Name: Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Öğrenin, sıçan beyin dokusundan yüksek çözünürlüklü metabolit profilleri elde etmek için NMR spektroskopisi kullanımını. Bu yöntem, nörokimya ve metabolomik alanlarında hastalıkların beyin metabolizması üzerindeki etkilerini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS, UMR 6612 ve 7339) tarafından verilen destek minnetle kabul edilmektedir.

<ol><li>Manger, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+21st+century+neuroscience+too+focused+on+the+rat%2Fmouse+model+of+brain+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Is 21st century neuroscience too focused on the rat/mouse model of brain function and dysfunction.</a> Front Neuroanat. 2, 5(2008).</li>
<li>Buxbaum, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+phenotyping+of+rodent+ASD+models+enrichment+analysis+of+mouse+and+human+neurobiological+phenotypes+associated+with+high-risk+autism+genes+identifies+morphological%2C+electrophysiological%2C+neurological%2C+and+behavioral+features%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Optimizing the phenotyping of rodent ASD models enrichment analysis of mouse and human neurobiological phenotypes associated with high-risk autism genes identifies morphological, electrophysiological, neurological, and behavioral features.</a> Mol Autism. 3, 1(2012).</li>
<li>Papaioannou, V., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPapaioannou%2C+V+%22Mouse+Phenotypes+A+Handbook+of+Mutation+Analysis%22">Mouse Phenotypes A Handbook of Mutation Analysis</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Woodbury. (2004).</li>
<li>Yu, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sodium+current+in+GABAergic+interneurons+in+a+mouse+model+of+severe+myoclonic+epilepsy+in+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reduced sodium current in GABAergic interneurons in a mouse model of severe myoclonic epilepsy in infancy.</a> Nat Neurosci. 9, 1142-1149 (2006).</li>
<li>Mallolas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymorphism+in+the+EAAT2+promoter+is+associated+with+higher+glutamate+concentrations+and+higher+frequency+of+progressing+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A polymorphism in the EAAT2 promoter is associated with higher glutamate concentrations and higher frequency of progressing stroke.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 711-717 (2006).</li>
<li>Crusio, W. E., Sluyter, F., Gerlai, R. T., Pietropaolo, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCrusio%2C+WE+%22Behavioral+Genetics+of+the+Mouse+Genetics+of+Behavioral+Phenotypes%22">Behavioral Genetics of the Mouse Genetics of Behavioral Phenotypes</a>. Vol. 1, Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Viola, A., Saywell, V., Villard, L., Cozzone, P. J., Lutz, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+fingerprints+of+altered+brain+growth%2C+osmoregulation+and+neurotransmission+in+a+Rett+syndrome+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Metabolic fingerprints of altered brain growth, osmoregulation and neurotransmission in a Rett syndrome model.</a> PLoS ONE. 2, e157(2007).</li>
<li>Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Rabinowitz, J. D., Purdy, J. G., Vastag, L., Shenk, T., Koyuncu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+in+drug+target+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Metabolomics in drug target discovery.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 76, 235-246 (2011).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWishart%2C+DS+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Wevers, R. A., Lutz, N. W., Sweedler, J. V., et al. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Ponten, U., Ratcheson, R. A., Salford, L. G., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+freezing+conditions+for+cerebral+metabolites+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal freezing conditions for cerebral metabolites in rats.</a> Journal of Neurochemistry. 21, 1127-1138 (1973).</li>
<li>Henry, P. G., Oz, G., Provencher, S., Gruetter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+isotopomer+analysis+in+the+rat+brain+in+vivo+automatic+quantitation+of+13C+NMR+spectra+using+LCModel%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic isotopomer analysis in the rat brain in vivo automatic quantitation of 13C NMR spectra using LCModel.</a> NMR Biomed. 16, 400-412 (2003).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts+2+Line+width+and+spectral+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts 2 Line width and spectral resolution.</a> Anal Chem. 82, 5441-5446 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optimization+of+%2831%29P+NMR+spectroscopic+analysis+of+phospholipids+in+crude+tissue+extracts.+1.+Chemical+shift+and+signal+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optimization of (31)P NMR spectroscopic analysis of phospholipids in crude tissue extracts. 1. Chemical shift and signal separation.</a> Anal Chem. 82, 5433-5440 (2010).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLutz%2C+NW+%22Methodologies+for+Metabolomics%22">Methodologies for Metabolomics</a>. Lutz, N. W., Sweedler, J. V., Wevers, R. A. , Cambridge University Press. New York. (2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Fernandez, C., Pellissier, J. F., Cozzone, P. J., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+biochemical+pathways+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+adjuvant+arthritis+a+comparative+metabolomic+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cerebral biochemical pathways in experimental autoimmune encephalomyelitis and adjuvant arthritis a comparative metabolomic study.</a> PLoS ONE. 8, e56101(2013).</li>
<li>Lutz, N. W., Cozzone, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+multiparametric+optimization+for+phospholipidomics+by+31P+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of multiparametric optimization for phospholipidomics by 31P NMR spectroscopy.</a> Biophys Rev. 5, 295-304 (2013).</li>
<li>Pearson, G. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPearson%2C+GA+%22Shimming+an+NMR+magnet%22">Shimming an NMR magnet</a>. , University of Iowa. Iowa City. (1991).</li>
<li>Lane, A. N., Fan, T. W. M., Higashi, R. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+AN+%22Biophysical+tools+for+biologists%22">Biophysical tools for biologists</a>. Correia, J. J., Detrich, H. W. Vol. 1, In vitro techniques, Academic Press. Waltham. (2008).</li>
<li>Peeling, J., Wong, D., Sutherland, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+study+of+regional+metabolism+after+forebrain+ischemia+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance study of regional metabolism after forebrain ischemia in rats.</a> Stroke. 20, 633-640 (1989).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

