Name: Bir Roman In vivo Gen Transferi Tekniği ve In vitro Hücre Tabanlı Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-08T23:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Keşfedin yeni bir gen transferi tekniği ile in vivo osteoklast farklılaşmasını ve fare kemik iliği makrofajlarından in vitro osteoklast üretimini. Sitokinlerin kemik hücreleri üzerindeki etkilerini anlamak için güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Araştırma kısmen NIH araştırma hibeleri R01 AR062173 ve IEA'ya 250862 SHC tarafından desteklenmiştir. ES, NIH T32 CTSC doktora öncesi bursunun alıcısıdır.

SRANKL MC DNA 1. Hidrodinamik Gönderme <ol><li> Fare Tail Ven yoluyla hidrodinamik Teslim <ol><li> Kuyruk damarından enjekte edilmesinden önce fare tartılır. Fare vücut ağırlığının ~% 10 bir toplam hacim içinde sRANKL veya Ringer çözeltisi yeşil floresan protein (GFP) MC (ön sıcak, 37 ° C&#39;de) seyreltin. </li><li> Kan damarlarını genişletmek ve görünür yan damarlar (LVs) yapmak için enjeksiyondan önce 10 dakika boyunca bir kafeste fare ısıtın. Dehidratasyon ve hipertermi önlemek için dikkatli fare izleyin. </li><li> En kısa sürede LVs dilate ve görünür gibi, süzgeç için fare aktarmak ve hareketi dizginlemek için varil içine yeterince fişini takın. Solunum gibi normal bir aktivite için fare izleyin. Gerekirse süzgeç fişini ayarlayın. </li><li> Silin bir alkol ile kuyruğun ucundan enjeksiyon alanı 3/4 dezenfekte. Fare kuyruğu ven enjeksiyon için 27-30 G iğne kullanın. Bir elinizle sıkıca tutun kuyruk ve iğneyikuyruk toplardamarına. Şırınga üzerinde baskı uygulayın ve 5-7 saniye içinde enjeksiyon tamamlayın. </li><li> Kuyruk damarından gelen iğne kaldırmak ve kanamayı durdurmak için enjeksiyon yerinde bir pamuk ile basınç uygulayın. Solunum hızı normal hızına düşürülür sonra bir kez vivari geri fare aktarmak, 15-30 dakika boyunca fare izleyin. </li></ol></li><li> Fare Serum TRACP5b Mesaj Gen Transferi Sistemik Fare sRANKL İfade ve Nicelik Onay <ol><li> Kan damarlarını genişletmek ve LVs görünür yapmak için 5-10 dakika için bir kafes içinde fare ısıtın. Dehidratasyon ve hipertermi önlemek için dikkatli fare izleyin. </li><li> Kuyruk ucundan ileri bir site bir de fare kuyruğuna bir bıçak ile küçük bir kesi olun. </li><li> Serum ayırma tüplerine kan yaklaşık 100 ul toplayın. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında serum ayırma tüpleri inkübe edin. </li><li> Santrifüj 5 dakika boyunca 10,000 x g&#39;de ve serum numuneleri toplamak. Stordaha fazla analiz için -80 ° C e serum. </li><li> Bir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak serum örneklerinde sRANKL ELISA ve fare serum TRACP5b deneyi yapın. </li></ol></li></ol> Fare BMMs 2. In vitro Osteoklast Üretimi <ol><li> İzolasyon ve BMMs ekimi <ol><li> Tibia ve femur kemikleri İzolasyonu: CO 2 ile donör fare Euthanize, ve% 70 etanol ile dezenfekte bacaklar. Sağlam femur ve tibia kemikleri kaldırmak için, kalkaneus kemik kasık kemiğinden ayır. </li><li> Kemik zarar vermeden dikkatli bir cilt ve kas çıkarın. Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ihtiva eden bir Petri çanağı içinde işlenmiş femur ve tibia kemiği yerleştirin. </li><li> Kemik iliği çıkarılması: femur ve tibia kemikleri bir tarafındaki ucu kesin ve α-MEM,% 1 penisilin / streptomisin içeren yüklü bir 25 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile bir 50 ml tüp içine, kemik iliği atılmasına (Osteoklast Kültür Orta / OCM). </li><li&gt; işlem kemik iliği: karıştırın ve 70 um naylon hücre süzgecinden geçirilerek, yeni bir 50 ml tüp, kemik iliği süspansiyon aktarın. Santrifüj 300 xg ve en hücreler,% 1 penisilin / streptomisin ve% 10 FBS (osteoklast kültür ortamı / OCM (+)) ihtiva eden α-MEM içinde yeniden askıya. </li></ol></li><li> Makrofajlar Kültür <ol><li> Hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak. </li><li> 96 oyuklu bir plaka içerisine yerleştirildi ve 37 ° C de inkübe cam kapak slipleri (5 mm) ve diş kemiği dilimleri 6 kuyulu bir levha ya da 3 x 10 5 hücre için oyuk başına Plaka 1 x 10 6 hücre </li><li> Aspire yapışmayan hücreleri ihtiva eden ve 48 saat boyunca 25 ng / ml fare M-CSF ihtiva eden taze OCM (+) ile 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri tüm medya. </li><li> 25 ng / ml fare M-CSF ve osteoklastojenezi başlatmak için 30 ng / ml fare sRANKL ihtiva eden aspire tüm medya ve taze OCM ile 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri (+) media. Gerektiği gibi her 3 günde bir ortam doldurun. </li><li> Hücrelerin büyümesineyaklaşık 6-8 gün kemik eritme kapasitesine sahip çok çekirdekli dev hücrelerin oluşturulması için. En kısa sürede, çok çekirdekli hücreler görünür gibi, ticari bir kit kullanılarak boyanan TRAP (tartarat dirençli asit fosfataz) yapmak, ve tam olgunlaşmış zaman, fonksiyonel testleri gerçekleştirmek. Phalloidin leke ve resim daha önce tarif edildiği gibi 19 elektron mikroskopi taraması (SEM) ile dentin dilimleri bağlanmış hücreler kullanılarak lamelleri F-aktin halkaları görselleştirme. </li></ol></li></ol> İnsan PBMC &#39;den 3. In vitro Osteoklast Üretimi <ol><li> İnsan PBMC İzolasyonu <ol><li> Bir 50 ml tüp içine önceden ısıtılmış Histopaque-1077 10 ml ilave edilir. </li><li> Boş lökosit filtre 50 ml tüp (PBS ile kan 1:1 oranında) içine steril PBS ile kan bankasından elde. Kan histopaque karışmadığı emin, çok yavaş histopaque çözüm üzerinde seyreltilmiş kan Katman. </li><li> 18 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 1000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri Takip etmeksantrifüj ing dikkatlice beyaz kan hücreleri içeren beyaz ince beyaz tabaka tabaka izole edilmesi ve yeni bir 50 ml&#39;lik tüpe transfer. </li><li> Hücreleri toplamak için 5 dakika boyunca 650 x g hızında tekrar PBS ve santrifüj ile hücreler seyreltin. </li><li> Medya ve hücre sayacı kullanarak hücrelerin sayısı (-) OCM süpernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın. </li></ol></li><li> PBMC&#39;Ierde Kaplama ve kültüre <ol><li> OCM hücrelerin tekrar (+) ve ortam levha 8 x 10 ug / ml göz başına 6 çukurlu bir levha ya da 1 x 10 6 hücre / ml her bir kuyucuk için 96 oyuklu bir plaka içerisinde 6 hücre. Gibi immünofloresan görüntüleme gibi kemik erimesi deneyleri için uygun kemik dilimleri üzerinde için gerekli olan cam kapak slipleri (5 mm) levhalar 20 hücreleri daha önce tarif edildiği. </li><li> Değişim kültür ortamı, insan M-CSF, her 2-3 günde bir ile ya da gerektiğinde hücreleri ilave etme. Daha sonra osteoclastogenes başlatmak için OCM (+) ortamı içinde 25 ng / ml insan M-CSF ile birlikte insan sRANKL 30 ng / ml ilave etmek suretiyle, 5. günde farklılaşma aşamasına geçinolduğunu. </li><li> Çok çekirdekli dev hücreler oluşturmak için yaklaşık olarak 14-21 gün için hücreler büyür. En kısa sürede çok çekirdekli hücreler olarak görünür, bu hücreler daha sonra TRAP için etiketlenebilir ve tam olarak olgunlaşmış zaman, işlevsel tahliller gerçekleştirilebilir. F-aktin halkaları phalloidin leke kullanarak lamelleri üzerinde görülebilir. Hücre morfolojisi, SEM ile dentin dilimleri bağlı hücrelerde incelenebilir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Yelin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+of+musculoskeletal+diseases%3A+impact+of+work+disability+and+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+rheumatology.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline.</a> The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).</li>
<li>Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoclast%2C+bone+remodelling+and+treatment+of+metabolic+bone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease.</a> European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).</li>
<li>Lacey, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoprotegerin+ligand+is+a+cytokine+that+regulates+osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation.</a> Cell. 93, 165-176 (1998).</li>
<li>Mizuno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+overexpressing+soluble+osteoclast+differentiation+factor+%28sODF%29+exhibit+severe+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis.</a> Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).</li>
