Name: Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, Drosophila melanogaster'dan küçük RNA türlerinin geliştirilmiş Northern Blot yöntemiyle nasıl algılandığını. Bu protokol, RNA ekstraksiyonu, elektroforez ve otoradyografi adımlarını içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Institut National de la Sante et de la Recherche Médicale tarafından desteklenen, Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, Hopital de Strasbourg, pour la Recherche Derneği sur le Kanser, Institut National du Kanser, Agence Nationale de la Recherche ve Bölge Alsace. Pietro LaNeve la Recherche Médicale Fondation tarafından dökün desteklenmiştir. Şu anda, o bir Istituto Italiano Tecnologia (İİT) bursu bir alıcı. Yayın maliyetleri Neurex ağı tarafından desteklenmektedir (TriNeuron - Program İnterreg IV Yukarı Ren)

1. Numune Toplama <ol><li> Pipetleme yarı yapışık Schneider&#39;in 2 hücreleri, (ortalama 1-5 x 10 6 hücre), ayırmak ve santrifüj (1 dakika için 100 xg) hasat. In vitro kültürlenmiş hücrelere yapışık durumunda, standart koşullarda bunları trypsinize veya doğrudan bir hücre kazıyıcı yardımı ile, RNA ekstraksiyon reaktifi için uygun bir miktar içine levhalardan toplarlar. </li><li> Embriyo toplanması için, sinek kafeslerde Drosophila suşları büyümeye ve izin embriyolar yumurta döşeme plakaları üzerinde birikir. Damıtılmış su içinde bir fırça (dH 2 O) embriyolar siliniz, elek filtreleme tarafından enkaz atmak yıkayınız ve bir şişe 48 embriyolar kurtarmak. </li><li> Bir diğer yöntem olarak, elle dokular / organlar teşrih. Vis gibi diseksiyon iğneler veya forseps kullanılarak, bir stereo mikroskop (20 X büyütme) altında, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde, Drosophila karın testisler (piRNA analizi için tercih edilen bir sistem) yalıtmakSullivan ve arkadaşları 49 ayırd. </li><li> Pestle RNA ekstraksiyon reaktifi 0.5 hacim bağımlılığı üzerine örnekleri homojenize. </li></ol> 2. RNA Ekstraksiyon / Analiz <ol><li> Aşağıdaki Üreticilerin talimatları ticari reaktif ile RNA izolasyonu gerçekleştirmek. DİKKAT! RNA ekstraksiyon ajanlar genellikle zehirli ve yakıcı vardır. Alternatif bir şekilde, RNA izolasyonu için bir 50 Proteinaz K tabanlı bir protokol uygulanır: <ol><li> Durdurma Mix 400 ul numune içine seyreltilir ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Kloroform: izoamil alkol ve kloroform ekstraksiyonu ve etanol (EtOH) çöktürme / yıkama, standart fenol suda çözülebilen komponentlerin reküperasyonu. Hava örnekleri kuru ve dietilpirokarbonat (DEPC) içine tekrar süspansiyon çift (dd) H 2 O damıtılmış -lı </li></ol></li><li> UV spektrofotometrik ölçümü ile RNA konsantrasyonu değerlendirin. Ayrıca, RNA saflık 2.0 civarındadır, yüksek bas sağlamakA 260 üzerindeki ed / A 280 okuma. </li><li> Aşağıdaki gibi agaroz jeli denatüre edici RNA, hazırlık Kontrol <ol><li> Bir temiz bir beher içinde, sürekli karıştırma altında, DEPC ile GKD 2 O 82 ml, 1.2 g Agaroz çözülür. Tamamen eriyene kadar kaynatın. </li><li> Jel solüsyon soğumaya bırakın; sıcaklığı 60 ° 10X 4-morfolinpropansülfonik asit 10 ml eklemek C ulaştığında (MOPS) 1X son konsantrasyonda (YP) için tampon, ve 8 ml 3 formaldehit% 37% FC. DİKKAT! Formaldehit kanserojen. </li><li> Yatay elektroporez hücresine jel dökün. Jel en az 1 saat boyunca bir başlık altında katılaşması için izin verin. Katılaşma sonrasında, MOPS 1X içine jel daldırın. </li><li> Tümbölen RNA numunesinin 2 mikrogram ve Ladder 1 mikrogram (doğru değerlendirilmesi istendiğinde bir RNA işaretleyici kullanın). RNA agaroz yükleme boyası (ALD) 3 cilt ve Ladder&#39;a. Sıcaklık 70 ° C&#39;de 5 dakika boyunca buz üzerinde ve hemen serin. CAKatkı! ALD İçeriği (etidyum bromür ve formamiddir, Malzeme bakınız) sırasıyla, mutajen ve aşındırıcı. </li><li> Örnekleri yükleyin ve arada tampon geri dönüşümü ile