Microstereolithography ve ELEKTROÜRETİM kombinasyonu Kornea Yenilenme Nişli ile donatılmış Membranlarını Üretiliyor

Aşağıdaki deneyin genel amacı, eklemeli üretim tekniklerinin ve elektro eğirmenin kullanımını birleştirerek doku mühendisliği iskelelerinde 3B uzamsal karmaşıklığı tanıtmaktır. Bu, mikro stereolitografi adı verilen katman katman fotoğraf kürleme tekniği kullanılarak polietilen glikol, D acrl veya PEG DA'dan yapılmış bozunmayan bir şablon oluşturularak elde edilir. İkinci adım olarak.

Şablonlar metalik bir alt tabakaya tutturulur ve altta yatan morfolojiyi taklit eden biyolojik olarak parçalanabilen bir zar üretmek için bir elektro eğirme kullanılır. Daha sonra, paketleme prosedürleri ve elektros eğrilmiş membranların bozunması incelenir. Depolanan membranların erken bozulması, sıcaklık ve nem kontrol edilerek önlenir.

Son adım, biyolojik olarak parçalanabilen zarların, kornea rejenerasyon cihazları olarak potansiyel kullanımlarını incelemek için 3D yaralı bir kornea modeline yerleştirilmesinden oluşur. Sonuçlar, doğal kök hücre nişini bir dereceye kadar taklit eden mikro cepler içeren karmaşık zarlar oluşturmak için eklemeli üretim tekniklerinin ve elektro eğirmenin kullanılmasının çok yönlülüğünü göstermektedir. Bu tekniğin temel avantajı çok yönlülüğüdür.

Biyolojik olarak parçalanamayan kalıplar, çok çeşitli üretim teknikleri kullanılarak yeni oluşturulabildiğinden, bu yöntem hem üretim hem de doku rejenerasyonu alanlarında ilgi çekici olacaktır ve kök hücre davranışı ve kök hücre nişi ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Mikro fabrikasyon iskeleler yapmak için kullanılan bu yöntem, kornea rejenerasyonu hakkında fikir verebilir. Deri ve ağız mukozası gibi kök hücre nişlerine sahip diğer epitel dokularına da uygulanabilir veya çok çeşitli dokuların mühendisliği için diğer 3D özellikler ve iskeleler sağlamak için de uygulanabilir.

Hem Lider Ortega hem de Thomas Patterson prosedürü gösterecek. Bu prosedüre, ilk katman olan L bir'i oluşturarak başlayın. Bu, 1,2 santimetrelik siyah bir daire için herhangi bir uygun çizim programı kullanılarak yapının temeli olacaktır.

Ardından, L iki oluşturun. İkinci katman, 1,2 santimetre siyah bir daire çizer, ancak altı ila sekiz beyaz 0,5 x 0,35 milimetre at nalı şeklindeki yapı içerir. Küçük beyaz at nalı şekillerini siyah daire yapısı içinde dağıtın.

Mikro stereolitografiyi ayarlamak için L bir ve L iki 'yi JPEG formatında kaydedin. İlk olarak, sistemin optiklerini ayarlayın ve dikkatlice temizleyin. 300 mikrolitre polietilen glikol di acrl veya PEG D karışımını 12 Kuyulu bir doku kültürü plakasının kuyusuna koyun.

Kuyu, Teflon veya başka bir yapışmaz malzeme ile önceden kaplanmalı veya yapının kolayca çıkarılması gerekir. Sertleştikten sonra mavi lazeri açın ve L one'ı ALP üç temel yazılımına yükleyin. Bu yazılım, PC ile dijital mikro ayna cihazı arasındaki bağlantıyı sağlayan bir USP arayüzüdür.

İlk katmanı 60 saniye boyunca ışınlayın. Kuyuya 250 mikrolitre daha peg da ekleyin. L two'yu yükleyin ve L two'yu 60 saniye boyunca ışınlayın.

Kürlenmemiş polimeri çıkarın ve halkaları gece boyunca izopropanol ile yıkayın Elektro eğirmeden bir gün önce, PEG DA halkalarını elektrolizle kaplanmış 12 santimetre x 20 santimetre alüminyum levha üzerine dağıtarak statik bir elektro eğirme toplayıcı oluşturun. Halkaları iletken karbon bant kullanarak takın. Polilaktit co glyco veya PLGA çözeltisini hazırlayın ve ertesi gün kullanmadan önce gece boyunca karıştırın.

Bir şırınga pompasına künt uçlu 0,8 santimetre iç çaplı iğneleri olan dört adet beş mililitrelik şırınga yerleştirin. Tek bir şırınga yerine dört şırınga kullanılır. Daha hızlı elektro eğirme sağlamak için, her şırıngaya 2,5 mililitre PLGA çözeltisi yükleyin.

Bu prosedürün başarısı için, laro pinine değişkenlerini mümkün olduğunca sabit tutmaya çalışmak önemlidir. İğneler ile toplayıcı arasında 15 santimetre mesafe bırakın. Bir saat 30 dakika boyunca elektro eğirme elektro dönüşü için dakikada 30 mikrolitrelik bir akış hızı ve 12 ila 15 kilovolt arasında değişen voltajlar ayarlayın.

Elektro eğirme işlemi tamamlandığında, PLGA elektro sünger tabakasını PEG da halkalarını destekleyen kollektörden dikkatlice soyun. PEG DA halkaları, elektro eğirme için şablon olarak yeniden kullanılabilir. Elektro spon iskeleleri 22 milimetre çapında daireler halinde kesmek için dairesel bir delgeç kullanın.