<li>Bucay, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((osteoprotegerin-deficient+mice+develop+early+onset+osteoporosis+and+arterial+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Gene.%2C+%26+development%22%5BJournal%5D)">osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification.</a> Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).</li>
<li>Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+ovariectomy+and+aging+on+the+rat+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+tissue+international%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton.</a> Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).</li>
<li>Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trabecular+bone+turnover%2C+bone+marrow+cell+development%2C+and+gene+expression+of+bone+matrix+proteins+after+low+calcium+feeding+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats.</a> Bone. 25, 687-695 (1999).</li>
<li>Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+laboratory+rat+as+an+animal+model+for+osteoporosis+research%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+medicine%22%5BJournal%5D)">The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research.</a> Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).</li>
<li>Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+menopausal+transition%3A+analysis+of+LH%2C+FSH%2C+estradiol%2C+and+progesterone+concentrations+during+menstrual+cycles+of+older+women%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+endocrinology+and+metabolism%22%5BJournal%5D)">The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women.</a> The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).</li>
<li>Hughes, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+promotes+apoptosis+of+murine+osteoclasts+mediated+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta.</a> Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).</li>
<li>Kousteni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenotropic%2C+sex-nonspecific+signaling+through+the+estrogen+or+androgen+receptors%3A+dissociation+from+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity.</a> Cell. 104, 719-730 (2001).</li>
<li>Ominsky, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL+inhibition+with+osteoprotegerin+increases+bone+strength+by+improving+cortical+and+trabecular+bone+architecture+in+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).</li>
<li>Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+receptor+antagonist+and+tumor+necrosis+factor+binding+protein+decrease+osteoclast+formation+and+bone+resorption+in+ovariectomized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice.</a> The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).</li>
<li>Weitzmann, M. N., Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+deficiency+and+bone+loss%3A+an+inflammatory+tale%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale.</a> The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).</li>
<li>Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of osteoclast function.</a> J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).</li>
<li>Asagiri, M., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+understanding+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">The molecular understanding of osteoclast differentiation.</a> Bone. 40, 251-264 (2007).</li>
<li>Matsuzaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+factor+%28ODF%29+induces+osteoclast-like+cell+formation+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures.</a> Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+fluid+macrophages+are+capable+of+osteoclast+formation+and+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption.</a> The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-17A+upregulates+receptor+activator+of+NF-kappaB+on+osteoclast+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+researc.%2C+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors.</a> Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).</li>
<li>Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology+at+the+nexus+of+arthritis%2C+osteoporosis%2C+cancer%2C+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection.</a> J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).</li>