NMR spektroskopisi, bir çok yeniden üretilebilir ve doğru bir şekilde çözelti içinde kimyasal bileşiklerin konsantrasyonlarının ölçülmesi için etkili bir yöntemdir. Ancak, yüksek kalitede veri elde etmek için bu örnek hazırlama ve analizleri konusunda belirli kurallara uymak gereklidir. Gözlemlenen bir sinyalin yoğunluğu algılama eşiğini (özellikle zayıf sinyal) yaklaşımları edilmiştir, NMR spektroskopi ile metabolit konsantrasyonlarının belirlenmesinde, üretim ya NMR sinyalinin alım de, niceleme hata hakimdir. Diğer tü...

Murin modeller beyin araştırması 1 yaygın olarak kullanılmıştır. Genotip-fenotip, diğer korelasyon 2-6 üzerinde, bir yandan, RNA ve / veya protein seviyelerde gen ifadesinin inceleyerek fare ve sıçan beyinleri incelenmiş ve morfolojik fonksiyonel elektrofizyolojik ve / veya davranış fenotipleri edilmiştir. Ancak, tamamen genotipi ile fenotipi bağlayan mekanizmalarını anlamak için, o aşağı protein ifadesi, yani moleküler olayları araştırmak için zorunludur. enzimler 7 hareket bunun üzerine biyokimyasal substratların metabolizması. Bu gereklilik biyoloji 8,9 birçok dalında metabolik araştırma rönesans için, son 10 ila 15 yıl içinde, yol açtı. Klasik metabolik çalışmalar genellikle belirli yolların ayrıntıları odaklanmış olsa da, yeni metabolomic yaklaşım göz altında dokusunun küresel metabolik profilinin her şeyi kapsayan bir soruşturma yönelikse.Bu kavram bir sonucu özel metabolik yolları ve / veya bileşiklerin sınıflarına karşı verevi en aza indirmek analitik araçlar için açık bir ihtiyaç vardır. Bununla birlikte, klasik biyokimyasal analizi deneyi gerçekleştirilir önce belirtilmesi gereken belirli bir analit bir kimyasal reaksiyona dayanır. Bunun aksine, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopi ve kütle spektrometrisi (MS) (i) spektroskopik teknikler biyokimyasal bileşiklerin, özellikle molekül (fiziksel) özelliklerine dayanır her biri bir spektrum içinde bir ya da birden fazla farklı sinyal yol açar bir deney sırasında tespit edilmiştir; ve (ii), deney başına farklı bileşiklerin çok sayıda tespit eder. Böylece, her bir spektrum metabolitlerin bir dizi kombine bilgileri içerir. Önceden seçme analitin doğası ile ilgili 8 ölçülecek yapılması gereken Bu nedenle, spektroskopik yöntemler, metabolitler için uygun araçlardır </sus&gt;. Bunlar büyük ölçüde beklenmedik metabolik değişimlerin saptanmasını kolaylaştırmak için bir sonucu olarak, bu teknikler, doğal keşif çalışmaları kendilerini katmaktadır. NMR ve MS spektroskopi birçok metabolitlerin analizi için birbirlerinin yerine kullanılabilir, ancak her iki yöntemle de avantaj ve yakın zamanda gözden geçirilmiştir 10 dezavantajları da vardır. Kısaca, NMR spektroskopi, genellikle kaba özütündeki gerçekleştirilebilir ve analizden önce örnek bileşiklerin kromatografik ayırmaya gerek yoktur. Buna göre, MS gibi kütle spektrometresi görüntüleme gibi belirli son gelişmelerin dışında, gaz veya sıvı kromatografisi (GC veya LC) ayrılması ile çalışır. Farklı şekerlerin rezonans hatları (1H) NMR spektrası, proton aktif rol oynamaktadır, çünkü bu tür şekerlerin analizi bir kaç özel durumda, LC ayırma, hem de NMR spektroskopi için bir zorunluluk olabilir. CHR olmadan Bununla birlikte, 1H-NMR spektroskopisiomatographic ayırma en popüler, neredeyse evrensel uygulamalı metabolomic NMR yöntemi kalır. Genel olarak, bu numune hazırlama NMR spektroskopisi için olduğu gibi, MS daha zaman alıcı ve karmaşıktır. Matriks etkileri nedeniyle ciddi sorunlar çok onlar oldukça zayıflatılmış sinyallerine neden olabilir nerede MS daha NMR spektroskopisi az yaygındır. Metabolit niceleme Her iki yöntem ile elde edilebilir. Bununla birlikte, çoklu standart bileşiklerin, metabolitleri arasında matriks etkileri ve iyonizasyon verimliliği varyasyonlara MS için gereklidir. Buna karşılık, numune başına sadece bir standart için uygun ölçüm koşulları altında, bir NMR spektroskopisi ile analiz için gerekli olan, ikinci yöntem ise esas olarak gözlenen çekirdekleri tarafından kesinlikle lineer tepki NMR nicel sayesinde. NMR önemli bir dezavantajı nispeten düşük hassasiyettir. MS, özellikle LC-MS, büyüklük birkaç emir tarafından NMR daha duyarlıdır; Bu nedenle, MS için NMR fazla tercih edilmelidirçok düşük konsantrasyonlarda meydana gelen bileşiklerin analizi. Öte yandan, bir NMR deneyinde bozulmayan doğası MS üzerinde açık bir avantaj olan; Bu şekilde, örneğin 1 H-NMR, fosfor-31 (31 p), karbon-13 (13 ° C), farklı NMR aktif çekirdekleri için, örneğin, aynı numune üzerinde tekrar tekrar yapılabilir flor-19 (19 C) vb., MS ölçümleri karşı önemli bir NMR ile tüketilir gibi. NMR ve MS hem farklı modlarda kullanılabilir, her biri özel bir kimyasal özelliklere sahip bileşiklerin tespit edilmesi için uygun olan. Hemen hemen tüm fosforlu metabolitleri de protonlar ihtiva eden, ancak, örneğin, 31P NMR, genellikle orta konsantre fosforlu bileşiklerin analizi için 1H NMR göre daha uygundur. Ancak, 1H NMR sinyalleri ise ikinci, diğer fosforilatlanmamış bileşiklerinden 1H NMR sinyallerinin tarafından gizlenmiş edilebilirAçıkçası 31P NMR spektrumlarda arka plan sinyallerini neden olmaz. 