Name: Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin oligodendrosit soya hücrelerinin proliferasyon ve diferansiyasyonunu in vivo benzeri koşullarda incelemek için. Fare beyni ve serebellum organotipik dilim kültürleri kullanılarak hücre dinamikleri görüntülenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Multipl Skleroz Derneği (RG4179'dan A.N.'ye), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH R01NS073425 ve R01NS074870'dan A.N.'ye) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (A.N.) alınan hibelerle finanse edilmiştir. Dr. Frank Kirchhoff'a (Saarland Üniversitesi, Homburg, Almanya) PLPDsRed transgenik fareler sağladığı için teşekkür ederiz. Transgenik fare kolonisinin korunmasındaki yardımları için Youfen Sun'a teşekkür ederiz.

NOT: Tüm hayvan prosedürleri yönergeleri izleyerek ve Connecticut Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. NOT: YFP muhabiri 20 (JAX # 006148) çizgiler sırasıyla kullanıldı: NG2cre 18 bünye (JAX # 008533) ve NG2creER 16 uyarılabilir bu deneylerde (JAX # 008538) için transgenik fareler 19 (JAX # 003920) veya gtRosa26 / EG Z&#39;ye geçti Görüntü NG2 hücreleri ve soylarına. Görüntü olgun oligodendrositlere, PLPDsRed transgenik farenin 21 kullanılmıştır. Tutarlı hayatta kalmak için, dilimler ön beyin ve beyincik hem doğum sonrası gün 10 fareden izole edilebilir. 1. Dilim Hazırlık <ol><li> Bir kültürü kaputu, altı iyi plakaları doku kültürü yerlefltirmede ve (reaktif bölümünde tarifi) 1 ml dilim kültür ortamı ekleyin. % 5 ile 37 ° C&#39;de diseksiyon önce CO2 en az 2 saat, hücre kültürü inkübatöründe plakaları koyun. </li><li> % 70 etanol ile tüm araçları ve doku chopper sterilize edin. </li><li> Diseksiyon önce başlamasından en az 15 dakika boyunca buz üzerinde% 95 O2,% 5 CO2 ile kabarcık tampon diseksiyon (reaktif bölümünde tarif). </li><li> Onaylanmış hayvan protokollere göre 5-10 dakika süreyle buz üzerinde yerleştirerek fare yavrular anestezisi. Farenin kuyruk ve ayak sıkıştığı yanıt vermeyen onaylayarak anestezi uygun derinliğini teyit edin. </li><li> Hayvan protokolleri aşağıdaki keskin bir makas kullanarak hayvanları başını kesmek. Hızla ilk sterilize araçlarını kullanarak lateral insizyon ardından sagital kesim, yaparak ön beyin ve beyincik üzerinde kafatası çıkarın. Dikkatli bir tarafına doku yuvarlayarak beyin ve beyincik ventral yüzeyinden kafatası sinirlerinde kesin. </li><li> Buzla soğutulmuş, oksijenli diseksiyon tampon içeren steril bir 35 mm çanak doku yerleştirin. </li><li> Bir jilet kullanarak, beyincik ve ön beyin sever. Sonra mid-sagital kesim uçtan bir uca yapmakhemisferleri ayıran öf ön beyin ve beyincik. </li><li> Manuel doku kıyıcı ile ön beyin ve beyincik 300 mikron kalınlığında koronal ve sagital kesitler halinde kesilmiştir. NOT: Manuel doku kesici ve agaroz yerleştirilmesi için gerek kalmadan kültür kuluçkalamadan diseksiyon ikinci hızlı bir şekilde işlenebilirlik sağlar. Daha önce tarif edildiği gibi, 9 bir vibratome da kullanılabilir. </li><li> Buz üzerinde taze kabarmış soğuk diseksiyon tampon ayrılır dilim aktarın. </li><li> Küçük diseksiyon kullanın veya bireysel bölümleri ayırmak ve kültürü ekler ile altı iyi yemekler preinkübe aktarmak için spatulası ağırlığında. </li><li> Tek kullanımlık bir transfer pipeti veya P 200 pipet ucu kullanılarak kültür uç yüzeyinden herhangi bir aşırı diseksiyon tamponunu çıkarın. Üç önbeyinde üç serebellar dilim iki bir kültür insert yerleştirilebilir. NOT: ön beyin kültürleri ile tutarlı sonuçlar için, anterior korpus kallosum üçte birini kapsayan dilim almak idealdirAynı dilim içinde hem gri hem de beyaz cevher bölgelerini incelemek için (Şekil 1A). Her hayvan genellikle 6 ön beyin dilimleri ve 6 beyincik dilimleri verir. </li><li> Inkübatör altı havuzlu plakalar yerleştirin ve daha sonra 1 1 gün sonra dilim dilim hazırlanması