<li>Sato, K., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts%2C+rheumatoid+arthritis%2C+and+osteoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology.</a> Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).</li>
<li>Das, S., Crockett, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+-+a+current+view+of+pharmacological+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+design%2C+development+and+therapy%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis - a current view of pharmacological prevention and treatment.</a> Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minicircle+DNA+vectors+devoid+of+bacterial+DNA+result+in+persistent+and+high-level+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).</li>
<li>Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+system+for+production+of+minicircle+DNA+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A robust system for production of minicircle DNA vectors.</a> Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).</li>
<li>Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+production+and+purification+of+minicircle+DNA+vector+free+of+plasmid+bacterial+sequences+and+capable+of+persistent+transgene+expression+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo.</a> Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).</li>
<li>Halleen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tartrate-resistant+acid+phosphatase+5b%3A+a+novel+serum+marker+of+bone+resorption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).</li>
<li>Adamopoulos, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-23+is+critical+for+induction+of+arthritis%2C+osteoclast+formation%2C+and+maintenance+of+bone+mass%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass.</a> J Immunol. 187, 951-959 (2011).</li>
<li>Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+osteoclast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+reviews%22%5BJournal%5D)">Modulation of osteoclast differentiation.</a> Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).</li>
<li>Takahashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+are+involved+in+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation.</a> Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).</li>
<li>Arai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+differentiation+of+osteoclast+precursor+cells+by+the+sequential+expression+of+c-Fms+and+receptor+activator+of+nuclear+factor+kappaB+%28RANK%29+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors.</a> The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).</li>
<li>Fuller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+colony-stimulating+factor+stimulates+survival+and+chemotactic+behavior+in+isolated+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicin%22%5BJournal%5D)">Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts.</a> The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).</li>
<li>Edwards, J. R., Mundy, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+osteoclast+biology%3A+old+findings+and+new+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models.</a> Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).</li>
<li>Weinstein, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+osteoclast+survival+and+antagonism+of+bisphosphonate-induced+osteoclast+apoptosis+by+glucocorticoids%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids.</a> The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kas-iskelet koşulları morbidite ve sakatlık nedenleri lider vardır ve 150&#39;den fazla hastalık ve sendromların oluşmaktadır; Bugün yaklaşık 90 milyon Amerikalıyı etkileyen. Eklem enflamasyonu ve kemik yok artrit ve osteoporoz dahil olmak üzere kas-iskelet sistemi koşulları baskın özellikleri vardır. Osteoporoz genellikle kemik kırıkları yol açan kemik bütünlüğünü zayıflatan bir durumdur. Artrit şiş, hassas ve sert kısıtlayan normal hareket olmak ve sakatlığa yol açabilir eklem iltihabı ile karakterize hastalık zayıfla...