13C NMR özel durum neredeyse sadece ilgi ise analog durumda, 19 NMR analizi, florlanmış bileşikler, örneğin, florinlenmiş ilaçlar (endojen metabolit herhangi bir arka plan sinyalleri) için tercih edilecek ise 13 C kaderi Eksojen etiketli metabolik ön yüzünden 13 C izotopu (yaklaşık% 1), son derece düşük bir doğal bolluğu, takip edilmelidir. Birçok kütle spektrometreleri da negatif iyon modunda ya pozitif iyon modunda ya da çalışır. Bu nedenle önümüzdeki iyonlar negatif veya pozitif yüklü hale gelen dikkat edilmesi olup analiz bilmek önemlidir. Bu yöntem örnek hazırlama a için gerekli (I) &#39;in zaman açısından düşük maliyetle önemli metabolit konsantrasyonları çok sayıda verir çünkü 1H ve31P NMR spektroskopi ile beyin dokusu metabolome analizi için bir protokol burada odaknd, (ii) bir çaba metabolit miktarının belirlenmesi için gerekli. Bütün deneyler, standart bir ıslak-kimya laboratuvar ekipman ve yüksek resolüsyon NMR spektroskopisi odası kullanılarak da gerçekleştirilebilir. Bundan başka değişiklikler aşağıdaki protokol kısmında açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Isofluran</td><td>Virbac</td><td>Vetfluran hayvanlar</td><td>için anestezik</td></tr><tr><td>Isofluran buharlaştırıcı</td><td>Ohmeda</td><td>Isotec 3</td><td>Daha yeni model mevcut: Isotec 4</td></tr><tr><td>Neşter, makas, forseps, kelepçeler</td><td>Harvard Apparatus Fisher Scientific</td><td>çeşitli hayvanlar</td><td>için çeşitli Cerrahi ekipman</td></tr><tr><td>Dondurarak kelepçe aracı</td><td>ev yapımı</td><td>yok</td><td>Alüminyum plakalı maşa, soğutma için sıvı nitrojen içine yerleştirilecek şekilde</td></tr><tr><td>Dewar</td><td>Nalgene</td><td>4150-4000</td><td></td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nitrojen gazı</td><td>Air Liquide</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Nitrojen evaporatör</td><td>Organomasyon Ortakları</td><td>N-EVAP 111</td><td>Ev yapımı cihaz</td></tr><tr><td>Mortar</td><td>Sigma-Aldrich ile değiştirilebilir</td><td></td><td></td>Z247472</tr><tr><td>Havaneli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247510</td><td></td></tr><tr><td>Doku homojenizatörü</td><td>Kinematica</td><td>Polytron</td><td>Test tüpleri ile homojenizatör mili</td></tr><tr><td>Elektronik terazi</td><td>Sartorius</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3641</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>366910</td><td></td></tr><tr><td>Cam santrifüj tüpleri</td><td>Kimble</td><td>45500-15, 45500-30</td><td>Kimax 15 ml, 30 ml tüp</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>Kimble</td><td>45150-2</td><td>Kimax 2 ml tüp; santrifüj rotoru ile uyumluysa "Eppendorf" tüpünün yerini almalıdır</td></tr><tr><td>Polistiren pipetler</td><td>Costar Corning</td><td>Stripets</td><td>5 ve 10 ml hacimler</td></tr><tr><td>Deuterochloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431915</td><td>%99.96 döteryumlu</td></tr><tr><td>Döteryum oksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>423459</td><td>%99,96 döteryumlu</td></tr><tr><td>Döteryum klorür</td><td>Alpha Aesar</td><td>42406</td><td>%20 döteryum oksit içinde</td></tr><tr><td>Sodyum döteroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164488</td><td>%30 döteryum oksit</td></tr><tr><td>Liyofilizatör</td><td>Mesih</td><td>Alfa 1-2</td><td></td></tr><tr><td>Soğuk santrifüj</td><td>Heraeus</td><td>Megafuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>pH metre</td><td>Eutech Sibernetik</td><td>Cyberscan</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0922</td><td></td></tr><tr><td>Sezyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516988</td><td></td></tr><tr><td>NMR tüpleri</td><td>Wilmad</td><td>528-PP</td><td></td></tr><tr><td>NMR gövde koaksiyel uç</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z278513</td><td>Wilmad</td></tr><tr><td>NMR pipetleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z255688</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Eppendorf</td><td>Research</td><td>0,5 ila 1.000 &mu arasındaki hacimler için uçlarla; l</td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond</td><td>XP</td><td></td></tr><tr><td>NMR spektrometresi</td><td>Bruker</td><td>AVANCE 400</td>, <td>prob ve diğer aksesuarlar dahil</td></tr><tr><td>NMR yazılımı</td><td>Bruker</td><td>TopSpin 1.3</td><td>daha yeni sürüm mevcut: Topspin 3.2</td></tr><tr><td>Suda çözünür standart bileşikler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli</td><td></td></tr><tr><td>Fosfolipid standart bileşikleri</td><td>Avanti Polar Lipids Doosan Serdary Sigma-Aldrich</td><td>çeşitli çeşitli </td><td>plazmalojenler için çeşitli Kaynak, ancak < % 70 - 80 saflıkta</td></tr><tr><td>Metilendifosfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9508</td><td></td></tr><tr><td>TSP-d4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269913</td><td></td></tr></tbody></table>