ortamının mililitresi ve dilim sabitleme kadar her gün ile dilim orta yerine. </li><li> Deneye bağlı olarak, kültür 5-7 gün sonra dilimler kullanın. Sadece ilk birkaç gün sonra şeffaf hale dilimleri kullanın ve düzensiz opak bölgeler var olanlar atın. NOT: dilimler içinde Opak bölgeler gözle görünür ve faz kontrast altında koyu hücrelerin bir yığın olarak görünür. Teknik hakim olmuştur sonra ölü opak dilimler dilim az% 1-5, nadiren meydana gelir. </li></ol> NG2 hücre Bölümü ve Oligodendrosit Farklılaşma 2. Time-Lapse Görüntüleme NOT: ZEG farenin 16: biz NG2cre kullanmak NG2 hücre çoğalması ve farklılaşması zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek içinNG2 hücreleri ve soyu (Şekil 1C-E) EGFP ifade edilmektedir. Bu hat Raportör ekspresyonu, kısa bir sürede en az dört haftalık bir süre boyunca kesit sonra dilimler canlı GFP görüntüleri + hücreler elde etmek için yeterince sağlamdır. Açık görüntüler kültüründe ilk 3-5 gün içinde gerçekleşir dilim, ilk incelmesi döneminden sonra elde edilir. <ol><li> Deney boyunca, 37 ° C&#39;de hücre kültürü inkübatöründe dilimleri tutmak ve kısa süreler için, sadece kaldırma (dilim başına en az 15 dakika), altı yuvalı plaka sırasında görüntüleme üzerindeki kapağı tutmak. </li><li> Bir dijital kamera ile donatılmış bir ters floresan mikroskop kullanılarak, bir 10X objektif kullanılarak ilk kez noktasında görüntüleri yakalayabilir. NOT: İlk kez puan deney göre değişir ve dilimler hazırlanmıştır gün veya sonrasında herhangi bir zaman noktası olabilir. </li><li> Dilim hem gri hem de beyaz cevher alanlarında zaman noktasında bir çoklu bölgelerden görüntüler yakalayın. Not thdilim içinde belirli noktalara ile ve daha sonra bir görüntüleme oturumları için kullanılabilecek bir şema üzerinde görüntü konumu eşleyerek görüntülenmiş e bölgesi. Faydalı yerlerine beyaz cevher yollarının dilimleri ve / veya yönlendirme kenarlarını içerebilir. Görüntü her zaman noktasında her dilim 4-8 yerleri. </li><li> 4-6 saat arayla sonraki fotoğrafları çekmek NG2 hücre bölünmesini ve olgodendrosit farklılaşma, ideal üzerinde 5-7 gün inceleyerek eğer. </li><li> Tüm bölgelerin nihai bir görüntü yakalamak ve hemen dilimleri düzeltmek. Daha sonra dilimler üzerine başka bir 1 ml ilave edilir, kültür ucun tabanına (0.1 M L-lisin, 0.01 M sodyum meta-periodat ile% 4 PFA), sabitleyici 1 ml ilave edilir. Bu membran ayırmak gibi dilim doğrudan Fiksatif fışkırtma dikkat edin. 30 dakika boyunca doku saptamak ve bölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi gelişimsel aşama spesifik markörleri kullanılarak immünohistokimya ile devam edin. </li><li> 0.2 M sodyum fosfat tamponu, 3 x 10 m ile yıkayın dilimleriolarak. 1-3 gün boyunca 0.2 M sodyum fosfat tampon maddesi içinde 4 ° C&#39;de, gerekli deposu dilimleri daha önce immüno-boyama ve ancak ideal olanı ise, 24 saat içinde ve boyama gibi. Oligodendrositler (Şekil 2D,-F) farklılaşmış olan hücrelerin oranını belirlemek için bölüm 4, aşağıda tarif edildiği gibi immünohistokimya ile devam edin. </li></ol> Dilim Kültürlerde indüklenebi- Muhabir transgenik fareler kullanılarak NG2 hücre Döl 3. Kader Haritalama Not: kültüründe belirli bir zaman noktasında NG2 hücrelerin kaderini izlemek için, uyarılabilir NG2creER: YFP transgenik fareler kullanılabilir. <ol><li> Kültür ortamına, etanol içerisinde çözündürüldü, 100 nM 4OHT ekleyerek, Cre rekombinasyonunu ve bildirici ifadesini teşvik eder. Not: Raportör pozitif hücreler, bütün NG2 hücre aşamasında hücreler olacaktır ~% 20-25, YFP + NG2 + / + hücrelerinin NG2 bir indüksiyon verimle ve bu zaman noktasında 1-2 gün içinde görünecektir (Şekil 2A-C) </li><li> Fix ve dilim yıkayınFarklı zaman noktalarında in çeşitli değişiklikler yapıldıktan sonra (Bölüm 2.5 ve 2.6 &#39;da tarif edilmiştir). </li></ol> 4. Dilim İmmünhistokimya <ol><li> Bir neşter