Name: Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Keşfedin fare fetal bağırsak organ kültürü yöntemiyle sinyal yolaklarını modüle ederek villus gelişimini üç boyutlu canlı görüntüleme ile inceleyin. Bu teknik intestinal organogenez süreçlerini anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. Deborah L. Gumucio'ya danışmanımız olarak ve kültür ve görüntüleme yöntemlerini tanımlamadaki paha biçilmez desteği için minnettarız. Ayrıca Dr. Jim Brodie, Dr. Hong-Xiang Lu, Dr. Charlotte Mistretta ve Dr. Ann Grosse'ye tüm bağırsak organ kültürü sisteminin gelişimine katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Görüntüleme üzerine yapılan faydalı tartışmalarda Dr. Chip Montrose, Michael Czerwinski ve Sasha Meshinchi mükemmel tavsiyeler verildi. Tüm görüntülemeler Michigan Üniversitesi Mikroskopi ve Görüntü Analiz Laboratuvarı'nda yapıldı. Finansman desteği NIH R01 DK065850 tarafından sağlandı.

NOT: Tüm farenin Laboratuar Hayvan Hastalıkları Michigan Tıp Fakültesi Birimi Üniversitesi tarafından onaylanmış ve Hayvanları Kullanımı ve Bakımı Üniversite Komitesi kurallarına göre protokollerini kullanarak insanca ele alındı. 1. Tüm Organ Kültür Sistemi <ol><li> Medya ve kültür plakalarının hazırlanması <ol><li> Bir doku kültürü kaputu, stok şişe edilebilen BGJb ortamdan 5 ml kaldırmak ve Kalem / Strep 5 ml ekleyin. 5 mg / (Pen / Strep) ile edilebilen BGJb ortam 49 ml ml askorbik asit 1 ml ilave etmek suretiyle, 50 ml&#39;lik konik bir tüp içinde bir ortam çalışma stok hazırlayın. </li><li> Transwells her altında 1 ml ilave etmek suretiyle, bir 6 yuvalı kültür plakası hazırlayın. NOT: Tüm 6 transwells kullanılan değilseniz, daha sonra kullanmak üzere yeni bir steril 6 plaka ekstra transwells taşıyın. Üç adet 10 cm steril petri kutularının her birine edilebilen BGJb ortam çalışma 3 ml ilave edilir. </li></ol></li><li> Diseksiyon için Hazırlık <ol><li> 70% Etal içinde diseksiyon araçları batırınve metanol çalışırken temiz araçları tutmak için emin olun. </li><li> Büyük bir buz kovası ile diseksiyon alanı ayarlayın ve 6 kuyu kültür plaka ve buz üzerinde edilebilen BGJb medya ile 10 cm petri kapları yerleştirin. Diseksiyon ve kültür için bağırsakları hazırlarken mümkün olduğunca buz üzerinde çalışın. </li><li> Fetal bağırsakların toplama için servikal dislokasyon izofluoran (100 ul) önce euthanization için olan bir oda içinde erişkin dişi fareler anestezi. </li><li> Onların anneden fetusa hasat ettikten sonra, her fetusun dikkatli grafiği 13 evreleme Theiler göre düzenlerler. Rutin bir tek çöp içinde gözlenen gelişimsel aşamada kadar 24 saat varyasyonları olarak her fetusun yaşını belirlemek için post-koitus günlerde güvenmeyin. </li></ol></li><li> Fetal bağırsak diseksiyonu <ol><li> Bağırsakların kaldırılması için önce, başı kesilerek fetüsleri Euthanize. </li><li> Pla sonra 1x Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) her bağırsak inceleyin veedilebilen BGJb ortamı çalışan bir 10 cm&#39;lik bir petri kabı içine ce. </li><li> Dikkatlice mide, dalak, mide ve oniki parmak bağırsağı üst elde edilen pankreasa, kaldırın. </li><li> Yavaşça doğruldu bağırsak izin mümkün ve yalnızca yeterli bağlantılarını ayıran olduğunca bağlı omentum bırakmak için özen omentum ayırın. Not: yavaşça lümen içeriği bağırsak yoluyla akması ve kesik uçlarından çıkarılmasına imkan vermek için 3 eşit bölümlere ayırmak bağırsak bağırsak E14.5 daha büyük veya daha fazla olanlar, 24 saat daha kültive edilir için. Bununla birlikte, kültürlerin E13.5 önce, serozayı uygun bağırsak uzunluğu boyunca büyümeye izin bağırsak 3 kısımları ayıran önce kültürlenmesi kadar 24 saat sonra başladı bekleyin. </li><li> Kültür plakası (1.1.2) transwells üzerine bağırsak parçaları aktarmak için bir ağız pipeti kullanılır. </li><li> Onlar transwel genelinde düz böylece gerektiği gibi yavaşça bağırsakları yeniden konumlandırmakl. NOT: bağırsaklar tüp yoluyla lümen içeriğini hareket başladıktan sonra, bağırsakta herhangi bir karışıklığı bağırsağa bir yedekleme ve hasara neden olur. </li></ol></li><li> Kültür ve tedavi <ol><li> , Transwell altından medyayı çıkarın transwell altında (ilave rekombinant proteinlerin veya farmakolojik inhibitörleri ile medya çalışma) tedavi medya 700 ul ekleyin. </li><li> Bağırsakların üstüne tedavi medya damla damla 300 ul ekleyin ve transwell yoluyla bekletin. Gerekirse bağırsakları yerleştirin. </li><li> Tedavi reaktif yarı ömrüne bağlı olarak en az günde bir kere ya da daha çok muamele ortam değiştirin. </li></ol></li><li> Tedavi reaktif lokalize bir protein kaynağı batırılmış agaroz taneleri hazırlanması <ol><li> Kendi depolama kabı agaroz boncuklar tekrar ve 1.5 ml mikrofüj tüpüne agaroz boncuklarının 100 ul