doku esansı yüksek Çözünürlük nükleer manyetik rezonans spektroskopisi ile sıçan beyin metabolomic analizi

Metabolomic Analysis of Rat Brain by High Resolution Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy of Tissue Extracts

RNA ve protein seviyeleri üzerindeki gen ekspresyonu çalışmaları, hastalığın altında yatan biyolojik süreçleri araştırmak için uzun süredir kullanılmaktadır. Daha yakın zamanlarda, genomik ve proteomik, biyolojik sistemlerde bulunan metabolit havuzunun kapsamlı kantitatif analizi ile tamamlanmıştır. Metabolomik olarak adlandırılan bu strateji, metabolizmada yer alan küçük moleküllü tamamlayıcının küresel bir karakterizasyonunu sağlamaya çalışır. Genom ve proteom, hücrelerin gerçekleştirebileceği görevleri tanımlarken, metabolom gerçek fenotipin bir parçasıdır. Şu anda metabolomikte kullanılan yöntemler arasında, spektroskopik teknikler özel bir ilgi alanıdır, çünkü belirli biyokimyasal yollar için önceden seçim yapmadan çok sayıda metabolitin aynı anda analiz edilmesine izin verir, böylece geniş bir tarafsız yaklaşımı mümkün kılar. Burada, doku metabolitlerinin verimli bir şekilde ölçülmesi için tercih edilen yöntem olan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi ile metabolomik analiz için optimize edilmiş bir deneysel protokol sunulmaktadır. Bu yöntemin önemli güçlü yönleri şunlardır: (i) numunenin saflaştırılmasına ve/veya metabolitlerin ayrılmasına gerek kalmadan ham ekstraktların kullanılması; (ii) NMR'nin doğası gereği kantitatif doğası, bir NMR spektrumu ile temsil edilen tüm metabolitlerin sadece bir referans bileşiği ile kantitasyonuna izin verir; ve (iii) NMR'nin tahribatsız doğası, aynı numunenin birden fazla ölçüm için tekrar tekrar kullanılmasını sağlar. Aşırı düşük konsantrasyonlarda meydana gelen metabolitlerin tespit edilmesi zor olsa da, NMR sinyallerinin doğrusal tepkisi nedeniyle kapsanabilen dinamik metabolit konsantrasyonları aralığı dikkate değerdir. En az bulunan bileşikler için, oldukça hassas kütle spektrometresi yöntemi avantajlı olabilir, ancak bu teknik NMR spektroskopisinden daha karmaşık numune hazırlama ve miktar tayini prosedürleri gerektirir. Burada sıçan beyin analizine göre ayarlanmış bir NMR protokolü sunuyoruz; Ancak aynı protokol küçük değişikliklerle diğer dokulara da uygulanabilir.

Özü çözümler mevcut: beyin ve diğer doku özleri metabolik NMR spektrumları iyi çözünürlük elde etmek için, uzun kaldırmak veya (paramanyetik iyonlar en önemlisi) maske metal iyonları yaygın bir uygulama olmuştur. Bu, ya da Chelex-100 20 gibi bir iyon alışveriş reçinesi ile özü geçirilerek, ekstre 19, EDTA veya CDTA gibi bir kenetleme maddesinin ilave edilmesi yoluyla elde edilmiştir. Şekil 1'de sunulan sonuçlar, beyin ekstreleri dikkatli bir şekilde, yukarıdaki protokole göre hazır...

Memeli beyninin nörokimyası birçok nörolojik ve sistemik hastalıkta değişmiştir. Serebral metabolitlerin karakteristik profilleri, beyin dokusunun ham ekstraktlarına dayalı olarak verimli bir şekilde elde edilebilir. Bu amaçla, metabolit konsantrasyonlarının (metabolomikler) ayrıntılı kantitatif analizini sağlayan yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanılır.

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Studies of gene expression on the RNA and protein levels have long been used to explore biological processes underlying disease. More recently, genomics ...