kullanılarak ekler dışarı ekli dilimleri ile membranlar kesti. </li><li> Membran taşırken dilimin bileşimi bozmak için özen cımbız bir dizi kullanılarak 24 gözenekli bir plaka ihtiva eden fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), tek tek oyuklara dilimleri aktarın. </li><li> 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 normal keçi serumu (NGS) ve% 0.1 Triton-X100 içeren bloke etme çözeltisi, 24 gözlü bir levhaya dilimleri aktarın. </li><li> 4 ° C&#39;de PBS içinde% 5 NGS / birincil antikor O&#39;da N dilimleri inkübe edin. NG2 hücre safhasında hücrelerin belirlenmesi için, ve NG2 PDGFRα antikorlar kullanır. Diferansiye oligodendrositlerin belirlenmesi için, adenomatus poliposis koli antijene karşı bir antikorun kullanılması (APC klon CC1). </li><li> PBS 3 x15 dakikada ikinci gün yıkama dilimleri, daha sonra ikincil Antibo kuluçkaya yatmaktadıroda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içerisinde% 5 NGS ölür. PBS 3 x15 dakika dilimleri yıkayın ve slaytlar monte. Membran objektif ve doku arasındaki olmayacak şekilde slayt karşı karşıya dilimleri yukarı ve membran ile monte edin. </li></ol>

<ol><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures+for+long-term+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Bahr, B. A., Kessler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+maintenance+of+glutamate+receptors+and+other+synaptic+components+in+long-term+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices.</a> Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).</li>
<li>Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+radial+glial+cells+establish+radial+units+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex.</a> Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).</li>
<li>Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).</li>
<li>Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analysis+of+purkinje+cell+dendritic+morphology+in+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+culture+of+E18+rat+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice culture of E18 rat brains.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235(2007).</li>
<li>Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polydendrocytes+%28NG2+cells%29%3A+multifunctional+cells+with+lineage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).</li>
<li>Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+oligodendrocyte+dynamics+in+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture.</a> Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).</li>
<li>Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cell+transplantation+into+organotypic+cerebellar+shiverer+slices%3A+a+model+to+study+myelination+and+myelin+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance.</a> PloS one. 7 (7), (2012).</li>
<li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).</li>
<li>Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+remyelination+after+antibody-mediated+demyelination+in+an+ex+model+for+immune+mediated+CNS+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage.</a> Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).</li>
<li>Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axin2+as+regulatory+and+therapeutic+target+in+newborn+brain+injury+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).</li>
<li>Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+fate+and+lineage+restriction+of+single+NG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells.</a> Development. 138 (4), 745-753 (2011).</li>
<li>Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+Cells+in+White+Matter+But+Not+Gray+Matter+Proliferate+in+Response+to+PDGF%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF.</a> Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).</li>
