PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare B lenfositlerindeki genomik kararsızlığı ölçmektir. Bu, önce birincil hücre kültürü için B hücrelerinin izole edilmesiyle elde edilir. Daha sonra, hücreler metafaz yayılımlarının hazırlanmasını kolaylaştıracak şekilde sabitlenir.

Son olarak, floresan olarak işaretlenmiş telomerlerin görselleştirilmesi için telomer PNA balığı gerçekleştirilir. Sonuç olarak, çeşitli kromozom sapmalarının seviyesi floresan mikroskobu ile ölçülebilir. Bu tekniğin sonuçları, hedeflenen fare modellerimizde genomik stabiliteyi destekleyen genleri tanımlamaya yardımcı olabileceğinden, DNA onarım yolları hakkındaki anlayışımızı genişletebilir.

Bu yöntem, kromozom kırılmaları ve diğer büyük kromozomal yeniden düzenlemeler hakkında bilgi sağlayabilse de, translokasyonlar gibi diğer genomik kararsızlık biçimlerini ölçmek için de uyarlanabilir. B hücrelerini izole etmek için, laminer bir akış başlığında iki mililitre yıkama tamponu içeren 35 milimetrelik bir doku kültürü kabına yeni izole edilmiş bir dalak yerleştirerek başlayın. Ardından, dalağı nazikçe yumuşatmak için pistonun arka ucunu beş mililitrelik bir şırıngadan kullanın.

Daha sonra, doku bulamacını 70 mikrometrelik bir naylon süzgeçten geçirerek 50 mililitrelik bir tüpe süzgeç boyunca süzün, daha büyük doku parçalarını süzgeçten hafifçe bastırmak için pistonu kullanın. Plakayı ve şırıngayı sekiz mililitre yıkama tamponu ile durulayın ve yıkamayı süzgeçten süzün. Daha sonra hücreleri döndürdükten sonra, peleti üç mililitrelik bir CK lizis tamponunda birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Beş dakika sonra, 10 mililitre yıkama tamponu ile reaksiyonu durdurun. Daha sonra hücreleri tekrar döndürdükten sonra, peleti yeniden süspanse etmek için tüpün altına hafifçe vurun ve hücrelere bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Daha sonra, hücreleri buz üzerinde 50 mikrolitre anti CD 43 max mikro boncuk ile inkübe edin.

30 dakika sonra, hücreleri 10 mililitre yıkama tamponunda nazikçe yıkayın. Santrifüjleme sırasında, mıknatısın üzerine bir minimax sütunu ve sütunun altına etiketli 15 mililitrelik konik bir tüp yerleştirin. Daha sonra kolona bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve EIT'yi tüpte toplayın.

Hücre peletini bir mililitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin ve ardından hücreleri kolona yükleyin Numune geçtikten sonra, kolonu bir mililitre yıkama tamponu ile durulayın ve doğrudan toplanan numuneye yedi mililitre yıkama tamponu ekleyin. Toplanan hücreleri saydıktan sonra, santrifüjleme için 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Daha sonra B hücrelerini aktive etmek için, peleti takviye edilmiş B hücresi ortamında mililitrede altı hücrenin 10'unda bir kez yeniden askıya alın ve hücreleri, 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe oyuk başına beş mililitre hücrede altı oyuklu plaka halinde inkübe edin ve% 5 B hücrelerini sabitlemek için.

Daha sonra kuyucukların her birine 50 mikrolitre smid. 37 santigrat derecede bir saatlik inkübasyondan sonra, B hücrelerini etiketli 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Etiketi bantla kapatın ve hücreleri aşağı doğru döndürün.

Ardından, yaklaşık bir mililitre süpernatan hariç hepsini aspire edin ve peleti pipetleyerek yeniden süspanse edin. Bir girdap üzerinde titreşirken beş mililitre 37 santigrat derece, potasyum klorür damla ekleyin. Daha sonra 10 mililitre potasyum klorür ekleyin ve hücre çözeltisini ters çevirerek karıştırın.