Bu prosedürün genel amacı, sıçan beyin ekstraktlarından yüksek çözünürlüklü metabolit profilleri elde etmektir. Bu, önce sıçan beyinlerinin hasat edilmesi ve bunların sıvı nitrojen içinde dondurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, dokuyu metanol kloroform su içinde homojenize ederek beyin metabolitlerini çıkarmak ve ardından denatüre proteinlerin ve organik çözücülerin uzaklaştırılmasıdır.Daha sonra, sulu numuneler liyofilize edilir ve tüm numuneler iyi tanımlanmış çözücüler içinde resole edilir. Optimal NMR spektroskopik analizi için son adım, metabolomik NMR deneylerini dikkatli bir şekilde kurmak ve optimize etmektir. Sonuç olarak, NMR Spektrumları iyi tanımlanmış deneysel koşullar altında gereklidir ve optimize edilmiş veri işleme protokolleri kullanılarak değerlendirilir.Bu yöntem beyin metabolizması hakkında bilgi verebilse de, tümörler, karaciğer, böbrek ve diğer organlar gibi diğer yumuşak dokulara da uygulanabilir. İlk olarak, önceden hazırlanmış donmuş bir beyin dokusu örneğini eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın. Daha sonra doku örneğini hemen kısmen sıvı nitrojen ile doldurulmuş bir harca aktarın.Donmuş beyin dokusunu, doku homojenizasyonu için kullanılan test tüplerine kolayca sığacak daha küçük parçalara ayırmak için sıvı nitrojen soğuk havaneli kullanın. Bu karışımı takiben, donmuş beyin dokusunun küçük parçaları, dokunun 250 ila 350 miligramını iyice tartar ve toplam dört mililitre buz gibi soğuk metanol ile doldurulmuş bir test tüpüne aktarır. Test tüpüne her donmuş doku parçası eklendiğinde, bunları doku homojenizatörü ile hemen homojenize edin.Donmuş sıçan beyin numunesinin son parçası test tüpüne eklendikten ve homojenize edildikten sonra, homojenatı 20 mililitrelik cam şişeye eşit veya daha büyük bir değere aktarın. Vidalı kapağı kapatın ve homojenatı 15 dakika boyunca buzun üzerine koyun. Daha sonra, homojenata dört mililitre buz gibi kloroform ekleyin ve iyice girdaplayın.Bittiğinde homojenatı 15 dakika buz üzerinde bekletin. İyice girdapladıktan sonra homojenata dört mililitre su ekleyin, homojenatın gece boyunca eksi 20 santigrat derecede bekletin. Tam faz ayrımı için, beyin dokusu homojenat çözeltisini 20 mililitrelik kloroforma dirençli santrifüj tüpünden daha büyük veya eşit bir tüpe aktarın ve numuneyi 40 dakika boyunca 13.000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.Santrifüjlemeden sonra, üst fazı uygun bir 15 mililitre metanole dayanıklı tüpe aktarmak için bir macun pipeti kullanın. Daha sonra, alt fazı uygun, daha büyük veya eşit tüplü 15 mililitrelik kloroforma dirençli bir tüpe aktarmak için taze bir macun pipeti kullanın ve tüpü su metanol fazı ile buz üzerinde tutarken buzun üzerine yerleştirin. Ekstrakt çözeltisine kuru bir nitrojen akışı yönlendirerek metanolü buharlaştırın.Nitrojen köpürürken buharlaşma işlemini sonlandırın. Artık ekstrakt çözeltisinde hacim azalmasına neden olmaz. Metanol kloroform fazına sahip tüpü buz üzerine yerleştirdikten sonra, ekstrakt çözeltisinin yüzeyine kuru bir nitrojen akışı yönlendirerek metanolü buharlaştırın.