<li>Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+cells+generate+both+oligodendrocytes+and+gray+matter+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes.</a> Development. 135 (1), 145-157 (2008).</li>
<li>Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z%2FEG%2C+a+double+reporter+mouse+line+that+expresses+enhanced+green+fluorescent+protein+upon+Cre-mediated+excision%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision.</a> Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).</li>
<li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).</li>
<li>Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+reef+coral+fluorescent+proteins+in+the+central+nervous+system+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).</li>
<li>Nave, K. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li>
<li>Rivers, L. E., Young, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRA%2FNG2+glia+generate+myelinating+oligodendrocytes+and+piriform+projection+neurons+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).</li>
<li>Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progeny+of+Olig2-expressing+progenitors+in+the+gray+and+white+matter+of+the+adult+mouse+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+the+dynamics+of+CNS+glial-axonal+interactions+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo.</a> PloS one. 7 (1), e30775(2012).</li>
<li>Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+increases+oligodendroglial+cell+proliferation+in+rat+cerebellar+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures.</a> Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).</li>
<li>Azim, K., Butt, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK3%CE%B2+negatively+regulates+oligodendrocyte+differentiation+and+myelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo.</a> Glia. 59 (4), 540-553 (2011).</li>
<li>Hussain, R., El-Etr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+and+nestorone+facilitate+axon+remyelination%3A+a+role+for+progesterone+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Lubetzki, C., Demerens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even+in+culture%2C+oligodendrocytes+myelinate+solely+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).</li>
<li>Demerens, C., Stankoff, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+myelination+in+the+central+nervous+system+by+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+myelination+by+specific+patterns+of+neural+impulses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Control of myelination by specific patterns of neural impulses.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).</li>
<li>Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine%3A+a+neuron-glial+transmitter+promoting+myelination+in+the+CNS+in+response+to+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials.</a> Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).</li>
<li>Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+local+protein+synthesis+and+initial+events+in+myelination+by+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials.</a> Science. 333 (6049), New York, N.Y 1647-1651 (2011).</li>
<li>Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+geometric+and+spatial+constraints+of+the+microenvironment+induce+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler

Merkezi sinir sisteminde etkin Myelinasyon nöronal iletişim ve aksonal hayatta 22 için gereklidir. 25 - En beyin bölgelerinde 16,23 içinde yerleşik nüfusu korurken NG2 hücreleri sürekli yetişkinlik içine Myelinating oligodendrositleri oluşturmak. Bu hücrelerin farklılaşmasını düzenleyen bazı genetik ve moleküler mekanizmalar tarif edilmiştir ama çok keşfedilmeyi beklemektedir. Organotipik dilim kültürleri nedeniyle anatomik bölge, hücre dışı ortama kolay manipülasyon, sağlam myelinasyon,...