transfer. </li><li> Steril 1x Ph borunun geri kalan hacim dolumunaosphate-tamponlu salin (PBS) ile yıkamak üzere, taneler üzerine karıştırın. Birkaç dakika boncuklar dibe ve daha sonra tanelerin üzerine PBS kapalı Pipeti izin vermek üzere askıya mikrofüj tüpü yerleştirin. Steril 1x PBS ile mikrofuge&#39;ye tüp dolum ve iki kez daha yıkama işlemini tekrarlayın. </li><li> Iki kez tedavi için istenen konsantrasyona ve ilgi konusu proteini hazırlayın. </li><li> 2x Protein stoklar 5 ul ile yıkanmış agaroz boncuk 5 ul karıştırın ve yavaşça protein boncuk çalkalayın. Yavaşça, 10-15 dakika daha karıştırıldı, 1 saat boyunca buz üzerinde tüp yerleştirin. </li><li> Bağırsakların boncuk yerleştirmeden önce steril 1x PBS kısaca boncuk durulayın. </li></ol></li><li> Agaroz boncukları Yerleştirme <ol><li> Yavaşça çekilmiş kılcal iğneli bir ağız pipeti kullanılarak bağırsakların üst agaroz boncuklar yerleştirin. Kaba işleme bağırsaklara zarar ve yaralı bölgede villus gelişimini önleyecek şekilde aşırı ihtiyatla boncuk yerleştirin. </li><li> Bağırsak peristaltik hareketleri ve kültür zamanla bağırsakların inecektir yerleştirilen boncuklar yaklaşık yarısını geçirecek beri analiz için gerekli iki katı kadar boncuk yerleştirin. </li></ol></li><li> Kültürlü bağırsakların Fixation <ol><li> Dikkatle transwell alttan tedavi ortamı çıkarın ve 3 dakika boyunca havada kurumaya bağırsakları izin verir. </li><li> Daha sonra tespit süresinin geri kalan kısmı için sabitleyici 2 ml bağırsağın üst kapağı, 2 dakika boyunca transwell altında fiksatif 1 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de ya da oda sıcaklığında 2 saat süresince% 4 paraformaldehit O / N sabitleyin. </li></ol></li></ol> Sabit Bağırsaklar 2. Görüntüleme <ol><li> Wholemount görüntüleme <ol><li> DPBS 1x 100 ul, bir lam üzerine (iç floresan ile) bütün bağırsak yerleştirin. Yavaşça bağırsaklara düzenlemek için forseps kullanın. </li><li> Mo doku yapmak için dikkatli bir şekilde% 70 gliserol, 100 ul DPBS çıkarın ve hemen eklemek için bir laboratuar doku kullanınşeffaf yeniden ve görüntüleme olası derinliğini artırır. Not: bağırsağın başka penetrasyon isteniyorsa yerine% 70 gliserol içinde bağırsak Sabitleme, 10-30 dakika boyunca Odak sonuçları çözeltisinin bir kaç damla bağırsak ıslatın. Odak Temizle çözümü kapalı pipetlemeyin Mount Clear bağırsak monte edin. </li><li> Modelleme kil içine lamel dört köşesinden her batırın ve bağırsak düzleştirme lamel tutmak için slayt ve kapak arasında ayırıcı olarak kullanmak için kil küçük bir miktar pick up. </li><li> Bir pamuklu çubukla uygulanan erimiş valap ile slayt üzerine lamel mühür. </li><li> Görüntü ya bir dik veya ters konfokal mikroskop bağırsaklar. Daha fazla ayrıntı için tartışma bakınız. </li></ol></li><li> (Bağırsak yapıların enine kesit görünümü için) sabit bağırsak vibratome kesit <ol><li> Küçük plastik kalıplar% 7 agaroz katıştırmak için bağırsak (10 x 10 x 15 mm), izin agaroz bloklarsoğumaya ve katılaşmaya. </li><li> Anlık yapıştırıcı ile Vibratome toplama aşamasına plastik kalıp ve tutkal agaroz bloklardan agaroz blokları çıkarın. </li><li> Buz gibi soğuk 1x DPBS toplama sahne doldurun. </li><li> 100-150 um arasında bir kalınlıkta kesitler halinde kesilmiştir. Kalın kesitler kesiti içine derin görselleştirmek için (bölüm 2.1.2 açıklanan) takas çözümleri kullanın. </li><li> 4 ° C de depolama için, bir 6-yuvalı plaka içinde bir kuyu içine toplama aşamasından vibratome bölümleri dökün. </li></ol></li><li> Sabit, Vibratome kesitli dokuların İmmünofloresan boyanması <ol><li> 1x DPBS ile bir 24-yuvalı plaka içine, göz başına 5-12 vibratome bölümleri yerleştirin. </li><li> 1x DPBS çıkarın ve oyuk başına geçirgenleştirme çözeltisi 500 ul ilave edin. Yavaşça oda sıcaklığında 25 dakika boyunca sallayın örnekleri. </li><li> Geçirgenleştirmeden sonra, 1x PBS ile numuneleri 3 kere yıkayın. </li><li> Bloke etme çözeltisi 500 ul içinde en az 30 dakika boyunca numune bloke eder. </li><li> Engelleme, e sonraçözümü engelleme seyreltilmiş primer antikor 500 ul engelleme çözüm Xchange ve 4 ° CO / N de örnekleri tutmak. NOT: Dondurulmuş ve parafin bölümlerde işe birincil antikor dilüsyonları genellikle Ancak genellikle bu protokolü (örneğin, BrdU) ile iyi çalışmaz nükleer antijen alımı gerektiren antikorlar, çok Vibratome bölümlerde iyi çalışır. </li><li> Ertesi gün, bloke etme çözeltisi ile 15 dakika boyunca numuneleri her 3 kez yıkayın. </li><li> Yıkamadan sonra, bloke etme çözeltisi içinde seyreltilmiş sekonder antikor, 500 ul de geçerlidir. Oda sıcaklığında 2 saat 45 dakika boyunca örnekleri ışıktan korumak ve kaya florofor için alüminyum folyo ile 24 oyuklu plaka sarın. </li><li> 15 dakika her biri için 1x PBS ile numuneleri 