Kas-iskelet sistemi hastalıkları, ulusal ve yerel sağlık sistemleri için 1 Amerika Birleşik Devletleri ve mevcut ciddi sonuçlara milyonlarca insanı etkiler. Bu bozukluklar arasında kemik kaybı ve geniş bir tedavi ve kurtarma uzun süre gerektiren eklem fonksiyonu ile karakterize edilir. Genellikle, osteoklastların sayısı ve / veya aktivitesinde bir nispi artış, hücre osteoporozda, kemik emmek için özel ve artrit 2 görülmektedir. Fizyolojik koşullar altında, osteoklastların sayısı ve etkinliği osteoblastlar tarafından üretilen nükleer faktör κ-B ligandının (RANKL) reseptör aktivatörü düzenlenir. Osteoprotegerin (OPG), RANKL için bir yem reseptörü de 3 osteoblastlar tarafından üretilen sistemik sRANKL aşın veya OPG silinmesini içerir in vivo hayvan modelleri, osteoporoz araştırmalarında, çok değerlidir.; Bununla birlikte, bu yöntemler, transgenik farelerin 4,5 üretilmesini gerektirir. Burada, yeni bir alternatifkas-iskelet sistemi ile ilgili hastalıkların çalışma için sRANKL aşırı ifade eden bir yöntem tarif edilmektedir. Özellikle, minicircle (MC) DNA teknolojisi ve hidrodinamik dağıtım yöntemler, canlı ortam içinde sRANKL arasında gen transferini elde etmek ve sistemik 6 fare sRANKL aşırı ifade etmek için kullanılmıştır. Bu yöntem, aynı zamanda, düşük kalsiyum diyeti 8 ile ovariektomi 7 ve diyet müdahalesi şu osteoklast hormonal düzenlenmesi gibi osteoporoz ve diğer in vivo modeller, tamamlayıcıdır. Bu modeller cerrahi gerektiren ve önemli bir maliyetle 9 at, birkaç aya kadar sürebilir ancak kas-iskelet sistemi ile ilgili bozuklukların farklı yönlerini incelemek için çok yararlıdır. Ovariektomi uygulanmış olan (OVX) kemirgen modeli yumurtalıkların çıkarılması böylece insan menopoz sonrası osteoporoz 10 taklit eden estrojen eksikliğine yol açar deneysel bir hayvan modelidir. İnsan menopoz sonrası osteoporoz, östrojen yetersizliklerinin bir durumdurency kemik kırılmaları yönünden artan bir riske yol açar ve osteoporoz sadece Amerika Birleşik Devletleri&#39;nde yaklaşık sekiz milyon kadınları etkiler. OVX modeli, menopoz sonrası osteoporoz için faydalı olmasına rağmen, genel olarak osteoporoz okuyan sınırlı avantajlar sunmaktadır. Östrojen yokluğunda bu nedenle de artmış osteoklast aktivitesi 10-12 görülmektedir, osteoklast uyarılması ve osteoblast apoptoz inhibe ederek, kemik kaybını önler. Kemik erimesini yana A RANKL&#39;ın-OPG oranı dengesizlik ayrıca 13 görülmektedir. Büyüme faktörü β (TGF β), yüksek interlökin-7 (IL-7) ve TNF, IL-1 ve IL-6 14,15 dönüşüm seviyelerinin uzaması Bununla birlikte, in vivo koşullarında östrojen eksikliği de eşlik etmektedir. Bu sitokinler RANKL&#39;ın yolunun kemik yeniden düzenleyici fonksiyonları bağımsız bilinen gibi, sadece RANKL-RANK eksenine herhangi bir osteoklast aktivasyonunu atfetmek mümkün değildir. Bu yazıda anlatılan modeli viv çalışma için araştırmacılar sağlaro pro-enflamatuar sitokinler olmaksızın osteoclastogenez ve kemik kaybına RANKL-RANK eksen OVX kemirgen modelleri ile karşılaştırıldığında. Buna ek olarak, in vitro osteoklastojenezisi teknikleri kas-iskelet sistemi hastalıklarının tedavisi için potansiyel terapötik osteoklast aktivasyonunu çalışma için gerekli araçlardır. Daha önceki çalışmalar, aynı zamanda, fare makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve fare sRANKL ile fare kemik iliğinden elde edilen makrofajların (BMMs) kültürlenmesi osteoclast farklılaşmasında 3,16,17 yol göstermiştir. Burada, fare kemik iliği hem de in vitro 18, insan periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) için çok çekirdekli osteoklast-benzeri hücreleri oluşturmak için protokolleri açıklanmıştır. Olgun terminal açıdan farklılaşmış ve tamamen işlevsel osteoklast tanımlamak için gerekli olan hücre bazlı deneyler, aynı zamanda kısaca açıklanmıştır. Bu in vitro teknikler vivo yaklaşım romanı tamamlamak ve p olarak hizmetowerful soruşturma araçlar osteoklast farklılaşmasını ve aktivasyonunu incelemek. Bu sistemleri kullanarak, bilim adamları, in vivo ve in vitro olarak osteoklastlar üretmek ve bunların proliferasyon ve aktivasyon için gerekli olan uyarıcılar ve sinyaller tespit hem de farmakolojik ve biyolojik inhibitörlerinin sonuç verirliğinin test edilmesi mümkün bulunmaktadır.

