Name: C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta dauer evresinde duyu nöronlarının yeniden yapılanmasını canlı görüntüleme yöntemiyle. Bu teknik, çevresel streslere karşı nöroplastisite mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dr. Maureen Barr'a teşekkür ederim, onun gözetimi altında dauer IL2 yeniden modelleme fenotipi ilk olarak karakterize edildi. El yazmasını eleştirel bir şekilde okuduğu için Dr. C. Britt Carlson'a teşekkür ederiz. Barr laboratuvarındaki finansman NIH'den (5R01DK59418) ve USDA'dan (2010-65106-20587) ve New Jersey Omurilik Araştırmaları Komisyonu'ndan (CSCR12FEL004) doktora sonrası burslardan sağlandı. Bu çalışma için mevcut finansman, Illinois Üniversitesi Urbana-Champaign ACES FIRE hibesi kolejinden sağlanmaktadır.

1. Ham Dauer Feromon Üretimi <ol><li> OP50 E. büyütün Tek bir koloni, O / N 37 ° C &#39;de E. coli 200 rpm&#39;de LB suyu 100 ml çalkalandı. NOT: Bu göre O / N kültür önceden yapılmış ve 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> N2 C büyütün elegans, 15 - 20 OP50 E: 50 ul NGM ağarma (Tablo 1 &#39;de tarif bak) ile 6 cm Petri kapları coli bakteri kadar neredeyse 19 tükenmiş. </li><li> 1 L Erlenmeyer&#39;de S medya 5x 250 ml (Tablo 1 tarifi görün) Marka 19 şişeleri. NOT: Bu çözüm önceden yapılabilir. </li><li> OP50 E. kültürünü büyütün E. coli &#39;de OP50 1 ml LB suyu aşılayarak O 4 L / K coli E. coli ve 16 saat boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanarak. </li><li> , (S bazal çözeltisi (Tablo 1 &#39;de tarif bak) ve Aşama 1.3&#39; de hazırlanan media, 4: 1 L&#39;lik Erlenmeyer kaplanna her birinin içine, 4-5 plakalarından buraya nematod 1 ml levhalar (adım 1.2) için 4- nematodları yıkayın 5 plakalarıHer şişe için) 19,. </li><li> 10 dakika boyunca 650 x g&#39;de aşama 1.4 OP50 santrifüj ve supernatant çıkarın. G taban çözeltisi 10 ml her bir bakteri pelletini. Nematodların her şişeye yeniden süspansiyon haline getirildi bakteri eşit miktarda aktarın. </li><li> Çözelti, yiyecek tükenmesi gösteren temizlemek için başlayana kadar 5 gün - (- 25 ° C&#39;de 20) ve 100 - 4 150 rpm&#39;de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde şişeler yerleştirin. </li><li> Gıda bitince, OP50 E. başka bir O / N kültür büyümek LB suyu 4x 1 L E. coli. 10 dakika boyunca 650 x g&#39;de santrifüj ve bakteri, nematodlar ile media şişelere her bir şişeye bir pelet ekleyin. Gıda daha bitene kadar ilave 3-4 gün boyunca, Aşama 1.7 gibi orbital çalkalayıcıya S ortam şişeler dönün. </li><li> Her bir şişeden bir çözelti ~ 1 ml lik bir alın ve her biri 1 ml&#39;lik bir 1 ul alt-numûne alma ve nematodların sayısını sayarak nematod konsantrasyonu tahmin ediyoruz. NOT:75,000 nematodlar / mL - nematod popülasyonu 50,000 olmalıdır. Bu konsantrasyonda nematod çoğunluğu dauers bulunmaktadır. </li><li> Kirlenmiş şişeleri atın. NOT: Kirlilik sık adımı 1.9 sırasında görülen hyphe&#39;nin olarak tezahür eder. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 4000 x g&#39;de santrifüje nematodlar. Nematod pelet atın ve süpernatant saklayın. Alternatif olarak, düşük potens feromon yapmak için bu hayvanları kullanarak tartışma bakın. </li><li> # 1 Whatman filtre kağıdı ile süpernatantı Filtresi. NOT: Bir termos bu süreci hızlandırmak olacaktır. </li><li> Ayrıca 0.45 mikron steril vakumlu filtrasyon üniteleri ile süpernatant süzün. Not: Filtrat, 4 ° C&#39;de O / N ya da muhafaza 1,14 devam edilebilir. </li><li> Bir karıştırma çubuğu ile bir 2 L&#39;lik bir kap için filtrat ekleyin. Bir ısıtma karıştırma plakası üzerinde bir çeker ocak içinde yerleştirin. Karıştırılarak bir taşım kaynatın ve yaklaşık 200 ml buharlaşır. 