Çözücünün tamamı buharlaştığında, tüpü kapatın ve numuneyi NMR analizi için hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede tutun. Sulu fazı liyofilizasyona hazırlamak için, sulu numuneyi iyice durulanmış 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, santrifüj tüpünü sıvı nitrojen içinde, tüpün iç yüzeyi kademeli olarak donmuş sıvı ile kaplanacak şekilde döndürerek ekstrakt çözeltisini dondurun.Tüm sıvı donduğunda, buharın kaçmasına izin vermek için tüpü delinmiş bir vidalı kapakla kapatın ve tüpü geniş boyunlu bir vakumlu filtre şişesine yerleştirin. Şişeyi dondurarak kurutucuya taktıktan sonra liyofilizasyonu başlatın, liyofilizasyon işlemini sonlandırın. Numune tamamen kuruduğunda, numuneyi NMR analizi için kullanılana kadar kapalı bir tüpte eksi 80 santigrat derecede tutun.Fosfolipidlerin fosfor NMR analizi için, kurutulmuş lipitleri 700 mikrolitrelik beş ila dört ila bir döteryumlu kloroform metanol karışımı ve 200 milimolar sulu CDTA çözeltisi içinde çözün. Kloroforma dirençli uca sahip doğrudan yer değiştirmeli bir mikro pipet kullanarak numuneyi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Bu noktada, NMR probunun sıcaklık regülasyonunu, genellikle 25 santigrat derece santrifüj olan istenen hedef değere ayarlayın.Fosfolipid ekstrakt çözeltisi, numunedeki katı kalıntıları döndürmek için 30 dakika boyunca dört santigrat derece ve 11.000 G'de çözelti. Bittiğinde, 600 mikrolitre süper natini beş milimetre dış çapa sahip yüksek kaliteli bir NMR tüpüne aktarın. Kimyasal kayma referanslaması ve kantitasyonu için pH 7.0'da sulu 20 milimolar metilen difosfat çözeltisi ile doldurulmuş uygun koaksiyel uç gövdesini hazırlayın.Bu eki fosfolipid özü çözeltisi ile doldurulmuş NMR tüpüne yerleştirin. Ardından, NMR tüpünü uygun döndürücü ile takın ve NMR mıknatısına aktarın. Numune ayarlanan sıcaklığa ayarlanana kadar bekledikten sonra numuneyi 15 ila 20 hertz'de döndürün.Eksen içi ve eksen dışı şim bobin akımlarını ayarlayarak numune boyunca homojenlikteki manyetik alanı dikkatlice en aza indirin, NMR spektrum toplama parametrelerini, mıknatıs alan kuvvetinin bir fonksiyonu olarak değişebilen optimum değerlere ayarlayın. Spektrum edinimi tamamlandıktan sonra, tüm fosfolipid rezonansları için en iyi sonuçları elde etmek için optimize edilmiş parametreleri kullanarak serbest indüksiyon bozunmasını işleyin. En az iki farklı filtreleme prosedürü kullanarak işlemi tekrarlayın.Son olarak, sinyal-gürültü oranını artırmak için çok zayıf ve geniş sinyalleri izasyon yoluyla önemli bir örtüşme olmadan filtreleyin. Bu deneyde, çok kalabalık bölgelerde bile analiz edilen tüm spektral bölgeler için son derece dar spektral çizgiler elde edildi. 0.01 P PP M'den daha az bir mesafedeki tepe noktaları 400 megahertz'de neredeyse tamamen ayrılabilir.Sonuç olarak, çok sayıda küçük, ancak şu anda atanmamış tepe noktalarının kalitatif ve kantitatif analizi, 200.Milimolar yerine 1000 milimolar seçilerek gelecekteki çizgi daralmasında öngörülebilir. CDTA istendi, ancak 297 yerine 277 Kelvin seçilerek fosfolipid sinyal hattının daralmasına neden oldu. Kelvin arzu edildi, ancak aynı zamanda fosfolipid sinyallerinin süperpozisyonuna neden oldu.CDTA konsantrasyonunda 200 milimolar'dan 50 milimolar'a bir düşüş, yalnızca çizgi genişliğinde mütevazı bir artışa ve kimyasal kaymalarda neredeyse hiç değişikliğe neden olmaz. Bununla birlikte, 50 milimolar CDTA ekstraktındaki doku konsantrasyonunun, 200 milimolar CDTA ekstraktındakinin yarısı kadar yüksek olduğunu unutmayın. Nispeten dar çizgileri açıklayarak, önemli bir konsantrasyon aralığını kapsayan çok sayıda ölçülebilir fosfolipid tespit edildi.Spektral çözünürlük, belirli tepe noktalarının kısmi bölünmesini rutin olarak tespit etmek için bile yeterlidir. Sonuç olarak, gelecekte başka fosfolipid alt gruplarının kalitatif ve kantitatif analizi öngörülebilir. Bu prosedürü denerken, optimal metabolit analizini garanti etmek için her bir adımı son derece dikkatli bir şekilde gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir.