yaklaşık 1 saat boyunca 50 V de jel çalıştırın. UV görselleştirme veya jel görüntüleme ile RNA fraksiyon desenini kontrol edin. 28S ve 18S rRNA ve tRNAs tekabül eden somut bantları tanır (Şekil 1). </li></ol></li><li> -80 ° C&#39;de Kuzey Testi veya saklamak RNA devam edin. </li></ol> 3. denatüre Akrilamid Jel Hazırlanması <ol><li> Bu bölme aşamasında için küçük bir dikey elektroforetik cihazı (plaka boyutu yaklaşık 8 cm x 9 cm, tarak kalınlığı 0,75 mm) kullanın. </li><li> Bir döküm çerçeve içinde birbirine temiz gözlük birleştirin. </li><li> (19: 1), MOPS 1X çözelti, 7 M üre,% 10 akrilamid / bis-akrilamid, 10 ml hazırlayın. Dökümden hemen önce,% 10 amonyum persülfat ve TEMED 100 ul, 10 ul ve süratli bir şekilde karıştırın. DİKKAT! Akrilamid nörotoksik ve kanserojendir. </li><li> Cam plakalar arasındaki jel dökün ve kabarcıkları önlemek için dikkatli iyi tarak yerleştirin. Jel, kullanılmadan önce en az 45 dakika boyunca oda sıcaklığında polimerize edelim. Alternatif olarak, jel O / N, su ile ıslatılmış filtre kağıdı ile sarılmış ve saran sargısına kapalı olarak muhafaza edilebilmesi. </li></ol> 4. Numune Hazırlama <ol><li> 0,5-20 kısım her numune için toplam RNA&#39;nın ug. 3-4 ul hacim aşarsa, vakum örnek kurutun. </li><li> Boyut tayini için bir belirteç olarak (hazırlanması için, Bölüm 4.3 ve 4.4), örnekler paralel radyo-etiketli düşük frekans merdivenin bir kısım (20-30 cps) çalıştırın. Aşama 4.5 de tarif edildiği gibi, örnekler paralel olarak işleme tabi tutmaktadır. </li><li> Merdiven: 10 bp-merdivene 0.1 ug kullanılarak fosfat ileri reaksiyonu kurmak. 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve 20 mM FC kadar etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave ederek reaksiyonu durdurun. </li><li> EtOH yağış / yıkama, kuru hava ve saflaştırarakGKD 2 O (yaklaşık 100 ul). tekrar süspansiyon DİKKAT! 32 P radyoaktif bir kaynağıdır. </li><li> Her bir numune için akrilamid mavi boya (ABD) bir eşit hacmi ekleyin. 5 dakika boyunca 80 ° C&#39;de ısıtılarak denatüre etmek ve yükleme. DİKKAT kadar buz üzerinde serin! Formamid (ABD cinsinden) aşındırıcıdır. </li></ol> 5. Elektroforetik Fraksiyonasyon <ol><li> Döküm destek cam plakalar çıkarın ve düzgün elektroforez hücrede bir araya. Yeterli Running Buffer (RB), her iki iç ve dış bölmeyi doldurun. </li><li> Yavaşça tarak kaldırmak ve 10 dakika boyunca 200 V&#39;de jel ön çalıştırın. Yükleme örnekleri önce, bir şırınga aracılığıyla bazı RB squirting kuyulardan üre mevduat silsin. </li><li> Düz ipuçlarına her oyuğa altındaki aşama dikkatlice 4,5 tabakalandırmak örnekleri için. Ters akmasını önlemek için anot ve katot bağlantıları kontrol edin. Numuneler 5 dakika boyunca 100 V&#39;ta jel girdikten sonra, ben200 V&#39;a voltajı arttırın </li><li> Yaklaşık 7 cm uzunluğunda, bir fraksiyonlara ayırma, bir 45 dakika süren bir çalışma yeterlidir. Jel taşma Bromofenol mavisi (ABD bir izleme pigment) kaçının. </li><li> Tercihe bağlı bir adım olarak, etidiyum bromür (EtBr) boyama ile parçalanmış uzun RNA jel üzerinde: Görsel <ol><li> Jel üstünden uzağa 2 cm kesmek ve kısaca GKD 2 O. dilim durulayın </li><li> RB, EtBr 0.5 ug / ml YP nazik karı koca gibi yaşayacaklar ile 15 dakika boyunca oda sıcaklığında jel dilim inkübe edin. </li><li> RB 15 dakika jel destain, UV ışınlaması veya jel görüntüleme uzun rRNA görselleştirmek. RNA yükleme ve kalitesi (bkz Şekil 1, Panel 7). DİKKAT edin! Etidyum bromür bir mutajen. </li></ol></li><li> Bu arada küçük RNA türlerini içeren jel alt kısmı blot devam edin. </li></ol> 6. Jel Blot <ol><li> 6 lekeleme alanına sığdırmak için kurutma kağıdı parçaları ve uncharge eşdeğer bir parça kesmekd naylon membran. Kağıt yapraklarını, membran ve RB 2 blot pedleri nemlendirin. Tamamen art arda RB onları sıkarak pedleri emmek için emin olun. </li><li> Aygıtından jel