500 ml&#39;lik bir behere çözeltisini. Yaklaşık 50 ml le kadar kaynar Devamft. NOT: çözüm taşmak için mümkün olduğu gibi Bakım bu adım sırasında alınmalıdır. Son 50 ml&#39;lik rengi koyu kahverengi. Pişirme işlemi sırasında herhangi bir zamanda, ısı kapatılabilir ve süzülen madde, oda sıcaklığında ya da 4 ° C &#39;de O / N saklanır. </li><li> G soğuması ve x 1000 de 5 dakika süreyle santrifüj. 100 ml&#39;lik bir beher içine dökün ve süpernatant pelet atılır. </li><li> Kahverengi bir kabuk yüzer aşağı kaynatın. Ateşten alın ve bir spatula ile kabuk kırmaya. Kabuk karşılamak için yeterli 200 derece etanol ekleyin. Parafilm ile beher örtün ve oda sıcaklığında O / N bekletin. Temiz bir beher içine dökün ve etanol tarafına yerleştirin. Kabuk kapağı taze etanol ekleyin. O / N Extractions 3 kez tekrarlayın. Ekstraktları havuzda toplayın. </li><li> Etanol ekstraktları için bir vakum pompası kullanılır. Bir vakum pompası mevcut değilse, bir çeker ocak içinde, bir taraftan karıştırılırken 50 ° C&#39;ye kadar temiz bir cam deney ve sıcak etanol ile özü ekleyin. NOT: etanol l yapışkan bir kalıntı buharlaştırılarak sonraIght kahverengi kalmalıdır. Isıtma kullanıldığı takdirde, çok uzun süre bakım ısıtılarak çözelti yakmak için özen gösterilmesi gerekmektedir. </li><li> Damıtılmış steril su içinde 10 ml bir tortu çözülür. Filtre 1 ml alikotlar içinde -20 ° C&#39;de bir 0.22 um şırınga filtre ve mağaza bu solüsyon sterilize edin. Not: 1 ml su esas sıvı nematod kültürünün her 100 ml için en eritilmesi için kullanılır. Sıvı kültür şişelerinden bir kirlenme nedeniyle göz ardı edilir, örneğin, daha sonra bir tortu çözmek için kullanılan su miktarını ayarlayın. </li></ol> Feromon Doz Tepki 2. belirlenmesi <ol><li> Peptonu olmadan Noble agar NGM ortamı 6x 5 ml yaparak Dauer feromon hazırlanmakta ve 50 ug / ml streptomisin sülfat ug ve dayanıklı feromon bir dizi ile takviye edilmiştir. 4, 19 (Tablo 1 &#39;de tarife bakınız), bir 13x100 mm Karışım bileşenleri cam kültürü tüp, bir Bunsen beki taşmak, ve daha sonra 3 cm Petri kaplarına dökün. </li><li> Am tartılıricrocentrifuge tüpü. E. göre O / N kültürün 1 ml ekleyin mikrosantrifüj tüp içinde ~ 17.000 x g&#39;de tüp ve santrifüj coli OP50. Yüzer sökün. Yine tüp tartılır ve bakteryel tanelerin ağırlığını belirler. % 4&#39;lük bir konsantrasyon için M9 tampon (Tablo 1 &#39;de tarif bakınız) pelletini (a / h). Her bir kısım feromon plaka 4 merkezinin üzerine bakteri süspansiyonundan 10 ul. Mağaza plakaları O / N, oda sıcaklığında. </li><li> Feromon plakalar 4 üzerine yetişkinliğe molt sonra 10-15 gebe N2 vahşi tip çift cinsiyetli bir gün seçin. 