metabolomic-analysis-rat-brain-high-resolution-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Mikrobiyal planktonik toplulukların metaboliti çıkarımı için bir yöntem sunulmaktadır. Tüm topluluk örnekleme özel hazırlanmış filtreler üzerine filtrasyon sağlanır. Liyofilizasyon sonra, sulu çözünür metabolitleri ekstre edilir. Bu yaklaşım doğal ya da deneysel mikrobiyal toplulukların trans-omik araştırmalar çevre metabolomik uygulaması için izin verir.

Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Çevre metabolomik için düşük yoğunluklu Planktonik topluluklardan Metabolitlerinin Konsantrasyon

Biz TSSB hastalarının karakteristik nöroendokrin fonksiyonlarda kalıcı değişikliklere ve gecikmiş uzun vadeli, abartılı bir korku tepkisi, ortaya travma sonrası stres bozukluğu (TSSB) bir sıçan modelinde tarif. Hayvan modeli ve burada tarif edilen yöntemler, fakat mekanistik çevresel beyaz kan hücrelerindeki biyolojik olan hastalarda ölçülemez beyin çekirdeklerinde biyo, kutu arasında ilişki için yararlıdır.

TSSB, Nöral Hematolojik ve Davranış Bağlantılı Revealing için Hayvan Modelinde Biyobelirteçler

İlerici bir kolonizasyon prosedürü daha ev sahipliği karaciğer metabolizması üzerine olan etkisini değerlendirmek için tarif edilir. Yüksek Çözünürlüklü Magic Angle İplik (İK MAS) bozulmamış biyopsi NMR profil hepatik metabolizma tarafından değerlendirilir Kolonizasyon NMR tabanlı metabolik profil mikrobiyal co-metabolitleri idrar atılımı değerlendirerek invazif olmayan izlenir.

