Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Bu prosedürün genel amacı, sıçan beyin ekstraktlarından yüksek çözünürlüklü metabolit profilleri elde etmektir. Bu, önce sıçan beyinlerinin hasat edilmesi ve bunların sıvı nitrojen içinde dondurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, dokuyu metanol kloroform su içinde homojenize ederek beyin metabolitlerini çıkarmak ve ardından denatüre proteinlerin ve organik çözücülerin uzaklaştırılmasıdır.

Daha sonra, sulu numuneler liyofilize edilir ve tüm numuneler iyi tanımlanmış çözücüler içinde resole edilir. Optimal NMR spektroskopik analizi için son adım, metabolomik NMR deneylerini dikkatli bir şekilde kurmak ve optimize etmektir. Sonuç olarak, NMR Spektrumları iyi tanımlanmış deneysel koşullar altında gereklidir ve optimize edilmiş veri işleme protokolleri kullanılarak değerlendirilir.

Bu yöntem beyin metabolizması hakkında bilgi verebilse de, tümörler, karaciğer, böbrek ve diğer organlar gibi diğer yumuşak dokulara da uygulanabilir. İlk olarak, önceden hazırlanmış donmuş bir beyin dokusu örneğini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın. Daha sonra doku örneğini hemen kısmen sıvı nitrojen ile doldurulmuş bir harca aktarın.

Donmuş beyin dokusunu, doku homojenizasyonu için kullanılan test tüplerine kolayca sığacak daha küçük parçalara ayırmak için sıvı nitrojen soğuk havaneli kullanın. Bu karışımı takiben, donmuş beyin dokusunun küçük parçaları, dokunun 250 ila 350 miligramını iyice tartar ve toplam dört mililitre buz gibi soğuk metanol ile doldurulmuş bir test tüpüne aktarır. Test tüpüne her donmuş doku parçası eklendiğinde, bunları doku homojenizatörü ile hemen homojenize edin.

Donmuş sıçan beyin numunesinin son parçası test tüpüne eklendikten ve homojenize edildikten sonra, homojenatı 20 mililitrelik cam şişeye eşit veya daha büyük bir değere aktarın. Vidalı kapağı kapatın ve homojenatı 15 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Daha sonra, homojenata dört mililitre buz gibi kloroform ekleyin ve iyice girdaplayın.

Bittiğinde homojenatı 15 dakika buz üzerinde bekletin. İyice girdapladıktan sonra homojenata dört mililitre su ekleyin, homojenatın gece boyunca eksi 20 santigrat derecede bekletin. Tam faz ayrımı için, beyin dokusu homojenat çözeltisini 20 mililitrelik kloroforma dirençli santrifüj tüpünden daha büyük veya eşit bir tüpe aktarın ve numuneyi 40 dakika boyunca 13.000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, üst fazı uygun bir 15 mililitre metanole dayanıklı tüpe aktarmak için bir macun pipeti kullanın. Daha sonra, alt fazı uygun, daha büyük veya eşit tüplü 15 mililitrelik kloroforma dirençli bir tüpe aktarmak için taze bir macun pipeti kullanın ve tüpü su metanol fazı ile buz üzerinde tutarken buzun üzerine yerleştirin. Ekstrakt çözeltisine kuru bir nitrojen akışı yönlendirerek metanolü buharlaştırın.

Nitrojen köpürürken buharlaşma işlemini sonlandırın. Artık ekstrakt çözeltisinde hacim azalmasına neden olmaz. Metanol kloroform fazına sahip tüpü buz üzerine yerleştirdikten sonra, ekstrakt çözeltisinin yüzeyine kuru bir nitrojen akışı yönlendirerek metanolü buharlaştırın.

Çözücünün tamamı buharlaştığında, tüpü kapatın ve numuneyi NMR analizi için hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede tutun. Sulu fazı liyofilizasyona hazırlamak için, sulu numuneyi iyice durulanmış 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, santrifüj tüpünü sıvı nitrojen içinde, tüpün iç yüzeyi kademeli olarak donmuş sıvı ile kaplanacak şekilde döndürerek ekstrakt çözeltisini dondurun.