4 - merkezi sinir sistemi Organoytpic dilim kültürlerinin semiintact sistem 1 &#39;de nöron ve glial hücre biyolojisi çalışmak için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. 9 - Bu kültürler, kabul ve bu hücre dışı ortamın bir manipülasyon ve tekrarlamalı uzun-süreli canlı hücre görüntüleme için kolay erişim ve elektrofizyolojik kayıtları 5, birincil hücre kültürleri ayrışmış birçok yararlarını korumak için nispeten basittir. Buna ek olarak, dilim kültürler, 3 boyutlu doku hücre mimarisini, bölgesel sinir bağlantısına sahip, ve en önemli hücre tiplerinin sistemde bulunmaktadır. Bu özellikler hücresel ve çevresel etkileşimleri ile tek hücre davranış ve fizyolojisini araştırmak için bu Kültürlerin benzersiz ve kullanışlı bir sistem yapmak. NG2 hücrelerinin çoğalmasını ve m oluşturmaya devam memelilerin merkezi sinir sistemindeki glial hücreler bir nüfusembriyonik ve postnatal gelişim 10 sırasında oligodendrositleri yelinating. Bunlar yaygın olarak ayrışmış primer hücre kültürlerinde incelenmiştir ve floresan proteinleri NG2, hücre spesifik ifadesi ile transgenik fare hatları son gelişmeler, akut dilim preparasyonlarında in vivo kaderi haritalama ve elektrofizyolojik kayıtları kolaylaştırmıştır. Hatta bu çalışmalar ile, küçük NG2 hücre çoğalması ve olgodendrosit farklılaşmasının zamansal dinamikleri hakkında bilinmektedir. Ayrışık hücre kültürü geniş farmakolojik ve genetik manipülasyon göreli tesis için kullanılır, ancak, bunun hücresel mikro-bağlamını sağlamak tercih edilir, özellikle, beynin farklı bölgelerinde bu hücrelerin fonksiyonel farklılıklar sorgulamak için uygun değildir. Dilim kültürleri, hücre farmakolojik manipülasyonlar mükellef ve olgodendrosit myelinleşmeyi 11,12 araştırmak için kullanılır olmuştur basit bir alternatif sağlamak(LPC) lisolesitin veya antikor farmakolojik tedavinin 15 üzeri demiyelinizasyonu 13,14 ve remiyelinizasyon indüklenmesini sonra ular yanıt. Bir yöntem araştırmak ve canlı görüntüleme ve sabit doku (veya Postfiksasyon) ön beyin ve beyincik hem de alınan organotipik dilim kültürlerde NG2 hücre çoğalması ve farklılaşması olgodendrosit analizini tarif gerçekleştirmek için. Bu bölünme sonrası 16 tek NG2 hücrelerinin hücre kaderine incelemek için ve büyüme faktörü ile uyarılan NG2 hücre çoğalması 17 bölge ve yaşa bağlı farka için kullanılabilir güçlü bir yöntemdir. Bu, nispeten basit teknik ayrıca doğuştan ve / veya çevresel, bu glial hücre fizyolojisi ve nöronal aktivite ya da mielin hasarına cevabı düzenleyen mekanizmaların hücre araştırılması yaygın erişilebilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dilim Kültür Ortamı</td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Orta</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td>%50Hank</td></tr><tr><td>' s Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Invitrogen</td><td>14175</td><td>%25</td></tr> <tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td>25mM</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td>1mM</td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>1mg/L</td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>0.4mM</td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Hidroklonu</td><td>SH30074.03</td><td>%25</td></tr><tr><td colspan="4">NaOH ile pH 7.22'ye titre edin, şişe üstü filtre ile süzün ve 4 santigrat</td></tr><tr> derecede saklayın<td colspan="4">Diseksiyon Tamponu</strong</td></tr><tr><td>>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>124mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>3.004mM</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>1.25mM</td></tr><tr><td>MgSO<alt>4</alt> (susuz)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>4.004mM</td></tr><tr><td>CaCl<alt>2</alt> 2H<alt>2</alt>O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>2mM</td></tr><tr><td>NaHCO<alt>3</alt></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>26mM</td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>10mM</td></tr><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0278</td><td>2.0mM</td></tr><tr><td>Adenozin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4036</td><td>0.075mM</td></tr><tr><td