Germ-free Mouse Aşamalı Kolonizasyon sırasında Karaciğer metabolik değişiklikler Değerlendirilmesi 1 H-NMR Spektroskopi

Dopamin belirgin hücre gövdeleri ve dopamin nöron dendritler içeren Ortabeyin çekirdekler, düzenlenmiştir. Burada substantia nigra (SN) ve kemirgenlerde ventral tegmental alan (VTA) ve orta beyin çekirdeklerinde dopamin regülasyonu üzerine, böylece bir diseksiyon ve örnek işleme sonuçları maksimize etmek için yaklaşım, sonuç ve görüşlerini açıklar.

Substantia nigra ve ventral Tegmental Bölgesi Dopamin Yönetmelik Kapsamlı Profilleme

Kaynak: Blanc, J., et al. Bıyık aktivasyonu sırasında sıçan fıçı korteksinde 7 T'de fonksiyonel manyetik rezonans spektroskopisi. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, bıyık stimülasyonu sırasında fonksiyonel manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak sıçan fıçı korteksindeki metabolik değişiklikleri analiz etme yöntemini göstermektedir. Temel metabolit spektrumları, varil korteksindeki laktat artışını tespit etmek için uyarılmış spektrumlarla karşılaştırılır ve başarılı nöronal aktivasyonu doğrular.

Bıyık Stimülasyonu Sırasında Sıçan Fıçı Korteksinin Fonksiyonel Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Küçük hayvan pozitron emisyon tomografisi, beynin iki ana enerji substratının değerlendirilmesini sağlar: glikoz ve ketonlar. Mevcut yöntemde, her hayvana 11C-asetoasetat ve 18F-florodeoksiglukoz sırayla enjekte edilmekte ve bunların alımı, manyetik rezonans görüntülerinden belirlenen spesifik beyin bölgelerinde kantitatif olarak ölçülmektedir.

Rat Bölgesel Beyin Enerji Yüzeyleri Alımına Kantitatif Tedbir için A Çift Tracer PET-MR Protokolü

Kan oksijen-düzey-bağımlı tarafından fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (kalın fMRI) (S1BF denir) karşılık gelen somatosensor varil alan korteks alanı doğru olan aktif, ana kontrol ettikten sonra bu çalışmanın hedeftir laktat içeriği ölçmek için 7 T., yerelleştirilmiş proton manyetik rezonans spektroskopi (1H-Bayan) tarafından aktif sıçan beyin...

Fonksiyonel Manyetik rezonans spektroskopi 7 fare varil kortekste bıyık etkinleştirme sırasında T

Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi için yüksek çözünürlüklü elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu işleme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen mikrografikler, diğer hücresel bileşenlerin bir dizi morfolojisi ve boyutsal yapısal ilişkilerini incelemek için de kullanılabilir.

Sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağıtımının Ultrastrik morfometrik analizi için yenidoğan Rat beyin dokusunun hazırlanması

Bu protokol, düşük doz deksmedetomidin ile birlikte düşük doz izofluran kullanan bir sıçandan kararlı istirahat durumu fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (rs-fMRI) verilerini elde etmek için bir yöntem açıklar.

Sıçanda Dinlenme Durumu Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Verilerinin Alınması

Bu makale, bitkilerin metabolik profillemesinde PSYCHE ve SAPPHIRE-PSYCHE'nin kullanımını sunmakta ve numune hazırlama ve optimal Pure Shift NMR spektrum kaydı için ayrıntılı prosedürleri içermektedir. Homonükleer ayrışma ile elde edilen çözünürlük kazancının, sistemin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına izin verdiği örnekler tartışılmaktadır.

Saf Vardiya Nükleer Manyetik Rezonans: Bitki Metabolomikleri için Yeni Bir Araç

Dinamik pozitron emisyon tomografisi (PET) verilerinin elde edilmesi ve zaman dilimlerine göre yeniden yapılandırılması, tek denek düzeyinde metabolik beyin bağlantı analizine olanak tanır. Sıçan beyninin [18F]FDG dinamik PET verilerini elde etmek ve ilgilenilen hacimlerin zaman-aktivite eğrilerinin çıkarılması yoluyla bir bağlantı matrisi elde etmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Tek Denek Düzeyinde 2-Deoksi-2-[18F]Floro-D-Glukoz Dinamik Pozitron Emisyon Tomografisi Kullanılarak Metabolik Beyin Bağlantısının İncelenmesi

Öğrenin, sıçan beyin dokusundan yüksek çözünürlüklü metabolit profilleri elde etmek için NMR spektroskopisi kullanımını. Bu yöntem, nörokimya ve metabolomik alanlarında hastalıkların beyin metabolizması üzerindeki etkilerini anlamaya yardımcı olur.

Doku Esansı Yüksek Çözünürlük Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Sıçan Beyin metabolomic Analizi

Daha fazla video keşfet