Tüm sıvı donduğunda, buharın kaçmasına izin vermek için tüpü delinmiş bir vidalı kapakla kapatın ve tüpü geniş boyunlu bir vakumlu filtre şişesine yerleştirin. Şişeyi dondurarak kurutucuya taktıktan sonra liyofilizasyonu başlatın, liyofilizasyon işlemini sonlandırın. Numune tamamen kuruduğunda, numuneyi NMR analizi için kullanılana kadar kapalı bir tüpte eksi 80 santigrat derecede tutun.

Fosfolipidlerin fosfor NMR analizi için, kurutulmuş lipitleri 700 mikrolitrelik beş ila dört ila bir döteryumlu kloroform metanol karışımı ve 200 milimolar sulu CDTA çözeltisi içinde çözün. Kloroforma dirençli uca sahip doğrudan yer değiştirmeli bir mikro pipet kullanarak numuneyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu noktada, NMR probunun sıcaklık regülasyonunu, genellikle 25 santigrat derece santrifüj olan istenen hedef değere ayarlayın.

Fosfolipid ekstrakt çözeltisi, numunedeki katı kalıntıları döndürmek için 30 dakika boyunca dört santigrat derece ve 11.000 G'de çözelti. Bittiğinde, 600 mikrolitre süper natini beş milimetre dış çapa sahip yüksek kaliteli bir NMR tüpüne aktarın. Kimyasal kayma referanslaması ve kantitasyonu için pH 7.0'da sulu 20 milimolar metilen difosfat çözeltisi ile doldurulmuş uygun koaksiyel uç gövdesini hazırlayın.

Bu eki fosfolipid özü çözeltisi ile doldurulmuş NMR tüpüne yerleştirin. Ardından, NMR tüpünü uygun döndürücü ile takın ve NMR mıknatısına aktarın. Numune ayarlanan sıcaklığa ayarlanana kadar bekledikten sonra numuneyi 15 ila 20 hertz'de döndürün.

Eksen içi ve eksen dışı şim bobin akımlarını ayarlayarak numune boyunca homojenlikteki manyetik alanı dikkatlice en aza indirin, NMR spektrum toplama parametrelerini, mıknatıs alan kuvvetinin bir fonksiyonu olarak değişebilen optimum değerlere ayarlayın. Spektrum edinimi tamamlandıktan sonra, tüm fosfolipid rezonansları için en iyi sonuçları elde etmek için optimize edilmiş parametreleri kullanarak serbest indüksiyon bozunmasını işleyin. En az iki farklı filtreleme prosedürü kullanarak işlemi tekrarlayın.

Son olarak, sinyal-gürültü oranını artırmak için çok zayıf ve geniş sinyalleri izasyon yoluyla önemli bir örtüşme olmadan filtreleyin. Bu deneyde, çok kalabalık bölgelerde bile analiz edilen tüm spektral bölgeler için son derece dar spektral çizgiler elde edildi. 0.01 P PP M'den daha az bir mesafedeki tepe noktaları 400 megahertz'de neredeyse tamamen ayrılabilir.

Sonuç olarak, çok sayıda küçük, ancak şu anda atanmamış tepe noktalarının kalitatif ve kantitatif analizi, 200.Milimolar yerine 1000 milimolar seçilerek gelecekteki çizgi daralmasında öngörülebilir. CDTA istendi, ancak 297 yerine 277 Kelvin seçilerek fosfolipid sinyal hattının daralmasına neden oldu. Kelvin arzu edildi, ancak aynı zamanda fosfolipid sinyallerinin süperpozisyonuna neden oldu.

CDTA konsantrasyonunda 200 milimolar'dan 50 milimolar'a bir düşüş, yalnızca çizgi genişliğinde mütevazı bir artışa ve kimyasal kaymalarda neredeyse hiç değişikliğe neden olmaz. Bununla birlikte, 50 milimolar CDTA ekstraktındaki doku konsantrasyonunun, 200 milimolar CDTA ekstraktındakinin yarısı kadar yüksek olduğunu unutmayın. Nispeten dar çizgileri açıklayarak, önemli bir konsantrasyon aralığını kapsayan çok sayıda ölçülebilir fosfolipid tespit edildi.

Spektral çözünürlük, belirli tepe noktalarının kısmi bölünmesini rutin olarak tespit etmek için bile yeterlidir. Sonuç olarak, gelecekte başka fosfolipid alt gruplarının kalitatif ve kantitatif analizi öngörülebilir. Bu prosedürü denerken, optimal metabolit analizini garanti etmek için her bir adımı son derece dikkatli bir şekilde gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.