4 saat için 3 - 25 ° C&#39;de plakalar saklayın. </li><li> Yetişkin çift cinsiyetli tüm koparmak. Her plaka için bıraktıkları yumurta sayısını kaydedin. Parafilm ile sızdırmaz şekilde kapatılır ve plakaları, 3 gün 17 boyunca 25 ° C&#39;de geri döner. </li><li> Dauers yüzdesini Sayısı (Şekil 2). Not: her iki yöntem için, dikkat edilmelidir ki dauers (ve daha az bir exÇadır olmayan dauers) duvarlara tırmanmaya ve Petri yemekler kapağın üzerine olacaktır. Bu nematod için yemeğin tüm yüzeyini incelemek için bu nedenle önemlidir. </li><li> Bir doz-tepki eğrisi için verilerin Fit ve Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi (dauers meydana getirmek üzere hayvanların% 90 uyarılması için yeterli bir feromon) feromonun EC90 konsantrasyonu tahmin Not:. Normal olarak, AK 90 tahmin etmek için bir lojistik regresyon modeli kullanmak ama farklı istatistiksel yazılım paketi benzer tahminler üretmek alternatif yöntemleri olabilir. </li></ol> Dauer IL2 Nöronlar 3. Canlı Görüntüleme <ol><li> Adım 2.6 belirlenen AT 90 değerini kullanarak protokolü 2 gibi Dauer feromon tabak hazırlayın. </li><li> Entegre IL2 muhabiri transgenini taşıyan bir suş (myIs13 [P klp-6 :: GFP], myIs14 [P klp-6 :: GFP], myIs16 [P protokol 2&#39;de yöntemleri kullanarak dauers Uyarmaktadır <em&gt; KLP-6 :: tdTomato] veya qIs56 [P ara-2 :: GFP]) 12, 20, 21 Not: eq. Is56 kullanılırsa, GFP ifade içine birkaç saat kadar IL2Qs görünür olmayacak Dauer dökücü ve ilk biçimlenme bazı olaylar görünür olmayacaktır. P ara-2 :: GFP transgenden flüoresan sinyal P KLP-6 floresan muhabir daha Dauer sırasında IL2s sonuçta parlak iken, ayrıca, p-Gecikmeli 2 :: GFP Transgen kası zayıf biçimde ifade eden ince IL2 dalları maskeleyebilir. </li><li> Yumurtlama izlenerek, ergin hermafrodit bireyler çıkarmak Parafilm ile sızdırmaz plakalar 25 ° C de 17 34 saat boyunca inkübe edilir. NOT: Dauer molt için zaman uzunluğu bireyler arasında biraz değişir. Dauer molt başlangıcından itibaren 5 hr (39 - - dendrit arborization en hızlı dönemdir 4 başlıyor 44saat sonrası yumurtlama 25 ° C) 12,. </li><li> Görüntüleme bir gün önce, EC90 konsantrasyonunda Dauer feromonu ile M9 tampon% 10 ihtiva eden bir çözelti (ağ / hac) agaroz oluşturur. Agaroz kısım yaklaşık 100 ul bir mikroskop lamı üzerine ve hızlı bir şekilde, ancak, hafifçe düz bir yüzey oluşturmak için agaroz üzerine başka bir slayt yerleştirin. Agaroz katılaşmış sonra bir nem odasına (ıslak kağıt havlu ile pipet kutusu), saran sargısına ve mağaza slaytlar sarın. </li><li> 34 saat kuluçka döneminden sonra, yutak pompalamayı durdurdu nematod için feromon plakaları inceleyin. Ayrı slaytlar bir sürgünün sadece bir yüzü üzerinde agaroz sahip bileşimleri içerir. % 10 agaroz pad ve 0.1 mikron polistiren boncuklar 22 1 μ l üzerine bir veya daha fazla nematod seçin. Not: iyi senkronize nüfusu ile plaka üzerinde nematodların çoğunluğu L2D gelen Dauer için molt giren edilecektir. Ancak, i arasında değişimi olabilirndividuals. Bu hayvanlar Dauer molt içinde olmuştur süre (örneğin temsili sonuçlar bakınız) miktarını tahmin etmek için ek özellikler (stoma tıkanıklığı, boğaz yeniden şekillenme) dikkat etmek önemlidir. </li><li> Nematod yönünü (sol / sağ, dorsal / ventral) belirleyin. Mümkün olan en düşük floresan ile 100x büyütmede her 15 dakika bir IL2Q dendritin Z-yığın görüntüleri yakalayabilir veya belirli bir deney için gerektiği gibi. (Yutak pompalama başlar) nematod L2D manikür ayrılmış kadar görüntü yakalamayı devam edin ve hayvan Dauer kurtarır eğer hareketsizlik imkansız ya. Aktif görüntüleme zamanlarda, bir nemlilik bölmesi içinde slayt yerleştirin. NOT: Bir motorlu sahne ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik bir epifluorescent mikroskop kullanıyoruz. </li></ol>