3 kez yıkayın ve Bölüm 2.4 &#39;de açıklandığı gibi slaytlar üzerinde vibratome bölümleri monte edin. </li></ol></li><li> Vibratome bölümleri Montaj <ol><li> Vibratome çift sti ince dilim keserek montaj için slaytlar hazırlayınck bant ve slaytlar uzun kenarları boyunca onları yerleştirerek. </li><li> Dikkatle 1x PBS 100 ul bir damla slaytlar üzerinde çift kaset sopa arası 5-10 vibratome bölümleri yerleştirin. </li><li> Tüm bölümlerini açın ve slaytta tek bir tabaka içine yayıldı. </li><li> Düz oturan bir coverslip engelleyecek herhangi bir aşırı agarozun veya düzensiz parçalarını çıkarın. </li><li> Dikkatle Vibratome bölümler etrafında aşırı 1x PBS kadar emmek için bir laboratuar doku kullanın. </li><li> Vibratome bölümlerin üstüne monte sulu ortam bir damla ekleme ve sonra da lamel. </li><li> Valap bir pamuklu çubukla uygulanan eritilmiş slaytlar üzerine lamelleri Seal. </li><li> Görüntü ya bir dik veya ters konfokal mikroskop vibratome bölümleri. Bir görüntüleme sisteminin seçimi konusunda ayrıntılı bilgi için tartışmaya bakınız. </li></ol></li></ol> Tüm Bağırsaklar 3. Canlı Görüntüleme Bağırsaklar fetuse hasatBağlı omentum sağlam sol s ile E12.5 sonra, başarıyla yukarıdaki sistemini kullanarak kültür içinde villus gelişir. Bu nedenle, bu ex vivo sistem zamanla morfolojilerinden bir üç boyutlu görünüm için yeniden olabilir gelişen bağırsak canlı z-bölüm görüntüler yakalama izin verir. <ol><li> Canlı görüntüleme ayarlama <ol><li> Ince örgülü elek için tek bir polikarbonat membran bağlı anında tutkal. Bu dik konfokal mikroskop daldırma lens aşağıda yerinde bağırsak tutmak için bir destek iskele sağlar. Canlı görüntüleme mikroskoplar seçimi hakkında ayrıntılı bilgi için tartışma bölümüne bakınız. </li><li> Merkezinde iyi bir kültür tepsisi içine elek yerleştirin. </li><li> Polikarbonat membran üzerine disseke bağırsak yerleştirin ve her iki ucunda anlık tutkal bir damla ekleyin. Bağırsak tutturmak için yalnızca yeterli tutkal kullanın, ama ceket o! </li><li> Polikarbonat altında fenol kırmızısının kültür ortamı ücretsiz eklentiMerkezi de kültür plakasında membran. </li><li> Nem temin etmek üzere kültür plakasının dış kenarı için su ilave edilir. </li><li> Görüntüleme sırasında bağırsak hareketini kontrol etmek için ortam 3 ml 1 x PBS&#39;de ksilazin 5 çözeltisi: fetal barsak kültürde peristaltik kasılma benzeri dalgalar maruz kaldığından, 1 100 ul ilave edin. Bu dozaj villus gelişimini ödün vermeden yaklaşık 8-10 saat bağırsak hareketlerini kontrol edecek. </li><li> Bağırsağın bir enine görünüm için, 3-4% agaroz çözeltisi içinde canlı bağırsakları gömmek ve bir vibratom kalın kesitler (150-500 mikron) kesilir. Kesilmiş olarak, bağırsak sertliğe sahip agaroz sertliğini maç ve ampirik olarak bir gelişme aşamasındaki belirlenir. Genellikle,% 3 agaroz çözüm E14.5 daha genç bağırsaklar için iyi çalışır ve% 4 çözelti bağırsaklar E15-E16 için iyi çalışır. </li><li> (Kısım 3.1.1 gibi) gözenekli bir elek tutturulmuş bir polikarbonat membran vibratome bölümleri ve TutkalKültür olarak Bölüm 3.1.2-3.1.6 tarif edilmiştir. </li><li> Ayarlanabilir bir tablo ile dik bir stand üzerine bir iki-foton konfokal floresan mikroskop (690-1,040 nm arasında uyarma lazer) kullanılarak canlı görüntüleme Davranış. </li><li> İki foton lazer GFP sinyalleri için en iyi çözünürlük ile derin penetrasyon sağlar nm 900 ayarlı. Görüntülenir iken bu dokulara zarar azaltır. Buna ek olarak, mümkün olan en düşük emisyon için lazerin gücünü ayarlayıcı, doku hasarı azaltır. Tipik olarak, GFP iyi bir uyarma elde iki foton lazer% 12 güç kullanmak. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Grosse, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+dynamics+in+fetal+intestinal+epithelium%3A+implications+for+intestinal+growth+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell dynamics in fetal intestinal epithelium: implications for intestinal growth and morphogenesis.</a> Development. 138, 4423-4432 (2011).</li>
<li>Walton, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+mesenchymal+clusters+direct+patterning+and+emergence+of+intestinal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive mesenchymal clusters direct patterning and emergence of intestinal villi.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15817-15822 (2012).</li>
<li>Wells, J. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+endoderm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Vertebrate endoderm development.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 15, 393-410 (1999).</li>