çıkarın ve bir spatula ile ortalama gözlük açın. Kuyu kaldırmak için temiz bir kesici kullanın. Jel ıslak whatman bir kağıt yerleştirin ve hafifçe yukarı kaldırın. </li><li> Jelin serbest yüzünde bir naylon zar yerleştirin. Numune yükleme işlemi göre olan filtre yönlendirmek için bir köşe işaretleyin. &quot;Sandviç&quot; (3 Kağıt parçalarını her tarafı) tamamlayın. Olası bir hava kabarcıklarını çıkarmak için, yüzey üzerinde leke plastik çubuk döndürün. </li><li> Blot kaset iki lekeleme pedleri ve daha sonra arasındaki blot yerleştirin. , Blot modülü kaseti monte RB ile bölmeyi doldurup (jel ve pozitif terminali arasında kalmalıdır naylon membran) doğru yönde kontrol edin. </li><li> 20 dakika boyunca 20 V aktarın. Not: 10 dakika kurutma modülü ve r açtıktan sonra, homojen koşulları sağlamak içintransferi tamamlamadan önce 180 ° sandviç otate. </li></ol> 7. Membran Çapraz <ol><li> Taze Çapraz Çözüm (XLS) 6 ml hazırlayın. Doyurabilecek 10 cm (naylon membran daha büyük) 10 cm XLS. DİKKAT kurutma kağıdı parçası x! HCI (XLS bir bileşeni) son derece yakıcıdır. </li><li> Blot sökün ve ıslak 3MM filtre kağıdı üzerinde membran yerleştirin. Not: RNA, doymuş kağıt ile doğrudan temas halinde olmamalıdır. Iki cam levha arasında filtresi ve kağıdı yerleştirin ve Saran-şal sarın. </li><li> Bir GKD 2 O yıkama, ardından 2 saat boyunca 60 ° C &#39;de membran, ısıtın. -20 ° C&#39;de saklayın veya melezleşme geçin. </li></ol> 8. Membran melezleme <ol><li> RNA yükleme (isteğe bağlı adım 5.5) kontrol edilmiş ise, doğrudan melezleme devam edin. Ya da, bir naylon filtreden en üstüne uzak 1 cm kesmek sistemi çapraz hybridizatio bilmekparçalanmış uzun RNA&#39;lar ns. </li><li> 37 ° C&#39;de hibridizasyon çözeltisi (HS) 10 ml ön ısıtma. , 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de somon spermi, 1 mg denatüre buz üzerinde serin ve hümik ekleyin. </li><li> , Bir hibridizasyon etüvü içinde dönme altında, en az 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de HS filtreyi inkübe edin. Filtrenin RNA tarafı HS karşı karşıya olduğunu kontrol edin. </li></ol> 9. Probe Sentez <ol><li> 4.3 de tarif edildiği gibi, belirli bir antisens oligonükleotid olarak 10 pmol bir fosfat ön reaksiyonu ayarlayın. </li><li> (EtOH ya da çökeltme yoluyla) Tris-EDTA-NaCl (TEN) 5 hacim, reaksiyona tampon ve bir Sephadex G-25 sütun üzerinde jel dışlama kromatografisi ile birleşmemiş nükleotidlerden işaretli primer arındırmak ekleyin. Prob aktivitesi sıvı parıltı sayacı ile değerlendirilebilir. </li></ol> 10. Membran Hibridizasyon <ol><li> 10 ml taze alikot (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan ve tamamlanan) ile bitmiş HS değiştirin. Isı için sondaBuz üzerinde serin ve yeni ekle HS 10 dakika boyunca 95 ° C olarak ölçülmüştür. 37 ° C AÇIK filtreyi inkübe. </li></ol> 11. Membran Yıkama <ol><li> Hibridizasyon çözüm kurtarmak ve bir radyoaktivite-koruyucu kutusuna -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Yıkama Tamponu (WB) &#39;de durulayın ve oda sıcaklığında 10 dakika süre ile iyice yıkayın. </li><li> Filtre köşelerde bakiye radyoaktivite kontrol etmek için bir Geiger Mueller Dedektörü kullanın. Arka plan emisyon yaklaşık 5 cps olduğunda, fuar zar geçin. </li></ol> 12. Sinyal Algılama <ol><li> Otoradyografisidir filmlerde ya da moleküler görüntüleme ekranı ON filtreyi Açığa. Fotografik işleme veya dijital dönüşüm ile sinyallerini veriyor. </li><li> Özel ölçüm yazılımı (İmageJ veya Optiquant) tarafından bant yoğunluğu analiz edin. </li></ol> 13. Membran sıyırma <ol><li> Soyma çözeltisi kaynayan 500 ml su altında, zar birincil sinyalleri kaldırmak için, Daha sonra 1 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Yeni bir (ön) hibridizasyon ile devam ya da -20 ° C&#39;de filtre saklayın. </li></ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