colspan="4">Şişe üstü filtreli filtre ve 4 santigrat derecede saklayın, kullanmadan önce %95 O2 %5 CO2 ile oksijenlendirin</td></tr><td colspan="4">Diğer Reaktifler ve Malzemeler4-hidroksi tamoksifen (4OHT)Sigma-Aldrich H7904 <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>100nM</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>EM Bilimleri</td><td>19200</td>% <td>4</td></tr> <tr><td>L-Lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-6027</td><td>0.1M</td></tr><tr><td>Sodyum Metaperiodat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-1878</td><td>0.01M</td></tr><tr><td>Tavşan anti NG2 antikoru</td><td>Chemicon (Millipore)</td> <td>AB5320</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Fare anti CC1 antikoru</td><td>Calbiochem (Millipore)</td> <td>OP80</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Fare anti Ki67 antikoru</td><td>Vision Biosystems</td><td>NCL-Ki67-MM1</td><td>1:300</td></tr><tr><td>Fare anti NeuN antikoru</td><td>Chemicon (Millipore)</td><td>MAB377</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Türe özgü ikincil antikorlar</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu (NGS)</td><td></td><td></td><td>%5</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td>%0.10</td></tr> <tr><td>Montaj ortamı DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Millicell kültür membranı ile 0.45&mu ekler; m gözenek boyutu</td><td>Fisher Scientific</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Şişe üstü filtreler</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>%95 O2 %5 CO2 gaz karışımı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril altı kuyulu plakalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon (hipokampal) veya tartma spatulaları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manuel veya otomatik doku doğrayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tıraş bıçakları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık transfer pipetleri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm ve 60 mm steril Petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters Fazlı Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminer Akış Başlığı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doku Kültürü İnkübatörü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters Floresan Mikrokop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotipik dilim kültürler oligodendrosit dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 ifade eden hücreler (polydendrocytes oligodendrosit öncü hücreleri), merkezi sinir sisteminde, dördüncü bir glial hücre içerisinde yer alırlar. Embriyonik ve postnatal gelişim sırasında aktif çoğalırlar ve Myelinating oligodendrositleri oluşturmak. Bu hücreler sık ​​primer ayrışmış kültürler, nöron cocultures okudu ve sabit dokuda edilmiştir. Kullanımı uygun yeni transgenik fare soyları kültür sistemleri ön beyin ve beyincik hem gri ve beyaz madde bölgelerde oligodendrosit soy hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması araştırmak için kullanılabilir dilim. Dilim kültürleri erken doğum sonrası farelerde hazırlanan ve 1 aya kadar kültür içinde tutulur. Bu dilimler hücresel davranış ve etkileşimleri araştırmak için kültür dönemi boyunca birden fazla kez görüntülenmiş olabilir. Bu yöntem NG2 hücre bölünmesi görselleştirme ve ayrıntılı analizini sağlarken olgodendrosit farklılaşma giden adımlar bölgede-bağlıdır veriyorent NG2 hücre ve olgodendrosit fonksiyonel heterojenite. Bu ise, in vivo olarak bulunan andıran bir hücresel ortamda zaman bu hücreleri etkileyen iç ve dış sinyalleri araştırmak için kullanılan bir güçlü bir tekniktir.

Örnek veri örnekleri aşağıda verilmektedir P8 NG2cre bir ön beyin ve beyincik hem de dilim kültürleri kullanılarak elde edilmiştir ki: zeg, NG2creER: YFP ve transgenik fare hatları PLPDsRed. NG2 hücreleri ön beyin ve beyincik dilimleri (Şekil 1B-D, video 1) ve bu hücrelerin fenotip gün boyunca görüntülü olabilir tespit edilerek ve NG2 ve CC1 antikorları (Şekil 1E) ile immünboyama edilebilir. Canlı görüntülemeye ek olarak, hücre çoğalması aynı zamanda Ki67 (Şekil 1F) gib...