<li>Hashimoto, H., Ishikawa, H., Kusakabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+vascular+networks+during+the+morphogenesis+of+intestinal+villi+in+the+fetal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Kaibogaku+zasshi+Journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Development of vascular networks during the morphogenesis of intestinal villi in the fetal mouse.</a> Kaibogaku zasshi Journal of anatomy. 74, 567-576 (1999).</li>
<li>Mathan, M., Moxey, P. C., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+fetal+rat+duodenal+villi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of fetal rat duodenal villi.</a> Am J Anat. 146, 73-92 (1976).</li>
<li>Burns, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+fibroblast+growth+factor+10+or+fibroblast+growth+factor+receptor+2-IIIb+signaling+for+cecal+development+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement for fibroblast growth factor 10 or fibroblast growth factor receptor 2-IIIb signaling for cecal development in mouse.</a> Dev Biol. 265, 61-74 (2004).</li>
<li>Pabst, O., Schneider, A., Brand, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Nkx2-3+homeodomain+gene+is+expressed+in+gut+mesenchyme+during+pre-+and+postnatal+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The mouse Nkx2-3 homeodomain gene is expressed in gut mesenchyme during pre- and postnatal mouse development.</a> Dev Dyn. 209, 29-35 (1997).</li>
<li>Pabst, O., Zweigerdt, R., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+homeobox+transcription+factor+Nkx2-3+in+mice+results+in+postnatal+lethality+and+abnormal+development+of+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the homeobox transcription factor Nkx2-3 in mice results in postnatal lethality and abnormal development of small intestine.</a> Development. 126, 2215-2225 (1999).</li>
<li>Kaestner, K. H., Silberg, D. G., Traber, P. G., Schütz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mesenchymal+winged+helix+transcription+factor+Fkh6+is+required+for+the+control+of+gastrointestinal+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The mesenchymal winged helix transcription factor Fkh6 is required for the control of gastrointestinal proliferation and differentiation.</a> Genes & Development. 11, 1583-1595 (1997).</li>
<li>Madison, B. B., McKenna, L. B., Dolson, D., Epstein, D. J., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxF1+and+FoxL1+link+hedgehog+signaling+and+the+control+of+epithelial+proliferation+in+the+developing+stomach+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">FoxF1 and FoxL1 link hedgehog signaling and the control of epithelial proliferation in the developing stomach and intestine.</a> J Biol Chem. 284, 5936-5944 (2009).</li>
<li>Karlsson, L., Lindahl, P., Heath, J. K., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+gastrointestinal+development+in+PDGF-A+and+PDGFR-%28alpha%29+deficient+mice+implicates+a+novel+mesenchymal+structure+with+putative+instructive+properties+in+villus+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Abnormal gastrointestinal development in PDGF-A and PDGFR-(alpha) deficient mice implicates a novel mesenchymal structure with putative instructive properties in villus morphogenesis.</a> Development. 127, 3457-3466 (2000).</li>
<li>Mao, J., Kim, B., Rajurkar, M., Shivdasani, R., Mcmahon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+controls+mesenchymal+growth+in+the+developing+mammalian+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling controls mesenchymal growth in the developing mammalian digestive tract.</a> Development. 137, 1721-1729 (2010).</li>
<li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheiler%2C+K+%22The+house+mouse.+Development+and+normal+stages+from+fertilization+to+4+weeks+of+age%22">The house mouse. Development and normal stages from fertilization to 4 weeks of age</a>. , 2, Springer-Verlag. (1989).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Mol Cell Biol. 23, 4013-4025 (2003).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Goodrich, L. V., Milenkovic, L., Higgins, K. M., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+neural+cell+fates+and+medulloblastoma+in+mouse+patched+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered neural cell fates and medulloblastoma in mouse patched mutants.</a> Science. 277, 1109-1113 (1997).</li>
<li>Fu, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtome-free+3-dimensional+confocal+imaging+method+for+visualization+of+mouse+intestine+with+subcellular-level+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microtome-free 3-dimensional confocal imaging method for visualization of mouse intestine with subcellular-level resolution.</a> Gastroenterology. 137, 453-465 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak herhangi bir mali çatışması yoktur.