RNA nörogenezi düzenleyen hangi aracılığıyla intertwining sophisticate bizim takdir sürekli artmasına rağmen, nöral kök hücre biyolojisi, nöronal farklılaşma / fonksiyonel entegrasyon, sinir patolojileri ve kanser gelişimini etkileyen RNA bazlı circuitries mekanik etkileri keşfedilmemiş kalır. Drosophila kısa kodlamama RNA&#39;lar ve transkripsiyon faktörleri majör moleküler oyuncuları olarak hangi keşfedilmemiş hücresel yollar, çözülmeye enstrümantal melanogaster gibi krallıklar aracılığıyla bu ağları...

RNA biyokimya geçmiş yıllarda 1 muhteşem ilerlemeler yaşanmıştır. Gen ifadesinin kontrolü RNA potansiyeli son anlama yeni RNA bazlı düzenleyici mekanizmaların 3,4 keşfedilmesiyle ve bilinen transkripsiyon sonrası olayların bir derin karakterizasyonu ile, güçlü bir kodlayıcı olmayan ribo-düzenleyiciler 2&#39;nin tanımlanması ile patlama edilmiştir 5. Hep birlikte bu çalışmalar izin RNA biyoloji dramatik güncel bilimsel peyzaj önemli bir araştırma konusu haline sahneyi yapmak. Özellikle, son yıllarda biz moleküler nörobiyoloji 6, modern hayatın bilimde en dinamik araştırma alanlarında birinde &quot;RNA dünyası&quot; yaygın etkisi duygusu alıyorsanız. Geçtiğimiz yüzyılın son on yılında, toplam bilimsel senaryo RNA müdahelesi 7,8 keşfiyle ve küçük düzenleyici RNA&#39;ların 9,10 devrim olmuşturmicroRNA özellikle 11 ile ilgili olarak, endojen gen ekspresyonu ve kombinasyon pleiotropik düzenleyici olarak hemen hemen tüm hücre fonksiyonlarının düzenlenmesinde implike küçük kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar ifade edilmiştir. MiRNA&#39;ların yüksek sayıda Drosophila ve de 12-15 insan hücrelerinde tespit edildiğinde neredeyse 10 yıl Ambros ve Ruvkun laboratuarlarında tarafından Caenorhabditis elegans miRNA ilk keşiften sonra, yenilenen dikkat alanına döndü. O zamandan beri, çok yönlü transgenik yaklaşımları sayesinde, Drosophila melanogaster miRNA biyosentezi ve aktivite araştırılacağı değerli bir biyolojik bağlamda olarak durdu. Drosophila miRNA&#39;ların yolları, metabolizma yaşlanma sinyalizasyonu kapsayan,-böcek spesifik veya evrimsel olarak korunmuş süreçlerinde farklı işlevleri ortaya çıkarmıştır , davranış ve, elbette, nörojenez. Bu doğrultuda, son zamanlarda ilginç co bir roman bağlantı 16 tanıttıana gen gsm / kayma ve RNA yolun arasında meydana gelen rrelation. Sinek transkripsiyon faktörü GCM / Glide 17-19 multipotent glial vs nöronal kaderi seçim nöral öncüleri 20 uçmak dikte hücre kaderinin belirleyicisi, eşsiz bir örneğini oluşturmaktadır. Yirmi yıl bu konu üzerinde uzun araştırmalar gsm / üzerinde yakınsak gen ekspresyon düzenleme çoklu ve çakışan girdilerin oluşumunu nöral gelişim sırasında nöronal ve glial meslektaşları arasındaki hassas oranını dengelemek için gerekli eşik seviyelerini kurmak için 21-28 kayma altını açıkça gelmiştir. Biz DMEL-miR279 hedefleme yoluyla düzenlemenin gsm yayınlayabilmesine-transkripsiyonel ince ayar / ifadesini 16 kayma katkıda bulunan bir diğer kontrol düzeyi temsil keşfetti. Küresel olarak, bu araştırma çizgiler gerektirmiştir belirli metodolojik iyileştirmeler: yıllar boyunca, çeşitli teknolojiler aslında trad analiz etmek için geliştirilmişitional RNA&#39;lar gibi küçük olmayan bir kodlama RNA miktarının belirlenmesi için dönüştürülmüş, RNase koruma tahlilleri, cDNA dizileri 29-31, gerçek zamanlı PCR yöntemleri 32-35 ve 36,37 dizi analizi gibi. Diğer taraftan, teknik yaklaşımlar yeniden kalibre alanında sürekli ilerlemeler önemli avantajlar sağlamaktadır. Northern blot analizi (nb ya da RNA jel leke analizi) temsili bir örneğini teşkil eder: Bu boyut belirlenmesi yanı sıra, her iki ekspresyon seviyesi kantitatif sağladığından büyük ölçüde, RNA birikmesine profil kullanılır. Bununla birlikte, yöntemin içsel zayıf hassasiyet kısa RNA gibi, düşük miktarda gen ifadesi ince ayarlayıcıları uygulanacak olduğunda sınırlayıcıdır. Bir zararlı sonucu belirli biyolojik numunelerin zor başvurusunu yapan toplam RNA, büyük miktarda gerekliliktir. Bu gibi sebeplerle, küçük RNA&#39;lar tespiti için spesifik NB varyantları için 38-40 geliştirilmiştir: Biz geliştirilmiş NB yordam yararlandıedure 41 (ENB, Gelişmiş Northern Blot), DMEL-miR279 ve gsm / kayma arasındaki yukarıda belirtilen etkileşimi durulaştırmada ederken. Bu yöntem, bir karbodiimid türevi aktivitesine dayanarak diğer kimyasal çapraz bağlama adımı dayanır [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid, EDC] bir katı destek üzerine sabitlemek için bir nükleik asit. Karbodiimid aktive karboksil veya fosfat grupları ve amin grupları arasında amid 42 bağların oluşumunu katalize etmek üzere bilinen çok yönlü bir çapraz bağlayıcıdır. Bu özellik, naylon membran yüzeyinde amino gruplarına da mono-fosforile edilmiş 5&#39;-hidroksil grubu vasıtasıyla kovalent olarak çift küçük RNA&#39;ların etmek için kullanılabilir. Elde edilen bağlantı konfigürasyonu, sırayla, dikkate değer tespiti ile sonuçlanan iyileştirme 43 prob hedef hibridizasyon verimliliğini hareketsizleştirilmiş nükleik asidin erişilebilirliğini arttırmaktadır. Bu teknik belli relevanc kabulDrosophila moleküler çalışmalar e, hangi küçük kodlamama RNA&#39;lar yeni ve farklı sınıfların oluşumu 44 ortaya çıkmaktadır. Bunlar arasında, 45,46 diziye özgü gen susturma katılan piwi etkileşen RNA&#39;lar (piRNAs 47), belirli bir alt tipi teşkil rasiRNAs. Bu yöntemin operasyon detayları tam olarak tarif edilen ve bir rasiRNA, rasi4 arasında, ilk kez, microRNA DMEL-miR279 ve DMEL-miR286 analizine göre ve bundan sonra görselleştirilebilir. Biz RNA (az 1 mikrogram) minimal miktardaki kötü ifade hedeflerini ortaya bize izin bu yöntemi, extremes itti.