<table><tbody><tr><td>alpha-MEM</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>İnsan M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-492</td><td></td></tr><tr><td>Fare M-CSF</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-643</td><td></td></tr><tr><td>İnsan RANK-Ligand - çözünür</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-631</td><td></td></tr><tr><td>Fare RANK-Ligand - çözünür</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-076</td><td></td></tr><tr><td>Fareler için Tailveiner Tutucu</td><td>Braintree</td><td>TV-150 STD</td><td></td></tr><tr><td>Fare Trans / RÜTBE L / TNFSF11 Quantikine ELISA Kiti ve nbsp;</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>MTR00</td><td></td></tr><tr><td>Asit Fosfataz, Lökosit (TRAP) Kiti</td><td>Sigma</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>MouseTRAP testi&nbsp;</td><td>immünodiagnostik sistemler</td><td>SB-TR103</td><td></td></tr></tbody></table>

bir roman in vivo gen transferi tekniği ve in vitro hücre tabanlı tahliller

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Osteoklastların farklılaşması ve aktivasyonu, kas-iskelet sistemi hastalıklarının gelişiminde anahtar rol oynar, çünkü bu hücreler öncelikle kemik erimesinde rol oynar. Osteoklastlar, sağkalımı ve farklılaşmayı destekleyen belirli sitokinlerin varlığında monosit/makrofaj öncü hücrelerinden in vitro olarak üretilebilir. Burada, bilim adamlarının osteoklast farklılaşması, sinyalizasyonu ve aktivasyonuna yönelik farklı sitokin katkılarını incelemelerine olanak tanıyan hem in vivo hem de in vitro teknikler gösterilmiştir. Mini daire DNA iletim gen transfer sistemi, osteoporozla ilgili bir model oluşturmak için alternatif bir yöntem sağlar, özellikle çeşitli farmakolojik inhibitörlerin etkinliğini in vivo olarak incelemek için yararlıdır. Benzer şekilde, spesifik sitokinlerin varlığında insan öncü hücrelerinden osteoklast üretmek için in vitro kültür protokolleri, bilim adamlarının translasyonel uygulamalar için insan hücrelerinde osteoklastogenezi incelemelerini sağlar. Bu teknikler bir araya getirildiğinde, dünya çapında milyonlarca osteoporoz ve artrit hastasına fayda sağlayabilecek osteoklasta özgü hedefli terapötikler için ilaç keşif çabalarını hızlandırma potansiyeline sahiptir.

Burada, osteoklastojenez sitokinlerin etkilerini incelemek için bir yöntem olarak, in vitro olarak osteoklast öncü hücreleri ayırt etmek için in vivo ve hücre kültürü protokollerinde osteoklast farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği tarif edilmektedir. Şekil 1, farelerde GFP ve fare sRANKL MC başarılı gen transferi için temsili sonuçları gösterilmiştir. Şekil 2'de, fare kemik iliği ya da parlak alan mikroskopi ile osteoklast için ön-madde hücreleri, ...

Öncü hücrelerin osteoklastlara farklılaşması sitokinler ve büyüme faktörleri tarafından düzenlenir. Burada, osteoklastların in vivo olarak farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği ve sitokinlerin osteoklastogenez üzerindeki etkilerini incelemek için bir yöntem olarak öncü hücrelerin in vitro osteoklastlara farklılaşması için hücre kültürü protokolleri açıklanmaktadır.