Daha sonra, hücreleri 37 santigrat derece su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Daha sonra ters çevirerek bir kez daha beş damla taze fiksatif karışım ekleyin. Daha sonra, peleti bir mililitre süpernatan içinde askıya aldıktan sonra hücreleri döndürün, bir girdap üzerinde titreşirken damla damla beş mililitre taze fiksatif ekleyin ve hücreleri ve oda sıcaklığında 10 mililitre daha fiksatif inkübe edin.

30 dakika sonra, hücreleri pelet haline getirin ve sabitleyicinin bir mililitresi hariç hepsini çıkarın. Daha sonra hücreleri yıkadıktan sonra, 15 mililitre fiksatifte iki kez daha, peleti süpernatantın son 70 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Şimdi etiketli slaytları 35 derecelik bir açıyla 22,9 santigrat dereceye ve %52 neme ayarlanmış bir nem odasına yerleştirin.

Her slaytta 35 mikrolitre yeniden asılı B hücresi bırakın ve numune başına iki slayt hazırlayın. Daha sonra slaytların nem odasında 30 dakika kurumasına izin verdikten sonra, slaytları tamamen kuruyana kadar 37 santigrat derecede bir slayt kutusunda saklayın. Kuruduktan sonra, balıklar için slaytları denatüre etmek için her slaydın arkasında hibridizasyon için 18 x 18 milimetrelik bir alanı işaretlemek için bir elmas kalem kullanın.

Daha sonra, 120 mikrolitre %70 deiyonize form amidini 24 milimetreye 60 milimetre kapak fişine uygulayın ve ardından her slayta bir kapak fişine dokunun. Slaytları 80 santigrat derece sıcak plaka üzerinde 90 saniye boyunca denatüre edin ve ardından kapak fişlerini hızlı ve dikkatli bir şekilde ve art arda kaydırın. Slaytları her biri üç dakika boyunca buz gibi soğuk 70, 90 ve %100 Etanol içine yerleştirin Slaytlar kuruduktan sonra, slaytları nemli bir odaya yerleştirin ve slaytlar üzerindeki işaretli alanlara ihtiyaç öncesi prob Karışımı uygulayın.

Prob karışımını 18 x 18 milimetrelik bir kapak kızağı ile örtün ve slaytları bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra slaytları önceden uyarılmış iki XSSC'de çalkalayarak yıkayın. Beş dakika sonra, slaytlara 35 mikrolitre moyal montaj ortamı uygulayın.

Ortamı 24 milimetreye 60 milimetre kapak fişleri ile örtün ve slaytları dört santigrat derecede saklayın. Son olarak, standart bir epi floresan mikroskobu kullanarak metafaz slaytlarını analiz edin. Bir fare hücresinden türetilen metafaz kromozomları, 40 kromozom içeren gizli bir küme oluşturmalıdır.

Her kromozomun bir ucunda bir sentromer, iki telomer sinyaline yakın ve kromozomun diğer ucunda iki ek telomer sinyali vardır. Kromatit kırılmaları, her bir metafaz kromozomunu oluşturan iki kardeş kromatitten birindeki kırılmalardır. Bazı durumlarda, kromozomun kırık ucu, aynı metafaz yayılımında telomer sinyallerine sahip bir fragman olarak gözlemlenebilir.

Radyo kromozomları, iki kromozomu içeren karmaşık yeniden düzenlemelerdir. Kromozomlar ayrıca, her iki ucunda sentromerler bulunan kromozomların uçtan uca füzyonları olarak görünen disentrik kromozomlar oluşturmak üzere birleştirilebilir. Robertsonian translokasyonları, tek bir sentromere bağlı dört kardeş kromat kolu olarak görünen iki kromozomun sentromerleri arasındaki bir translokasyon türüdür.

Bu son görüntüde, telomer sinyallerinin bulunmadığı bir metafaz gösterilmektedir. Telomer sinyallerinin yokluğu, prob hazırlığındaki hatalardan veya hibridizasyon sırasında kapak kaymasının altındaki hava kabarcıklarından kaynaklanabilir. Bu prosedürü takiben, artan genomik kararsızlığın hücre canlılığını etkileyip etkilemediği gibi ek soruları yanıtlamak için hücre döngüsü analizi ve kolon bilgisi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.