<table><tbody><tr><td>NİHAİ BİLEŞİM/İSİM</td><td>ŞİRKET</td><td>KATALOĞU (Stok)</td><td>YORUMLAR</td></tr><tr><td colspan="4">GENEL GEREKSİNİM</td></tr><tr><td>Santrifüj, 5418</td><td>Eppendorf</td><td>5418 000.017</td><td></td></tr><tr><td>Dekontaminant, RNase Away</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83931</td><td>Cam/plastik eşyalara uygulayın, silin ve durulayın</td></tr><tr><td>RNase inhibitörü, DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>Tehlikeli //// 1609-47-8</td></tr><tr><td colspan="4">NUMUNE HAZIRLAMA</td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop, M60</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS Tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>137 mM NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>2.7 mM KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>7447-40-7&nbsp;</td></tr><tr><td>10 mM Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td>7558-79-4&nbsp;</td></tr><tr><td>1.8 mM KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>7778-77-0&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">RNA EKSTRAKSIYONU/ANALİZİ</td></tr><tr><td>UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Jel Görüntüleyici, ChemiDoc XRS+</td><td>Biorad</td><td>170-8265</td><td></td></tr><tr><td>Yatay Elektroforez, Mini-Alt Hücre GT</td><td>BioRad</td><td>170-4487EDU</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyon reaktifi, TRIzol Reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15596026</td><td>Tehlikeli</td></tr><tr><td>PCA (25:24:1), ekstraksiyon için 1:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617</td><td>136112-00-0</td></tr><tr><td>Klorofor, ekstraksiyon için 1:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>67-66-3&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EtOH, 2.5 hacim. yağış için, yıkama için% 70</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59844</td><td>64-17-5&nbsp;</td></tr><tr><td>Gen Cetveli 1Kb DNA Merdiveni</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td></td></tr><tr><td>Karışımı Durdur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>300 mM NaOAc, pH 5.5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>127-09-3</td></tr><tr><td>1x RSB Çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%2 sodyum dodesil sülfat (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Yağışı önlemek için SDS'yi asla soğutmayın&nbsp; //// 151-21-3</td></tr><tr><td>2 mg/ml Proteinaz K</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler</td><td>0-3115828001</td><td>EC 3.4.21.64 9</td></tr><tr><td>10X Retikülosit Standart Tamponu (RSB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mM Tris-Cl, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td>1185-53-1&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM</td><td>NaCl Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>30 mM MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>7786-30-3</td></tr><tr><td>Denatüre Agaroz Jel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%1.2 Agaroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Jelinin en az 1 saat katılaşmasına izin verin //// 9012-36-2</td></tr><tr><td>10X MOPS Tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M MOPS sodyum tuzu, pH 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9381</td><td>MOPS sodyum tuzunu ile karıştırmayın MOPS //// 71119-22-7</td></tr><tr><td>Agaroz Yükleme Boyası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS Tampon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%3 formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Tehlikeli //// 50-00-0</td></tr><tr><td>%50 formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Tehlikeli //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Etidyum bromür (EtBr) 30 &mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Tehlikeli //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">KÜÇÜK RNA FRAKSIYONASYONU</td></tr><tr><td>Düz jel yükleme uçları</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>LC1002</td><td></td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Konsantratör</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>DNA120</td><td></td></tr><tr><td>Dikey Elektroforez, Mini-PROTEAN Tetra Hücresi&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-8000</td><td></td></tr><tr><td>Denatüre Edici Akrilamid Jel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%10 Akrilamid/Bis-Akrilamid (19:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3449</td><td>Tehlikeli. Kullanmadan önce jelin 45 dakika polimerize olmasına izin verin</td></tr><tr><td>1x TBE Tamponu (veya 1x MOPS Tamponu)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7 M üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504</td><td>57-13-6</td></tr><tr><td>%0.1 amonyum persülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215589</td><td>7727-54-0&nbsp;</td></tr><tr><td>% 0.1 TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td>110-18-9</td></tr><tr><td>Gen Cetveli Ultra Düşük Aralıklı DNA Merdiveni (10 bp-adım)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SM1211</td><td>Etiketi 0.1 & mu; g, "prob etiketleme" reaksiyonunda açıklandığı gibi</td></tr><tr><td>Akrilamid Mavi Boya&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%50 formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47670</td><td>Tehlikeli //// 75-12-7</td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>115-39-9&nbsp;</td></tr><tr><td>Çalışan Tampon (RB)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x MOPS Tamponu&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alternatif RB: 1x TBE Tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBE Tamponu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5X TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>445 mM Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>445 mM borik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>10043-35-3</td></tr><tr><td>20 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Jel Boyama Çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür 0.5 & mu; g/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>Tehlikeli //// 1239-45-8</td></tr><tr><td>1x RB</td><td></td><td></td><td>EtBr ile 15 dakika leke, EtBr</td></tr><tr><td colspan="4">BLOTTING olmadan 15 dakika lekeleyin</td></tr><tr><td>3MM Whatman kağıdı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td></td></tr><tr><td>Nötr Naylon Membran, Hybond NX</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>RPN203T</td><td>Işığa duyarlı</td></tr><tr><td colspan="4">ÇAPRAZ BAĞLAMA</td></tr><tr><td>Çapraz Bağlama Çözeltisi (XLS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%1 1-metilimidazol (h/h)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336092</td><td>Her zaman taze bir XLS alikotu hazırlayın //// 616-47-7</td></tr><tr><td>12,5 mM HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Tehlikeli //// 7647-01-0</td></tr><tr><td>%3,1 EDC (w/v)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>25952-53-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">(PRE)-HİBRİT</td></tr><tr><td>Sıvı Sintilasyon Sayacı&nbsp;</td><td>Beckmann</td><td>LS 6500</td><td></td></tr><tr><td>Kesilmiş Somon Spermi, 0.1 mg/ml&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>rasi4 anti-sens prob</td><td></td><td></td><td>5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'5s-rRNA</td></tr> <tr><td>anti-sens prob</td><td></td><td></td><td>5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'Dmel-miR279</td></tr> <tr><td>anti-sens prob</td><td></td><td></td><td>5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'Dmel-miR286</td></tr> <tr><td>anti-sens prob</td><td></td><td></td><td>5'- AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'Arıtma</td></tr> <tr><td>Kiti, Illustra MicroSpin G-25 Sütunları</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>(Ön)-Hibridizasyon Çözümü (HS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0.5 SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>151-21-3&nbsp;</td></tr><tr><td>5x Denhardt'ın Çözümü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20X SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.6 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0.2 M sodyum fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td>7601-54-9&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>20 mM EDTA (pH 8.0)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>&nbsp; 60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>50x Denhardt'ın Çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%1 Ficoll 400 (h)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>26873-85-8</td></tr><tr><td>%1 Polivinilpirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td>9003-39-8</td></tr><tr><td>%1 BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>9048-46-8&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1X TEN Tampon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl (pH 8.0)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1 &nbsp;</td></tr><tr><td>100 mM</td><td>NaCl Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>7647-14-5&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>1 mM EDTA (pH 8.0)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Prob Etiketleme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4 & mu; M oligonükleotid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 & mu; l Ci/&mu; l [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG002A</td><td>Tehlikeli //// 51963-61-2</td></tr><tr><td>1x T4 Polinükleotid Kinaz Tamponu</td><td>Biolabs</td><td>B0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polinükleotid Kinaz 0.5 birim/&mu; l</td><td>Biolabs</td><td>M0201</td><td>EC 2.7.1.78</td></tr><tr><td colspan="4">YIKAMA</td></tr><tr><td>Geiger Mueller Dedektörleri</td><td>Canberra Industries</td><td>MCB2/CPS &ndash; </td><td></td>EM77021</tr><tr><td>Yıkama Tamponu (WB), 2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıkı Yıkama Tamponları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2x SSPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x SSPE, %0,5 SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2x SSPE, %0,5 SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SİNYAL ALGILAMA</td></tr><tr><td>PharosFX Plus Sistemi</td><td>Biorad</td><td>170-9460</td><td></td></tr><tr><td>Resim J</td><td>Ücretsiz olarak temin edilebilen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miktar Bir</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-ray filmleri, BioMax XAR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5888</td><td></td></tr><tr><td>X-ray filmleri için Işığa Duyarlı Geliştirici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td></td></tr><tr><td>X-ray filmleri için Sabitleyici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SIYIRMA</td></tr><tr><td>Sıyırma Çözeltisi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl pH 8.8</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>77-86-1&nbsp;</td></tr><tr><td>5 mM EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td>60-00-4&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>%0,1 SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>Köpürmeyi önlemek için kaynattıktan sonra SDS ekleyin //// 151-21-3</td></tr></tbody></table>