Dinamik yapısı ve gelişen bağırsak karmaşık doku etkileşimleri bu morfogenetik olayların tam bir takdir 3D görselleştirme gerektirir. Görüntüleme Gelişen teknolojiye, yetenek / gelişmekte iyileştirilmesi ve onunla, organogenezis sırasında mekansal iletişim ve etkileşim anlayışı oldukça gelişmiş edilir detaylı olarak villus morfogenetiğine incelemek. Bütün bağırsakları kültürü için alternatif yöntemleri de test edilmiştir, ancak Transwell sistem uzun kültür süreleri ve normal küme ve villus d...

Her bağırsak villusu iki ana doku bölmesinden oluşur: bir epitel yüzey tabakası ve bir mezenkimal çekirdek. Fare ince bağırsağı, embriyonik 10. günde, bir endoderm tabakası kapandığında ve mezenkimal hücreler3 ile çevrili bir epitel tüpü oluşturmak üzere mühürlendiğinde oluşur. Bu düz epitel tüpü hızlı proliferasyona uğrar, hem uzunluk hem de çevre olarak büyür ve dinamik hücre şekli değişikliklerini içeren dramatik yeniden düzenlemelere uğrar1. Aynı zamanda, çevredeki mezenşim, vasküler pleksusun oluşumu, düz kasın farklılaşması ve enterik nöronların toplanması dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreçten geçer4. Embriyonik gün 14.5'te proksimal ince bağırsakta, Kirpi ve PDGF'ye duyarlı hücrelerin yoğunlaşmaları (kümeleri) epitel2,5'e bitişik olarak oluşmaya başlar. Mezenkimal kümelerin oluşumu bağırsağın uzunluğu boyunca yayılmaya devam eder, böylece embriyonik gün 16.52'ye kadar ince bağırsağın tamamını kaplarlar. Mezenkimal kümeler oluştukça, kümelere en yakın epitel hücreleri hücre döngüsünden çekilmeye başlarken, diğer epitel hücreleri çoğalmaya devam eder. Hücre döngüsünden çekilen mezenkimal kümenin hemen üzerindeki hücreler, ortaya çıkan villus lümene bükülürken şekil değiştirmeye başlar. Villusun daha fazla büyümesi, kısmen ortaya çıkan villuslar arasındaki epitelin sürekli çoğalmasından kaynaklanır. Mezenkimal kümeler, büyüyen villusun epiteline sıkıca bağlı kalır ve çeşitli sinyal moleküllerini ifade etmeye devam eder. Villus ortaya çıkma dalgası, mezenkimal kümelerin oluşumunu takiben ince bağırsağın uzunluğu boyunca yayılır. Bağırsak büyümeye devam ettikçe ve intervillus bölgesi ortaya çıkan villuslar arasında uzandıkça, intervillus epiteline bitişik yeni mezenkimal kümeler oluşur ve daha fazla villus ortaya çıkma ve büyüme turları ortaya çıkar6.
Epitel ve mezenşimin senkronize gelişimi villus morfogenezi için esastır. Sinyal molekülleri, epitel ve mezenşim arasındaki gelişimi koordine etmek için reseptörlerin sinyal mesajını aldığı ve aktardığı bir katmandan diğerine salgılanır. Mezenkimal kümeler sinyal merkezleri olarak işlev görür ve çeşitli gelişimsel morfojenleriifade eder 7-10. Küme oluşumunun veya paterninin bozulması villus oluşumunun ve paterninin kaybına neden olur. PDGF sinyalinin inhibisyonu, daha az küme ve daha az villus ile sonuçlanır ve oluşan villuslar, anormal kümeleri takiben şekilsizdir11. Kirpi sinyalizasyonunun kaybı, küme oluşumunun tamamen kaybolmasına ve villus oluşumunun başarısız olmasına neden olur2,12. Birlikte, bu veriler kümelerin villus epitelinin gelişimini mezenkimal çekirdeği ile koordine ettiğini göstermektedir.
Tüm bu organ kültürü sistemini kullanarak, epitelyal-mezenkimal küme çapraz konuşmasında yer alan sinyalleri değiştirerek bu sinyallerin villus morfogenezindeki rolünü belirleyebiliriz. İki fotonlu konfokal optik kesitleme ve rekonstrüksiyon, küme oluşumunu ve villus oluşumunu üç boyutlu olarak görselleştirme ve mezenkimal kümeler ile üstteki epitel arasındaki uzamsal ilişkileri daha iyi anlama yeteneği sağlar. Kültür sistemini dört boyuta genişleterek, zaman içinde gelişmekte olan kümelerin ve villusların z-yığınlarını yakalayabilir ve bu etkileşimleri gözlemleyebiliriz. Sonuç olarak, villus gelişimini bu şekilde takip etme ve değişmiş sinyalleme ile meydana gelen değişiklikleri gözlemleme yeteneği, villus morfogenezindeki epitelyal mezenkimal etkileşimlerin anlaşılmasında devrim yaratacaktır.