Ön beyin ve beyincik dilim kültür sistemini kullanarak NG2 hücrelerini ve oligodendrositleri incelemek için bir teknik açıklanmıştır. Bu yöntem, doku sitomimarisini korurken hücre dışı ortamın kolayca manipüle edilebildiği oligodendrosit soyu içindeki hücrelerin çoğalma ve farklılaşma dinamiklerinin incelenmesine izin verir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Bu prosedürün genel amacı, in vivo olarak bulunanlara çok benzeyen bir ortamda oligodendrosit soy hücrelerinin çoğalmasını ve farklılaşmasını araştırmaktır. Bu, ilk olarak erken doğum sonrası transgenik farelerden dört beyin ve beyincik dilim kültürlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Dilimlerdeki tek hücreler daha sonra çoğalmalarının ve farklılaşmalarının hücresel dinamiklerini görselleştirmek için saatler ila günler boyunca görüntülenir.Görüntülemeden sonra, hücrelerin post hoc immünohistokimyası çeşitli hücresel özellikleri belirlemek için kullanılır. Sonuç olarak, sonuçlar normal koşullar altında ve farmakolojik veya genetik manipülasyondan sonra hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının dinamiklerini gösterebilir. Bu tekniğin ayrışmış kömür, nöron kültürleri ve liga incyte soy hücreleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, dilim kültürlerin doku sito mimarisini korurken aselüler ortamın manipülasyonuna izin vermesidir.Tüm hayvan prosedürleri yönergeleri takip etmektedir ve diseksiyondan en az iki saat önce Connecticut Üniversitesi'ndeki kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Doku kültürü eklerini her birine altı kuyucuklu plaka halinde hazırlayın. Bir mililitre dilim kültür ortamı ekleyin, ardından plakaları diseksiyondan en az 15 dakika önce% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede hücre kültürü inkübatörüne aktarın.Diseksiyon tamponunu buzun üzerine koyun ve %95 oksijen, %5 karbondioksit gazı ile köpürtmeye başlayın. Ayrıca tüm aletlerin ve doku doğrayıcının %70 etanol ile sterilize edildiğinden emin olun. Dokuyu buz gibi soğuk oksijenli diseksiyon tamponu içeren 35 milimetrelik steril bir tabağa aktarın.Daha sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak, beyincik ve ön beyni kesin, ardından ön beyin ve beyincik boyunca yarım küreleri ayıran sagital bir kesi ile takip edin. Şimdi manuel doğrayıcıyı kullanarak, dört beyincik ve beyinciğin 300 mikron kalınlığında koronal ve sagital bölümlerini yapın. Her hayvan genellikle altı adet dört brainin dilimi ve altı beyincik dilimi verir.İdeal olarak, aynı dilimde hem gri hem de beyaz madde bölgelerini incelemek için korpus kallozumun ön üçte birini kapsayan dilimler alır. Ayrılan dilimleri, küçük bir diseksiyon veya tartma spatulası kullanarak tampondaki buz üzerinde taze kabarcıklı soğuk diseksiyon tamponuna aktarın. Tek tek bölümleri ayırın ve önceden inkübe edilmiş olarak aktarın.Kültür ekleri içeren altı kuyu yemeği. Bir kültüre iki ila üç dilim yerleştirilebilir. Pipeti kültürün yüzeyindeki fazla diseksiyon tamponundan çıkarın.Plakaları sabitlenene kadar inkübatöre yerleştirin ve aktarın. Dilim ortamı, dilim hazırlandıktan bir gün sonra ve daha sonra protokolde belirtildiği gibi dilim fiksasyonuna kadar her gün değiştirilmelidir. Deneye bağlı olarak, dilimleri beş ila yedi gün sonra kullanın.Kültürde. Yalnızca ilk birkaç günden sonra saydam hale gelen dilimleri kullanın ve çıplak gözle görülebilen düzensiz opak bölgelere sahip olanları atın. Yüz kontrastı altında, bu opak bölgeler bir karanlık hücre yığını olarak görünür.Doğru yapılırsa, ölü opak bölgeler dilimlerin en fazla% bir ila 5'inde meydana gelir. NG iki hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirmek için, NG iki hücrede EGFP'yi eksprese eden farelerden üç ila beş günlük dilimler kullanın. Slaytların 15 dakikadan fazla 37 santigrat derecenin altına düşmesine izin