucuklara yerleştirin. Kuyu plakası Her kuyuyu iki mililitre ortamla doldurun. Kapak kaymasının alt tarafında hücrelerin büyümesini önlemek için kapak kızağını yavaşça kuyunun dibine doğru itin.

Daha sonra, hücreleri kuyu dibinden kaldırmak için 12 kuyulu plakanın bir kuyusunu manuel olarak çalkalayın. Yeniden göndermek için %10 FBS ile bir mililitre DM EM ekleyin. Daha sonra kaldırılan hücreleri bir kuyudan üç kapak fişi arasında eşit olarak dağıtın.

Görüntülemeden önce hücrelerin en az 48 saat boyunca kapak fişleri üzerinde büyümesine izin verin. Ayrıca, klatrin kaplı çukur ve kargo dinamiklerinin görüntülenmesi için hücrelerin yayılmış ve düz olduğundan emin olun. İlk olarak, hücreleri metin protokolünde açıklandığı gibi antikorlarla önceden inkübe edin.

Ardından, bir çift forseps ve uçta bir kancaya bükülmüş 25 gauge bir iğne kullanarak kapak fişini canlı bir hücre görüntüleme odasına aktarmaya hazırlanın. Forseps çiftini baskın elinizde tutun. Bükülmüş iğneyi diğerinde tutun.

Kanca cama doğru aşağı doğru kıvrılana kadar iğneyi çevirin. İğne kancası tarafını, kapak kızağına takılana kadar altı kuyulu bir plakanın altından yavaşça aşağı doğru sürükleyin. Hücreleri ayıracağı için kapak kaymasının yüzeyini çizmemeye dikkat edin.

Kapak kızağını kuyunun dibinden yavaşça kaldırın. Destek için kapak kızağını kuyunun duvarına karşı dengeleyin. Kapak kaymasının kenarına yakın bir yere kavramak için forsepsleri kullanın ve kapak kayma hücresi tarafını görüntüleme odasına doğru hareket ettirin.

Hazneyi monte edin ve 700 mikrolitre ön ısıtma görüntüleme ortamı ekleyin. Odayı mikroskoba aktardıktan sonra, önemli bir güvenlik önlemi olarak uygun yapıları ifade eden hücreleri tanımlamak için hücreleri geleneksel epi, floresan veya konfokal aydınlatma modlarında bir çim yağına daldırma objektifi kullanarak odaklayın. Her zaman lazer ışınının açısının farkında olun ve onu her zaman gözlemciden uzağa yönlendirin.

Daha sonra, hücrenin etrafındaki plazma zarının ana hatları kaybolana ve hücrenin alt yüzeyi görünene kadar ifade eden bir hücrenin alt yüzeyine odaklanın. Bu, mu opioid reseptörü gibi bir plazma zarı lokalize kargo proteini ile en belirgindir. Konvansiyonel epi floresansta görüntüleme için aynı lazerler kullanılıyorsa, lazerin geliş açısını odak dışına çıkana kadar artırın.

Hücrenin iç kısmındaki floresan kaybolur ve hücrenin etrafındaki plazma zarının ana hatları görülmez. Çim m'ye girdikten sonra, uyarma lazerinin objektiften geri yansıdığından ve objektifin üzerinde görünmediğinden emin olun. Lazer noktasının görünür olup olmadığını kontrol ederek, net bir görüntü elde etmek için odağı iyileştirin.

Hücreler tanımlandıktan sonra, 10 dakika boyunca en az üç saniyede bir görüntü alın. Ek hücreleri görüntülemek için tüm adımları tekrarlayın. Endositik dinamiklerin analizine başlamak için, dosyayı resimde açın J.Images, tek bir TIFF dosyası yığını olarak saklanır.

Yapraklar arası kanallar ile. Açılır pencerede görüntü hiper yığınlarını ve hiper yığına yığını seçerek görüntüleri hiper yığınlara dönüştürün. Alınan kanal sayısını girin.

Zack için bir tane girin ve film karesi sayısını girin. Hiper yığın biçimi, iki kaydırma çubuğu olan bir pencere verir. Kanallar arasında hareket etmek için üst çubuğu ve zaman içinde hareket etmek için alt çubuğu kullanın.

Ömürleri test edilecek olan proteinin kanalına ilerleyin. Önceden var olan klatrin kaplı çukurların veya tüm süreleri görünmeyen CCP'lerin dahil edilmesini azaltmak için filmin ilk karesinin ötesine geçin. Rastgele seçilen bir noktanın etrafına bir ilgi bölgesi veya yatırım getirisi çizin.

Bir noktanın görünür olduğu kare sayısını sayın. Nesne tanıma ile analize başlamak için, ham görüntü dosyasını görüntü analiz yazılımında açın Varsayılan olarak ortaya çıktı. Renkli görüntü ortaya çıkar.

Bir kanalın parlaklığını ayarlamak için ekran ayarlama penceresini kullanın. Görüntülenen rengi değiştirmek için bir kanalın adına tıklayın. Görüntülenmesini önlemek için kanalın yanındaki kutunun işaretini kaldırın.

Turuncu benekli simgeye tıklayarak noktalar oluşturun. Parlak ön kenarları ve plakları yanlış algılayacak alanları dışarıda bırakmak için kullanarak hücrenin etrafında bir ROI seçin. Algoritma için ilk tahminleri sağlamak için bir noktanın çapını ölçün.