<table><tbody><tr><td>İnce diseksiyon forseps&nbsp;</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>&nbsp; 11254-20</td><td>2 çift</td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x steril Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14040-133</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>24 kuyulu plakalar</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm petri kapları</td><td>Şahin</td><td>&nbsp; </td><td></td>451007</tr><tr><td>Transwell plakaları, 24 mm uçlar, 8.0 mm polikarbonat membranlar</td><td>Corning Costar&nbsp;</td><td>3428</td><td>Plaka başına 6 kesici uç</td></tr><tr><td>BGJb ortamı</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>12591-038</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000U/ml Penisilin; 10.000 mg/ml Streptomisin)</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; 15140</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A0278</td><td>, 5 mg / ml stok yapar, filtreler, alikot yapar ve -20 ° C'de saklar; C</td></tr><tr><td>Ağız pipeti (Drummond 1-15 inç aspiratör borusu tertibatı)</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 21-180-10</td><td>aspiratör tertibatını çıkarın ve 1.000 & mikro ile değiştirin; l 6 inçlik bir cam Pasteur pipetini takmak için bir adaptör görevi gören pipet ucu.</td></tr><tr><td>6 inç cam pastör pipetleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kılcal Tüpler</td><td>Dünya Hassas Aletler &nbsp;</td><td>TW100F-4</td><td>iğnelere çekin</td></tr><tr><td>1 x PBS'de yapılan</td><td>%4 Paraformaldehit</td><td></td><td></td>, pH ila 7.3</tr><tr><td>Kültür plakaları</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>353037</tr><tr><td>Hırdavatçıdan</td><td></td><td></td><td>ince gözenekli paslanmaz çelik ekran</td> satın alma</tr><tr><td>Polikarbonat membranlar</td><td>Thomas scientific&nbsp;</td><td>4663H25</td><td>alternatif olarak, Corning Costar 3428 membranlarını transwell desteklerinden kesin</td></tr><tr><td>Hırdavatçıdan</td><td>anında tutkal</td> satın alma <td>jel bazlı tercihen</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm plakalar</td><td>Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>%7 agaroz</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; A9414</td><td>, 1x DPBS'de w / v hazırlayın, bir su banyosunda çözünmek üzere ısıtın</td></tr><tr><td>minutien pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları&nbsp;</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Fenol kırmızı içermeyen ortam (DMEM)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21063-029</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin (100 mg / ml)</td> <td>AnaSed&nbsp;</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>356231</td><td>bazal membran matrisi, büyüme faktörü azaltılmış, fenol kırmızısı içermeyen</td></tr><tr><td>%3-4 agaroz</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A9414</td><td>, 1x DPBS'de w / v hazırlayın, bir su banyosunda çözünmek için ısıtın</td></tr><tr><td>Sabit bağırsakların</td><td></td><td></td><td></td>görüntülenmesi</tr><tr><td>Malzeme/Ekipman Firma Adı</td><td></td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar/Açıklama</td></tr><tr>VALAP yapmak için kullanılan <td>eczaneden</td><td></td><td>vazelin</td><td>alımı: eşit miktarda vazelin, lanolin, parafin</td></tr><tr><td>lanolin</td><td>Sigma&nbsp;</td>VALAP yapmak için kullanılan <td>L7387</td><td>: eşit parçalar vazelin, lanolin, parafin</td></tr><tr><td>parafin</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td>VALAP yapmak için kullanılır: eşit parçalar vazelin, lanolin, parafin</td></tr><tr><td>1 x PBS'de</td><td></td><td></td><td></td>%70 gliserol</tr><tr><td>Focus clear ve Mount Clear</td><td>CelExplorer Labs Co.</td><td>&nbsp; F101-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Modelleme kil</td><td>satın alma, sanat malzemeleri mağazasında</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>çift çubuklu bant</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>pamuk aplikatör çubukları, plastik kalıplar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 10mm x 10mm x 5 mm)</td> <td>Doku Tek&nbsp;</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>slaytlar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lameller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratuvar silme</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td>tüysüz hassas görev silme</td></tr><tr><td>Theiler sahneleme tablosu&nbsp;</td><td></td><td></td><td><a href="http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/%20downloads/theiler2.pdf">http://www.emouseatlas.org/emap/ema/theiler_stages/ indirme/theiler2.pdf</a></td></tr><tr><td>Leica SP5X konfokal mikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Canlı görüntülemeyi yapmak için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Leica DMI 6000 standı&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>Canlı görüntülemeyi yapmak için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>Sulu montaj ortamı (Prolong Gold)</td> <td>Moleküler Problar&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Malzeme/Ekipman Firma Adı</td><td></td><td>Katalog Numarası</td><td>Yorumlar/Açıklama</td></tr><tr><td>24 kuyulu plaka</td><td>Costar</td><td>&nbsp; 3524</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma&nbsp;</td>Geçirgenleştirme çözeltisi yapmak için kullanılan <td>T-8787</td>: Bloke Edici Çözelti yapmak <td>için kullanılan 1 x PBS Keçi serumunda</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>% 0.5 Triton X-100<td>: % 4 Keçi serumu,% 0.1 Tween20 1x PBS</td></tr><tr><td>Tween20 &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; P9416</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