<ol><li>West-Eberhard, M. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWest-Eberhard%2C+MJ+%22Developmental+Plasticity+and+Evolution%22">Developmental Plasticity and Evolution</a>. , Oxford University Press. (2003).</li>
<li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dauerlarva%2C+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).</li>
<li>Riddle, D. L., Albert, P. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22C.+elegans+II%22">C. elegans II</a>. Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. 739-768 (1998).</li>
<li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva%3A+developmental+effects+of+pheromone%2C+food%2C+and+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature.</a> Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).</li>
<li>Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiddle%2C+DL+%22The+Nematode+C.+elegans%22">The Nematode C. elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. 393-412 (1988).</li>
<li>Fielenbach, N., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+dauer+formation+and+the+molecular+basis+of+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity.</a> Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).</li>
<li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+PJ+%22WormBook%22">WormBook</a>. , 1-19 (2007).</li>
<li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218, 578-580 (1982).</li>
<li>Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+pheromones+that+control+dauer+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).</li>
<li>Jeong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433, 541-545 (2005).</li>
<li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454, 1115-1118 (2008).</li>
<li>Schroeder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dauer-Specific+dendrite+arborization+in+C.+regulated+by+KPC-1%2FFurin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin.</a> Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).</li>
<li>Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+delimit+shape+changes+of+sensory+neuron+receptive+endings+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans.</a> Development. 138, 1371-1381 (2011).</li>
<li>Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+alterations+in+sensory+neuroanatomy+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva.</a> J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).</li>
<li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+chemosensory+control+of+dauer+formation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 130, 105-123 (1992).</li>
<li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+chemosensory+defects+in+daf-11+and+daf-21+mutants+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 303-316 (1994).</li>
<li>Ailion, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dauer+formation+induced+by+high+temperatures+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 156, 1047-1067 (2000).</li>
<li>Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeal%2C+SJ+%22Pheromone+Signaling%22">Pheromone Signaling</a>. , Springer. 273-283 (2013).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li>
<li>Ouellet, J., Li, S., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+is+required+for+both+dauer+maintenance+and+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans.</a> Development. 135, 2583-2592 (2008).</li>
<li>Blelloch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gon-1+gene+is+required+for+gonadal+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, (2012).</li>
<li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool%22%5BJournal%5D)">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Singh, R., Sulston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur

Dauer özgü nöroplastik Dauer ve diğer ilişkili morfolojik değişikliklerin bir inceleme kontrol edilebilir ve her iki genetik mutasyon (örneğin, DAF,-C mutantları) vasıtasıyla veya feromon vahşi tip hayvanların maruz bırakılarak dauers güvenilir oluşturulmasını gerektirir. Dauers ikna etmek için bir genetik mutasyon kullanımı uygun olsa da, bu sonuçlar yanıltabilecek. Bu nedenle Daf-c mutasyonlar ile toplanan veriler daha sonra Dauer feromon maruz Dauer sahne girmek için uyarılan vahşi tip hayvanlar ile...

Gelişimsel ve davranışsal plastisite fenatipik plastisite, olumsuz çevre koşullarına adaptasyonları için önemlidir ve evrim 1 itici bir güç olarak kabul edilir. C. elegans sık geliştirme ve nörobiyoloji çalışmalar için kullanılan bir model organizmadır. İdeal koşullar altında, C. elegans yetişkin üreme aşamasına başlamadan önce dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Ancak, düşük gıda kullanılabilirlik ve yüksek nüfus yoğunluğu, C koşulları altında elegans gelişimsel anahtarı geçmesi ve uzun ömürlü ve stres dayanıklı Dauer evre 2 içine girebilirsiniz. Dauers olasılıkla bu stres direnci aracılık olmayan dauers birkaç morfolojik ve davranışsal farklılıklar gösterecektir. Dauer girişi düzenleyen çevre kuyrukları ve genetik yollar yoğun oldu, 5, 4, 3 6, 7 nitelendirdiler. Ancak, bireysel fenotipik değişiklikleri kontrol eden moleküler mekanizmalar d meydana olduğunurada Dauer oluşumu daha az iyi anlaşılmaktadır. Dauer özgü fenotiplerinin incelenmesi Dauer hayvanların üretimini gerektirir. Bu üç şekilde yapılabilir: 1) C bir açlıktan kültüründen Çekme elegans, 2) Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutantlar, arıtılmış feromon sayesinde Dauer oluşumu 3) ndüksiyonunun kullanımı. Bir C ile standart bir NGM plaka ikinci dauers almak için nispeten basit onun bakteriyel gıda arzını tükenmiş elegans nüfus. Elimizde olanlar, standart bir NGM plaka orjinal 3 gün büyümeye bırakıldı ve daha sonra 3 ile aşılanmış Escherichia coli OP50, 50 ul ile tohumlanmış - 4 ergin hermafrodit bireyler bir hafta içinde gıda kaynağı dışarı atmasını sağlar ve birkaç bin üretecek 25 ° C&#39;de tutuldu İlave bir 3 gün içinde dauers (çok sayıda açlıktan olmayan dauers ek olarak). Bununla birlikte, bu yöntem, d içine molt sırasında meydana gelen incelenmesi işlemleri için tatmin edici değildirauer. Bu Dauer girmektedir tipik bir açlıktan plaka üzerinde bir kaç bin hayvan belirlemek zordur. Ayrıca, hasret plaka kullanımı senkronizasyonu için hiçbir imkanı sunuyor. DAF-C mutantlarının kullanımı senkronizasyon ve dauers güvenilir oluşturulmasına izin verir. Ancak, belirli bir Daf-c mutasyonu tek başına veya ek mutasyonlar ile birlikte diğer Dauer özgü fenotipleri etkilemez garantisi yoktur. Bir Dauer feromon varlığı ilk Cassada ve Russell tarafından ima ve daha sonra Altın ve Riddle tarafından gösterilmiştir. Dauer feromon yana kimyasal olarak 9, 10 8, 2 karakterize edilmiştir. Arıtılmış feromon farklı şekillerde 9, bir ham özü Dauer feromon 11. Kullanımlar sağlar hem hareketsel hem de gelişim süreçleri düzenleyen ascarosides karmaşık bir harmanından oluşur doğal tipte bir arka senkronize dauers güvenilir kontrol indüksiyonu. </p&gt; Sinir sistemi ve ilişkili glial hücreler Dauer larva oluşumu 12, 13, 14 sırasında biçimlenme geçmesi. Bu değişikliklerin bazıları, Dauer 13, 14 sırasında glia hücrelerinin yeniden olarak, geri döndürülemez. Ancak, başka biçimlenme olayları olumlu bir dönüş üzerine geri dönüşümlüdür çevre koşulları. Dendrit arborization, multidendritic nöronlar ve akson 12 biçimlenme tek dendritik bir anahtarı: Örneğin, dört IL2Q nöronların bir dizi dahil Dauer oluşumu sırasında hızlı ve geri dönüşümlü nöronal biçimlenme tabi. Buradaki yöntemler, bir model organizmada strese bağlı nöroplastisitesi güvenilir bir in vivo görüntüleme için izin verir. Üretim ve ham Dauer feromon testleri için sunulan yöntemler, daha önce çeşitli kaynaklardan 4, 8, 15, 16, 17, 18 tarif edilen ve derlenmektedir.