Dilim moduna geçin ve çapını ölçmek için bir noktanın kutup uçlarına tıklayın. Bunu, bir CCP'nin kesilmeden önce oluştuktan sonraki stabilitesinin yüksekliğinde göstergesi gibi görünen dört veya beş yuvarlak nokta için yapın, ortalama çapı bir mikronun en yakın 10'da birine kadar hesaplamak için bu ölçümleri kullanın. Noktaları tespit etmek için aşma moduna geri dönmek için, tespit için uygun kanalı seçin.

Ölçülen ortalama çapı, genellikle 0,3 veya 0,4 mikron girin. Noktaları ölçmek için mavi ileri oka tıklayın. Arka plan olmadan mümkün olduğunca çok nokta yakalamak için filtreyi ayarlayarak noktaları kaliteye göre filtreleyin.

Kalite filtresi varsayılan olarak seçilidir. Uygun bir eşik ayarlamak için kalite eğrisini kılavuz olarak kullanın. Filtrenin alt eşiğini farenin sol tuşuyla eğrideki bu ilk daldırmaya getirin.

Bu, filtre için iyi bir başlangıç noktasıdır. Çünkü bu konum genellikle algılamayı yalnızca görünür noktalara göre iyileştirir. Düzenleme noktasındaki arant noktalarını kaldırın Ekran seçme moduna geçin ve noktaya tıklayın Sarıya döndükten sonra sil'e tıklayın.

Ardından algoritmayı oluşturmaya devam etmek için mavi oka tıklayın. Parçaları hareket halindeki brownie'ye ayarlayarak parçaları ölçün. ÇKP herhangi bir yönlendirilmiş hareket göstermemelidir, sadece plazma zarı boyunca minimum sürüklenme göstermelidir.

Bu algoritma, bu hareket için en uygun olanıdır. Ardından, maksimum mesafeyi 0,7 mikron gibi küçük bir değere ayarlayın. Küçük bir mesafe ayarlamak, bitişik noktaların bağlantısını en aza indirir ve yine de bir hücre noktasının CCP veya hücre hareketi yoluyla sürekli izlenmesine izin verir.

Ardından maksimum boşluk boyutunu bir olarak ayarlayın. Bu, yalnızca bir kare eksikse parçanın devam etmesine izin verir. Art arda üçten fazla boşluk boyutları, farklı izlerin yanlış bir şekilde birbirine bağlanmasına neden olur.

Bir sonraki adım, parça görüntülemeyi ejderha kuyruğuna geçirmektir. Algılama kalitesini gözlemleyerek filmde ilerleyin. Bitişik noktalar bağlanıyorsa, maksimum mesafeyi 0.7 mikronun altına düşürün.

Noktalar çok kolay parçalanıyorsa, maksimum boşluk boyutunu artırın. Parça oluşturmak için mavi oka tıklayın. Bu, parçaları filtrelemek için filtre parçası ekranına yol açar.

Ek parlak plakları çıkarmak için bir yoğunluk filtresi kullanın. Ardından, çim alanına giren endozomları çıkarmak için bir yer değiştirme filtresi kullanın. Daha uzun noktalar da daha uzun yer değiştirmeye sahip olacağından dikkatli olun.

Protokolü tamamlamak için yeşil çift oka tıklayın. Verileri dışa aktarmak için istatistikler sekmesine gidin. Seçilen istatistiği dışa aktarmak için tek disket simgesine tıklayın.

Tüm istatistikleri dışa aktarmak için bir dizi disket gibi görünen simgeye tıklayın. Yapışık bir plazma zarına ve konfokal moda odaklanmak, loş floresanla dolu bir hücreyi ortaya çıkarır. Buna karşılık, hücrenin merkezine odaklanmak, plazma zarını hücrenin etrafında bir floresan halkası olarak ortaya çıkarır.

Yanlış bir açıyla geleneksel epi, floresan veya çime geçerken odak dışı floresan belirgin hale gelir. Çim açısı doğru olduğunda, plazma zarı çok net, net ve parlaktır ve odak dışıdır. Floresan artık görüntüyü bozmaz.

Beta arrestin sitozolik bir havuzda olduğunda, çim alanında çok az bulunur ve puslu ve dış odak görünür. MOR agonist tarafından aktive edildiğinde, beta, arrestin plazma membranına alınır ve hem beta arrestin hem de reseptör CCP'lere yeniden dağıtılır. Bu kümelerin ömürleri manuel olarak ölçülür.

Tamamlanmış endositoz için üç parametreyi kullanarak, CCP'leri gösteren noktalar tamamen kaybolabilir, yanıp sönebilir veya daha büyük bir yapıyı sıkıştırabilir. Burada, dinamik olmayan plak yapılarını çıkarmak için filtrelemeden sonra bir MA kullanılarak tespit edilen CCP'ler, üst üste bindirilmiş beyaz küreler, tespit edilen noktaları belirtir, tüm ömürleri boyunca tespit edilemeyen daha sönük noktalar da kalite filtresi ile hariç tutulmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, çim mikroskobu kullanarak tek tek kateter kodlu çukurları nasıl görselleştireceğinizi gerçekten iyi anlamış olmalısınız.