PLGA membranlarını uzun süreli depolamaya hazırlamak için halka yapısını merkezde konumlandırarak bırakmak. Her birini plastik petri kabı gibi küçük bir kaba monte edin ve tıbbi sınıf bir torbaya koyun. Tıbbi sınıf çantanın içine üç torba kurutucu yerleştirin.

Çantaya piyasada bulunan altı noktalı nem gösterge kartını ekleyin. Bu, depolama süresi boyunca herhangi bir nem birikimini tespit edecektir. Torbayı vakumlamak ve kapatmak için vakumlu bir ısıyla yapıştırma makinesi kullanın.

Daha sonra, PLGA membranları, depolamadan önce harici bir şirkete, gama veya radyasyona gönderilir. Bu deneyde, tavşanların tüketilmek üzere yetiştirildiği bir çiftlikten elde edilen tavşan gözlerinden tavşan limbal patlıcanları izole edilmiştir. İlk olarak% 3'lük bir antiseptik çözelti kullanarak tavşan gözlerini dezenfekte edin.

Ardından, korneayı çevreleyen fazla dokuyu çıkararak gözleri temizleyin. Limbal bölge, şeffaf kornea ile beyaz sklera arasında ince dairesel bir alan olarak tanımlanabilir. Limbal bölgeyi korneanın geri kalanından ayırın.

Limbal bölgeyi yaklaşık 1,5 santimetre uzunluğunda segmentler halinde kesin, limbal segmentleri bir dakika boyunca% 1,5 antiseptik solüsyonda dezenfekte edin. Dezenfeksiyondan sonra, limbal segmentleri küçük parçalara ayırmak için bir neşter bıçağı kullanın. Küçük doku parçalarını kullanmadan önce 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte veya en fazla bir saat önce DMEM artı glut max ortamında saklayın.

Bu işleme başlamak için, halka zarlarını 15 mikrolitre fibrillin yapıştırıcısı ile kaplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Diseksiyon mikroskobu altında çalışırken fibrillini eşit olarak dağıtın. Limbal eksplantları doğrudan PLGA mikro ceplerine yerleştirmek için 25 gauge bir iğne kullanın.

Doku ekplanlı halkaları önceden hazırlanmış denuded korneaların üzerine yerleştirin. Dışa bakan ve havadaki sıvı arayüz koşullarında, PLGA halkası hızlı bir şekilde ıslanacak ve kornea modelinin şeklini benimseyecektir. Organ kültürü modellerini nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede dört hafta boyunca koruyun ve% 5 karbondioksit ortamı iki günde bir değiştirin.

Mikro stereolitografi, farklı boyutlarda PEG DA halkalarının üretilmesini ve mikro özelliklerin aynı anda dahil edilmesini sağlar. Halkalar tekrarlanabilir şekilde yapılabilir ve yeniden kullanılabilir ve elektro eğirme toplayıcı olarak kullanılabilecek bir metal levhaya kolayca tutturulabilir. Bu örnekte yüzükler at nalı mikro özellikleri içermektedir.

Elektro eğirme daha sonra PLGA replikalarını üretir, PLGA membranlarının vakumla paketlenmesi, kasıtlı olarak nemli koşullarda 37 santigrat derecede bile uzun süreli depolamalarını önemli ölçüde iyileştirir. Kullanılan torba tipi aynı zamanda membran stabilitesini, taramalı elektron mikroskobunu ve üç deklantın incelenmesini de etkiler, lif bütünlüğünde veya bozulmamış liflerin neminde herhangi bir değişiklik göstermez. Limbal implantlardan veya eksi 20 santigrat derecede altı aylık depolamadan sonra hem yeni yapılmış biyolojik olarak parçalanabilen PLGA halkaları hem de halkalar tarafından desteklenen hücre büyümesi.

PLGA membranları 3D yaralı kornea modellerine yerleştirilirken, dört hafta sonra hücre transferi sağlandı. H ve e görüntüleri, nişler üzerine yerleştirilen eksplantlardan çıkan hücrelerin oluşturduğu yeni çok katmanlı epiteli göstermektedir. Negatif kontrol, herhangi bir ilave hücre yokluğunda yeni bir epitel oluşumunun olmadığını doğruladı.

Taze bir tavşan korneasında gözlenen geleneksel bir kornea epiteli ile karşılaştırıldığında, pozitif kontrol olarak kullanılır. İmmünosito kimyası, implantlardan çıkan hücrelerin, bir kornea farklılaşma belirteci olan sitokeratin üç için pozitif oldukları için kornea epitel hücreleri olduğunu gösterdi. Biyolojik olarak parçalanamayan şablonları içeren elektro eğirme kollektörleri tekrar kullanılabilir olduğundan, protokol optimize edildiğinde iskelelerin üretimi iki saat içinde yapılabilir.

Bu teknik, doku mühendisliği alanlarındaki araştırmacıların, hücre davranışını incelemek için mikro özellikler içeren karmaşık doku mühendisliği membranları üretmenin yeni bir yolunu keşfetmelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, eklemeli imalat teknikleri veya modelleme gibi benzer yaklaşımlar kullanarak bozunmayan mikro fabrikasyon bir şablonun nasıl oluşturulacağını ve iskelelerinize karmaşıklık katmak için elektro eğirme işleminin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.