için fare fetal tüm bağırsak kültür sistemi ex vivo sinyal facebook ve villus kalkınma Üç boyutlu canlı görüntüleme manipülasyon

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Fetal bağırsakta en morfogenetik süreçler gelişim aşamaları üzerinde değişikliklerin anlık sağlayarak, sabit dokuların ince kesitlerinin olayla edilmiştir. İnce Seri kesitlerde üç boyutlu bilgiler, çünkü mükemmel seri kesitler yeniden ve seri kesitler üzerinde dokusunun uygun yönünü sürdürmenin zorluğu yorumlamak zor olabilir. Tarafından Grosse ve ark. Son bulgular, 2011 bağırsak 1 gelişmekte villuslarda morfogenetiğine anlamada üç boyutlu bilgilerin önemini vurgulamak. Tek başına etiketli bağırsak hücreleri üç boyutlu yeniden yapılandırma bağırsak epitel hücrelerinin çoğunluğu her iki en üst ve taban yüzeylerine temas gösterdi. Ayrıca, epitel apikal yüzeyinde aktin hücre iskeletinin üç boyutlu rekonstrüksiyon bağırsak lümen sürekli olduğunu ve ikincil lümen s bir eserdir olduğunu gösterdiectioning. Bu iki nokta, bağırsak epitelinde interkinetic nükleer göç gösteri ile birlikte, bir yalancı epiteli olarak gelişen bağırsak epiteli tanımlanmış ve önceden 1 düşünce olarak tabakalı değil. Epitel üç boyutlu görebilme bu noktayı gösteren ve fetal bağırsakta epitel morfogenetiğine yeniden tanımlıyor ufuk açıcı oldu. Çoklu foton görüntüleme teknolojisi ve üç boyutlu rekonstrüksiyon yazılım evrimi ile, yeteneği hızla iyileştirilmesi organ geliştirmeyi, sağlam görselleştirmek için. İki foton uyarma yüksek çözünürlüklü dokulara daha az zarar penetrasyon derin verir. İki foton görüntüleme ve Walton vd. Tüm fetal fare bağırsak 3D rekonstrüksiyon 2012 villus akıbet 2 deseni tanımlamak için yardımcı oldu. Burada izin vermek için bu kültür sisteminin villus ve uzantıları ex vivo gelişimi sağlayan bir bütün organ kültür sistemi açıklanmaktadırbağırsaklar üç boyutlu gelişim sırasında görüntülenmiş olması.

Bu sistem farmakolojik reaktifler veya rekombinant proteinleri ile sinyalizasyon manipülasyon sağlayan fetal Bağırsakların tüm eksplantlarının Kültür, bağırsak gelişimini koordine sinyal moleküllerinin konumu, dağılımı ve süresi analizler için izin verir. (Walton ve ark yeniden Şekil 1A., 2012) Transwell kültür sistemi 2 mümkün doku üzerine ilaç veya proteini batırılmış agaroz boncuklar yerleştirmek ve böylece lokal sinyal kaynaklarının bir şekilde sağlayan bir hava-sıvı ara...