<table><tbody><tr><td>N2 C. elegans Bristol suşu</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III</td><td>Schroeder laboratuvarından</td><td></td><td></td>talep üzerine</tr><tr><td>PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V</td><td>Schroeder laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JK2868'den talep üzerine qIs56[Plag-2:: gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g pepton 975 ml H2O otoklavlanmış 55 ° C'ye soğutulmuş; C ve ardından etanolde 1 ml 5 mg / ml kolesterol, 25 ml 1 M KPO4 tamponu (pH 6.0), 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4</td></tr><tr><td>S Media</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>S ortamı, S bazal çözeltisinden (1.46 g NaCl, 0.25g K < alt > 2 < / alt >HPO< alt > 4 < / alt >, 1.5 g KH<alt >2 < / alt >PO < alt >4< / alt >, etanolde 0.25 ml 5 mg > ml kolesterol ve H<sub2O ila 250 ml. Otoklavlanmış.) S bazal çözeltisine 2.5 ml potasyum sitrat pH 6.0 (2 g sitrik asit monohidrat, 29.4 g tri-potasyum sitrat monohidrat, < / alt >H < alt > 2 O ila 100 ml, otoklavlanmış), 2.5 ml İz Metal Çözeltisi (1.86 g disodyum EDTA, 0.69 g FeSO< alt >4< / alt> nbsp; &boğa; 7 H2O, 0.2 g MnCl2&boğa; 4 H<alt>2</alt>O, 0,29 g ZnSO<alt>4</alt>&nbsp; &boğa; 7 H2O, 0.025 g CuSO4&nbsp; &boğa; 5 H < alt > 2 < / alt >O, H < alt >2 < / alt > O ila 1 L Otoklavlanmış ve karanlıkta saklanmış), 0.75 ml 1 M CaCl <alt >2< / alt> ve 0.75 ml 1 M MgSO< alt >4< / alt>.</td></tr><tr><td>Doz-yanıt tahlili için Dauer feromon plakaları</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Karışım 0.085 g Noble agar, 0.5 ml 0.513 M NaCl ve 5 &mikro; 6x 15 ml'lik kültür tüplerinin her birinde etanol içinde çözülmüş 5 mg / ml kolesterol. Bir konsantrasyon aralığı oluşturmak için her tüpe yeterli miktarda ham feromon ekleyin. Hacmi 4.725 ml'ye getirmek için H2O ekleyin. Agar eriyene kadar bir Bunsen brülöründe kaynatın ve ardından 55 ° C'ye soğutun. 125 & mikro ekleyin; l 1 M KPO<alt>4</alt> tampon (pH 6.0), 50 & l 0.1 M CaCl < alt > 2< / alt >, 50 & mikro; l 0.1 M MgSO4 ve 50 &mikro; Her tüpe 5 mg / ml streptomisin sülfat. Her tüpün içindekileri 35 mm çapında bir Petri kabına dökün. Agarın gece boyunca oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin (daha uzunsa, aşırı kurumayı önlemek için kapalı bir kapta saklayın).</td></tr><tr><td>Mikroküre boncuklar 0.1 mikron</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 tampon</td><td>Çeşitli</td><td></td><td>Karışım 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO<>4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O ila 1 litre. Otoklavlama ile sterilize edin</td></tr></tbody></table>

c. dauer-spesifik nöronal yaptırma vivo görüntülemede elegans

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Hayvanlarda stres ile indüklenen fenotipik esneklik kontrol mekanizmaları incelemek için in vivo olarak çoğunlukla kompleks ve zordur. Stres ile indüklenen plastisite klasik bir örneği, C Dauer aşamasıdır elegans. Dauers bakteriyel gıda ve Dauer feromon yüksek konsantrasyonlarının düşük konsantrasyonlarda koşulları altında oluşan alternatif bir gelişim larva bulunmaktadır. Dauers kapsamlı gelişimsel ve davranışsal plastisite gösterir. Örneğin, dört iç dudak kadran bir dizi (IL2Q) nöronları Dauer oluşumu sırasında Reverzibl remodeling tabi tutulur. Büyük ölçekli sıvı nematod kültürlerinden ham Dauer feromonunun üretimi için iyi bilinen çevre yollarını düzenlemeye Dauer girişi, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntemle, 50,000 &#39;lik bir konsantrasyon - sıvı kültürü 75,000 nematod / ml bir yüksek ölçüde kuvvetli ham Dauer feromon üretmek için yeterlidir. Ham feromon gücü olan deteBir doz-tepki biyo-tahlil ile rmined. Son olarak, Dauer oluşumu sırasında IL2Qs in vivo zaman atlamalı görüntüleme için kullanılan yöntemler tarif edilmiştir.

Isı, soğuk ve stabil olarak sarı bir sıvı ham Dauer feromon sonuçları (Şekil 1) üretimi. Ham feromon alikotlar aktivitesinde belirgin bir kayıp olmadan, süresiz olarak -20 ° C'de saklanır. Feromonun üretiminin ardından, tekli bir doz-yanıt potens biyolojik tayin, kaba bir tahmin için yeterlidir. 3 kez ve her deneyde bir ortalamasını alın - Bununla birlikte, çoğu deneyleri için bu biyo-analizi tekrar 2 için gereklidir. Iki feromon biyoanalizlere Temsilcisi sonuçları Şekil 3'te verilmişti...