küçük rna türlerin northern blot algılama geliştirilmiş drosophila melanogaster

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

Geçen yıl RNA düzeyinde gen ekspresyon kontrol mekanizmaları etrafında bilimsel ilgi patlaması yaşandı. Moleküler biyoloji dalı ölçüde post-transkripsiyonel düzenlenmesinde önemli oyuncu olarak RNA&#39;lar kodlamayan keşfiyle tarafından desteklendi. Böyle bir devrimci perspektif yüksek verimlilik düzeyi (genom tanımlama) ya da tek aday analizi (spesifik türlerin kararlı durum birikimi) gibi hem, eşlik ve kısa RNA&#39;lar ifade profilleme için güçlü teknolojilerin geliştirilmesi tarafından tetiklenen olmuştur. Birkaç state-of-sanat stratejileri dozlama veya kaçan moleküllerin görüntülenmesi için mevcut olmasına rağmen, Northern Blot tahlil RNA ifade anında ve doğru değerlendirilmesi için moleküler biyolojide uygun yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu birçok durumda daha sofistike, pahalı teknolojiler ve uygulama doğru bir ilk adım, kolayca anlayışlar kazanmak için tercih edilen bir yöntemdir kalır temsilRNA biyoloji içine. Burada elle larva / yetişkin dokular kesilmiş ya da in vitro kültürlenmiş hücrelerde, insan embriyosu Drosophila melanogaster ikinci zayıf eksprese microRNA (ya da diğer küçük düzenleyici RNA türlerini) tespit edilmesi için (Kuzey Benek Gelişmiş) verimli bir protokol genel bakış. RNA çok sınırlı bir miktarı ve sitometri izole edilmiş hücreler olabilir, akış malzeme kullanımı da öngörülmektedir.