Geliştirilmiş görüntüleme teknolojisi, gelişim sırasında organların üç boyutlu görüntülenmesine izin veriyor. Burada, fetal fare bağırsağında gelişmekte olan villusların canlı görüntülenmesine izin veren bütün bir organ kültürü sistemini tarif ediyoruz.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Bu prosedürün genel amacı, hücre sinyal yolaklarının modülasyonuna olanak tanımak için fare embriyonik bağırsaklarının bütün organ kültürlerini ex vivo olarak büyütmektir. Bu işlem, öncelikle embriyonik gün 12.5 ile 18.5 arasındaki fetüslerden fare bağırsaklarının hasat edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım ise bağırsakların bir transwell kültürüne veya canlı görüntüleme kültür plağına yerleştirilmesidir.Ardından, bağırsakları hücre sinyal yolaklarının farmakolojik inhibitörleri ile hazırlanmış besiyerine maruz bırakın veya hücre sinyalizasyonunu değiştirmek için rekombinant proteinlerle emdirilmiş aero hızlandırıcıları bağırsakların üzerine yerleştirin. Son adım, kültürlenmiş bağırsakların kalın viyom kesitleri veya bütün mount şeklinde görüntülenmesidir.Nihayetinde, konfokal görüntüleme ve ardından yapılan üç boyutlu rekonstrüksiyon, hücre sinyal yolaklarının modülasyonunun villus oluşumu sırasında doku tabakalarının gelişimini nasıl etkilediğini görselleştirmek için kullanılır. Embriyonik dokunun çok hassas olması ve diseksiyon ile taşıma sırasında büyük özen gerektirmesi nedeniyle, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Diseksiyona hazırlanmak için diseksiyon a

mouse-fetal-whole-intestine-culture-system-for-ex-vivo-manipulation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, fare embriyonik pankreas izolasyonu, kültür ve manipülasyon için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu mükemmel bir...

Için bir sistem<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Pankreas&gt; ekimi

Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.

Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Bu videoda, fare bağırsak dokusu parçaları ile spesifik bağırsak bakterileri arasındaki etkileşimleri incelemek için bir ex vivo bağırsak organ kültürü sistemi kurma metodolojisini açıklıyoruz. Cihaz, ilki bağırsak dokusu lümenini birbirine bağlayan ve içine spesifik bakteri süspansiyonunu sağlayan ve ikincisi ex vivo doku canlılığını korumak için cihazın kuyularına sürekli olarak ortam sağlayan iki çift giriş-çıkış portundan oluşur.

Konak-mikrobiyota etkileşimlerini incelemek için bir ex vivo bağırsak organ kültürü sistemi

Bu protokol açıklanan üç boyutlu kültür yöntemi dallı bir organ haline onların önemli genişleme, farklılaşma ve morfojenezinin dahil dağınık embriyonik fare pankreas atalarıdır, gelen pankreas gelişimini özetlediği. Bu yöntem, görüntüleme, niş fonksiyonel müdahale ve manipülasyon için uygun değildir.

Dağınık Fare Embriyonik progenitörlerin gelen Vitro Pankreas organogeneziste

Ex vivo dik damlacık kültürü, mevcut in vitro ve in vivo deneysel tekniklere bir alternatiftir. Bu protokolün uygulanması kolaydır ve daha az miktarda reaktif gerektirirken, fetal vaskülarizasyon, morfogenez ve organogenezi manipüle etme ve inceleme yeteneğine izin verir.

Kullanımı<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için

Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Biz, insan bağırsak-on-a-chip microphysiological sistemi kullanılarak uzun bir süre için bir in vitro protokole ko-kültür bağırsak mikrobiyomları ve bağırsak villi açıklar.

içinde Microengineered İnsan Bağırsak Villi Oturma mikrobiyomu Co-kültür, bir Gut-on-a-Chip mikroakışkan Aygıt

Bu protokol karışık fare küçük bağırsak hücrelerinin izolasyonu ve kültürü anlatılmaktadır. Bu primer bağırsak kültürler bir takım teknikler kullanılarak bağırsak peptidi salgısının temel sinyal yollarının inceleme sağlar.

Enteroendokrin Hücre Gut Hormon salgısını Çalışması ve Canlı Hücre Görüntüleme için Amaçlanan Kemirgen Küçük Bağırsak Karışık İlköğretim Kültürler

Bu protokol, bir klodin-7 nakavt modelinde kolonik kök hücrelerin aktivitesini ve işleyişini incelemek için bir murin kolonik organoid sisteminin kurulmasını açıklamaktadır.

Bağırsak Kök Hücre Fonksiyonunu Incelemek için Murin Kolonik Kriptlerinin Üç Boyutlu Kültürü Ex Vivo

Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.

Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi

Keşfedin fare fetal bağırsak organ kültürü yöntemiyle sinyal yolaklarını modüle ederek villus gelişimini üç boyutlu canlı görüntüleme ile inceleyin. Bu teknik intestinal organogenez süreçlerini anlamak için değerlidir.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon (Video) | JoVE Journal

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi Ex vivo Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Daha fazla video keşfet