Belirli çevresel stres faktörlerine maruz kaldıktan sonra, nematod Caenorhabditis elegans, strese dirençli bir 'dauer' gençlik aşamasına girmek için geniş fenotipik plastisiteye uğrar. Dauer sırasında nöroplastisitenin kontrollü indüksiyonu ve görüntülenmesi için yöntemler sunuyoruz.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Bu prosedürün genel amacı, deniz zarafetinde duyusal nöronların çeyiz spesifik yeniden şekillenmesini görüntülemektir. Bu, önce sıvı kültürden ham ekşi feromonunun ekstrakte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ham feromonun gücünü ölçmektir.Daha sonra, feromon, IL iki nöronunda GFP'yi eksprese eden hayvanda dour oluşumunu indüklemek için kullanılır. Son adım, DMT aşaması sırasında hayvanı mikroskop lamına monte etmek ve dendrit arborizasyonunu göstermek için canlı görüntüleme yapmaktır. Bu yöntem, nöronların çevresel koşullara yanıt olarak nasıl yeniden şekillendiği gibi nöroplastisite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu yöntem IL iki yeniden modelleme hakkında fikir verebilse de, faringeal yeniden şekillenme gibi diğer daer'e özgü olaylara da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, OP 50 e coli'yi tek bir koloniden gece boyunca 37 santigrat derecede büyütün ve 200 RPM'de 100 mililitre lb et suyu içinde çalkalayın. Daha sonra, bakteriler neredeyse tükenene kadar 50 mikrolitre e coli ile oturtulmuş NGM Agar ile 15 ila 26 santimetrelik Petri kaplarında N two C zarafetini büyütün.Daha sonra, bir mililitre Coli'yi aşılayarak ve 16 saat boyunca 37 sa

in-vivo-imaging-of-dauer-specific-neuronal-remodeling-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Basit bir mikroakışkan cihaz anestezik ücretsiz gerçekleştirmek için...

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Kaynak: Doser, R., et al. Nöronal Kalsiyum İşleminin In Vivo Hücre Altı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2023)Bu video, transgenik Caenorhabditis elegans suşlarının ventral sinir kordonu nöronlarındaki hücre altı kalsiyum akışının in vivo görüntülemesini göstermektedir. İki farklı kalsiyum indikatörü kullanılır: bir suşta bir sitoplazmik indikatör ve diğerinde bir mitokondriyal indikatör kullanılır. Nöronlar, nöronal sitoplazma ve mitokondri içindeki floresan yoğunluğundaki gerçek zamanlı...

Caenorhabditis elegans Nöronlarında Hücre Altı Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Onun küçük şeffaf gövde, iyi belgelenmiş nöroanatomi ve müsait genetik teknikler ve reaktiflerin bir dizi...

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

Hayvanın hareketsiz hale getirilmeden uzun zaman ölçeklerinde davranışı ve nöral aktiviteyi görüntülemek, davranışı anlamak için bir ön koşuldur. Agaroz mikroakışkan odacıkların görüntülenmesi (), Caenorhabditis elegans'ın tüm yaşam evreleri için nöral aktivite ve davranışı görüntülemek için kullanılabilir.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Dendritik dikenler sinir sisteminin önemli hücresel özellikleridir. Burada C. elegans'ta dendritik dikenlerin yapısını ve işlevini değerlendirmek için canlı görüntüleme yöntemleri tanımlanmıştır. Bu yaklaşımlar, dendritik omurga şeklini veya işlevini tanımlayan genler için mutant ekranların geliştirilmesini desteklemektedir.

Caenorhabditis elegans'ta Dendritik Dikenleri Görüntüleme

Dinamik mikrotübüllerin floresan etiketli Uç bağlayıcı protein kullanılarak vivo olarak görüntülenmesi için bir protokol sunulmuştur. C. elegans'ınPosterior lateral mikrotübül (PLM) nöronunda dinamik mikrotübülleri etiketleme, görüntüleme ve analiz etme yöntemlerini açıkladık.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta dauer evresinde duyu nöronlarının yeniden yapılanmasını canlı görüntüleme yöntemiyle. Bu teknik, çevresel streslere karşı nöroplastisite mekanizmalarını anlamak için kullanılır.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

Daha fazla video keşfet