Bir Roman In vivo Gen Transferi Tekniği ve In vitro Hücre Tabanlı Tahliller

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

Genel amaç, in vivo osteoklast farklılaşması için yeni bir gen transfer tekniği bildirmektir. Ayrıca, insan pbmc'sinin fare kemik iliği makrofajlarını osteoklasta ayırmak için hücre kültürü protokollerini de tanımladık. Bu video üç bölüme ayrılacaktır.Bir, rütbe liken mini daire, DNA'nın hidrodinamik iletimi, fareden iki in vitro osteoklast nesli, kemik iliği makrofajları ve insan pbmc'sinden üç in vitro osteoklast nesli. Birinci bölüm, rütbe liken mini dairenin hidrodinamik iletimi, DNA. Aşağıdaki animasyonda, fare kuyruğu damar enjeksiyonu yoluyla hidrodinamik dağıtıma kısa bir genel bakış gösterilmektedir.İlk olarak, enjeksiyondan önce fareyi 10 dakika boyunca bir ısı haritasının altına yerleştirin. Bu, kan damarlarını genişletir ve yan damarları daha görünür hale getirir. Ardından enjeksiyon bölgesini bulun ve enjeksiyona devam edin, enjeksiyonu beş ila yedi saniye içinde tamamladığınızdan emin olun.Bu videonun bir sonraki kısmı, fare kuyruğu damarı yoluyla hidrodinamik dağıtımda yer alan prosedürlerin daha ayrıntılı bir hesabını gösterecektir. Enjeksiyon için malzemeleri toplayın. Enjeksiyondan önce fareyi 10 dakika boyunca bir kafeste ısıtın.Dehidrasyon ve hipotermiyi önlemek

a-novel-vivo-gene-transfer-technique-vitro-cell-based-assays-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Ardışık düşük doz X-ray taramaları kullanarak omurilik yaralanması sonrası kemik kaybı, yetişkin farelerin femur ve süresince tibialar boyuna muayene yapıldı. Tibia kemik kaybı, kemik kaybı femur kadar 40 gün yaralanma tespit edilmedi ise çalışma boyunca tespit edildi.

Roman kullanarak Spinal Kord Yaralanması sonra Fare Hind Ekstremite Kemik Kaybı Boyuna değerlendirilmesi, In vivo, Metodolojisi

Hayvan modelleri sık kemik kanseri metastazı araştırmak için kullanılmaktadır. Bu protokolü biz kemik metastazı çalışmaları için tümör inokülasyonu iki genel metot tanımlamak ve kısaca bu modeller izlemek ve ölçmek için kullanılan analizler bazı anlatacağız.

Kemik Metastaz Modelleri

Kırık iyileşmesi kemik progenitör fonksiyonunun kantitatif ölçümü yüksek çözünürlüklü seri görüntüleme teknolojisini gerektirir. Burada, protokoller görseli sırayla ve kemik kırığı tamir sürecinde endojen osteojenik kök / progenitör hücrelerin hareketi, çoğalması ve farklılaşması ölçmek için intravital mikroskopisi ve osteo-dizi izleme kullanarak verilmiştir.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Staphylococcus aureus bir biyolojik olarak ışık veren mühendislik suşu kullanılarak, ortopedik protez enfeksiyonun bir fare modelinde, optik ve uCT görüntüleme birlikte, invaziv olmayan uzunlamasına ve bakteriyel enfeksiyonun dinamikleri, hem de karşılık gelen enflamatuar yanıtı ve anatomik değişiklikleri izlemek için bir kapasite sağlamadığı Kemik.