Şekil 1 'de metinde tarif edilen ve şematik bir şekilde temsil genel prosedür takip edilerek, farklı kökenlerden gelen karmaşık bir RNA örneklerinden küçük RNA'ların tanımını inceledik. (: Agaroz jel fraksiyonasyon denatüre bağlı bir adım) ve çift yüklü Şekil 1'de sunulan deneyde, RNA bütünlüğü açısından kontrol Proteinaz K ekstre Drosophila Schneider 2 hücrelerinden izole edilmiştir. Jelin yarısı nötr bir zar üzerinde kurutulur ve kimyasal olarak çapraz bağlantılı EDC; ikinci ...

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Bu prosedürün genel amacı, Deano gaster embriyolarından veya dokularından veya hücrelerinden küçük RNA ekspresyonunun tespit edilmesine izin vermektir. Bu, önce seçilen biyolojik kaynaklardan RNA'nın çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, düşük moleküler ağırlıklı göç modellerini çözmek için RNA'yı bir akrilamid jel boyunca elektroforez yoluyla fraksiyonlamaktır.Daha sonra, RNA türleri aktarılır ve kimyasal olarak nötr bir katı desteğe çapraz bağlanır. Son adım, aday molekülleri spesifik antisens problarla tavlayarak etiketlemektir. Sonuç olarak, oto radyografi, analiz edilen moleküllerin ekspresyonunu yansıtan sinyalleri ortaya çıkarmak için kullanılır.Bu cevaplanmamış kuzey blok yöntemi, tam olarak ifade edilen RNA moleküllerinin kararlı durum seviyeleri gibi RNA biyolojisi alanındaki temel soruları cevaplayamaz. Başlamak için, drosophila Schneider'in iki hücresini bir ila beş çarpı, mililitre başına 10 ila altıncı bir yoğunluğa kadar büyütün. Daha sonra yarı yapışık hücreleri pipetleme ile ayırın ve hücreleri bir dakikada 100 GS'de santrifüjleyin.Alternatif olarak, embriyoları yumurtlama plakalarında biriktirin. Embriyoları bir boya fırçası ve damıtılmış su ile silin, çif

enhanced-northern-blot-detection-small-rna-species-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

RNA girişim gen fonksiyonu analiz etmek için çok etkili olduğu...

DsRNA Enjeksiyon RNAi Girişim içine Drosophila Embriyolar

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Bu yöntem, toplam RNA ekstresinden miRNA'ları tespit etmek için kuzey hibridizasyon tekniğinin kullanımını göstermektedir.

Bitki MikroRNAlarının Saptanması ve Ölçülmesi için RNA Leke Analizi

Drosophila, miyogenezi düzenleyen anahtar molekülleri incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, mRNA transkripsiyonel dinamiklerini ve sinsitya içindeki uzamsal dağılımı belirlemek için yetersizdir. Bu sınırlamayı ele almak için, mRNA'ların tek molekül ölçeğinde saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini optimize ettik.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Protokol, Drosophila melanogaster'deki X veya Y kromozomu ribozomal DNA lokusundan türetilen ribozomal RNA transkriptlerini ayırt etmek için tek nükleotid polimorfizmlerine duyarlı floresan in situ hibridizasyon (SNP-FISH) yöntemini tanımlar.

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

Bu makale, reaktiflerle ekonomik olan ve az sayıda hayali disklerin işlenmesini kolaylaştıran verimli bir imaginal disk diseksiyon ve antikor boyama protokolünü tanımlar.

Drosophila melanogaster'den Göz-Antenli ve Kanat Hayali Disklerinin Küçük Ölçekli Diseksiyonu ve Antikor Boyama

Öğrenin, Drosophila melanogaster'dan küçük RNA türlerinin geliştirilmiş Northern Blot yöntemiyle nasıl algılandığını. Bu protokol, RNA ekstraksiyonu, elektroforez ve otoradyografi adımlarını içerir.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster

Daha fazla video keşfet