Kombine<em&gt; In vivo</em&gt; Optik ve uCT Görüntüleme Farelerde bir Ortopedik İmplant Enfeksiyon Enfeksiyon, Enflamasyon ve Kemik Anatomisi Monitör

Protokol, femoral kemik iliğindeki hücrelerin hareketini in vivo olarak izlemek için kullanılabilecek yeni bir murin femur pencere odası modelini tanımlar. İntravital multifoton floresan mikroskobu, zaman içinde femur kemik iliğinin üç bileşenini (vaskülatür, kollajen matrisi ve nötrofiller) görüntülemek için kullanılır.

için Femur Pencere Odası Modeli<em&gt; İn Vivo</emFare Kemik İliği içinde&gt; Hücre Takibi

Peroneal sinirin uyarılmasını ve sıçan arka ayağının anterior krural kompartmanının kasılmasını takiben ayağın dorsifleksiyonunu ölçmek için bir in vivo protokol tarif ediyoruz. Bu tür ölçümler, iskelet kası patolojisini ve kas onarımı ve rejenerasyonuna yönelik doku mühendisliği yaklaşımlarını değerlendirmek için vazgeçilmez bir translasyonel araçtır.

Uygulamaları<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku değerlendirilmesi için Rat Tibialis Anterior Fonksiyonel Test İskelet Kası Onarım Engineered

Küçük laboratuvar balıkları, insan kemik bozukluklarının altında yatan mekanizmalar üzerine kemik araştırmaları ve kemik modüle edici ilaçların taranması için popüler modeller haline gelmiştir. Bu yazıda, osteoporotik lezyonları olan medaka larvalarında alendronatın kemik hücreleri üzerindeki etkisini değerlendirmek için bir protokol tanımlanmıştır.

İlaç Tedavi ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Medaka Balık Osteoporoz Modelinde Osteoblast-Osteoklast Etkileşimler Görüntüleme

Boyuna değerlendirilmiş vivo içinde bir semiautomated microcomputed tomografi tabanlı nicel yapısal analizi kullanarak olabilir bir çıplak sıçan vertebral kompresyon Osteoporoz ile ilgili kırık modeli oluşturmak için bu iletişim kuralını hedefidir.

Semiautomated boyuna Microcomputed tomografi tabanlı nicel yapısal analizi bir çıplak sıçan vertebra kırığı Osteoporoz ile ilgili Model

Önerilen protokol, multimodal analizler kullanarak kemik rejenerasyonu bağlamında kemik oluşumunu değerlendirmek için küresel bir yaklaşım gerektirmektedir. Yeni kemik oluşumu hakkında kalitatif ve kantitatif bilgi sağlamayı, temel ve klinik öncesi araştırmaların titizliğini ve geçerliliğini artırmayı amaçlar.

Ex Vivo Modelde Doku Mineralizasyonunun Kapsamlı Karakterizasyonu

Murin kemik iliği yaralanması modeli, intramembranöz ossifikasyon yoluyla doğum sonrası osteogenezi incelemek için yararlı bir araçtır. Bu basitleştirilmiş cerrahi protokol, yaralanma sonrası yeni kemik oluşumunun ve hücresel yanıtların aşağı akış değerlendirmesi için kemik iliği ablasyon prosedürünü tanımlar.

Bir Murin Kemik İliği Yaralanması Modelinde İntramembranöz Ossifikasyon Yoluyla Postnatal Osteogenezi İncelemek için Geliştirilmiş Metodoloji

Burada, ABE kaplı kitosanı kemik içi enjeksiyon ile doğrudan kemik iliğine ileten bir gen tedavisi yaklaşımı sunuyoruz.

Kitosan Nanopartiküllerin İntraosseöz Enjeksiyonu Kullanılarak Gelişmiş Gen İletimi ve Ekspresyonu Kapsüllenmiş Adenin Baz Düzenleyici Plazmitler

Keşfedin yeni bir gen transferi tekniği ile in vivo osteoklast farklılaşmasını ve fare kemik iliği makrofajlarından in vitro osteoklast üretimini. Sitokinlerin kemik hücreleri üzerindeki etkilerini anlamak için güçlü bir araç sunar.

Bir Roman In vivo Gen Transferi Tekniği ve In vitro Hücre Tabanlı Tahliller

Daha fazla video keşfet