vermeyin.Görüntüleme seansı başına, plakayı kapalı tutarak, görüntüleri ilk kez yakalamak için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun 10 x objektifini kullanın. Kültürün noktası. Dilimin hem gri hem de beyaz madde alanlarından her dilimde dört ila sekiz konum görüntüleyin.Ayrıca, yer değiştirme amacıyla dilimlerin kenarları, belirli hücreler veya beyaz madde yollarının yönü gibi yararlı yer işaretlerini görüntüleyin. Önceki zaman noktası görüntüsü, NG iki hücre bölünmesi ve oligodendrosit farklılaşması için yer değiştirme sırasında bir referans görüntü olarak kullanılabilir. İdeal olarak beş ila yedi gün boyunca her dört ila altı saatte bir görüntü yakalayın.İndüklenebilir işaretleyici NG iki cre, ER YFP kullanılıyorsa, 100 nano molar ile kültür ortamı kullanarak raportör ifadesini indükleyin. Etanol raportör aktivitesinde çözünen dört hidroksi tamoksifen bir ila iki gün içinde ortaya çıkmalıdır. Fiksasyon için, kültürün dibine bir mililitre fiksatif ekleyin.Dilimlerin üzerine bir mililitre daha yerleştirin ve ekleyin. Sabitleyiciyi doğrudan dilimlerin üzerine sıkmayın, aksi takdirde ayrılabilirler. Dokuyu dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sabitleyin ve ardından bir neşter kullanın.Zarları dilimler takılı olarak kesin. Cımbız kullanarak, dilimleri PBS ile yüklenmiş 24 oyuklu bir plakanın tek tek kuyucuklarına dikkatlice aktarın. Daha sonra, dilimleri PBS'de% 5 normal keçi serumu ve% 0.1 tritton X 100 içeren bloke edici çözelti ile yüklenmiş ikinci bir 24 oyuklu plakaya aktarın.Engelleme çözeltisinde oda sıcaklığında bir saat inkübe etmelerine izin verin. Bloke edildikten sonra, dilimleri %5 NGS ile PBS'de primer antikor yüklü bir plakaya taşıyın. Ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatmalarına izin verin.Dilimleri PBS'de yıkayın. Daha sonra dilimleri% 5 NGS ile PBS'de ikincil antikorlarla inkübe edin. Kuluçka makinesinin oda sıcaklığında bir saat bekletilmesine izin verin.Bunu, daha önce olduğu gibi PBS'de üç yıkama daha ile takip edin ve dilimleri, objektif ile doku arasında olmayacak şekilde zar slayta bakacak şekilde monte edin. Oligodendrosit farklılaşmasının zamansal dinamiklerini analiz etmek için, NG iki hücre bölünmesinin görüntüleri, birkaç gün boyunca P sekiz NG iki sürüngen transgenik fareden ön beynin dilim kültürlerinden elde edildi, 122 saat boyunca hızlandırılmış diziler alındı. Bölünen hücrelerin fenotipi NG iki ve CC bir antikorları ile belirlendi.Hücre proliferasyonu, hücre proliferasyon belirteci için immünohistokimyasal boyama kullanılarak da değerlendirildi. NG iki hücrenin KI 67 yem haritalaması, NG iki CRE YFP faresinden alınan dilimlerde CRE rekombinasyonunun indüksiyonundan sonra gerçekleştirildi. Dört hidroksi tamoksifen ekledikten iki gün sonra.NG eksprese eden YFP muhabiri kültürlerde iki pozitif hücre bulundu. Dört gün sonra, bu hücrelerin bir kısmı CC bir pozitif oligodendrosit sitlerine farklılaştı. Olgun oligodendrositler, P-L-P-D-S'den serebellum dilim kültürlerinde görüntülendi.Bu kültürlerde kırmızı fareler, miyelinli Perkin nöronları mevcuttu. Tekrarlanan görüntüleme, bu dilimlerde oligodendrositleri immünohisto kimyasını eksprese eden miyelinizan DS kırmızısının eklendiğini gösterdi ve miyelin bazik proteininin önemli ölçüde ekspresyonunu gösterdi. Son olarak, daha yüksek temporal çözünürlüklü görüntüleme, distal süreçlerde bazı küçük hareketlerle stabil oligodendrosit hücre gövdelerini ortaya çıkardı.Bu videoyu izledikten sonra, hem dört beyinden hem de beyincikten dilim kültürlerinin nasıl hazırlanacağını, tek hücrelerin günler ila saatler boyunca tekrar tekrar nasıl görüntüleneceğini ve post ho immünohistokimya kullanarak görüntü hücrelerinin kaderini nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Görüntülemeye ek olarak, bu dilimler, hazırlanmış bir dilimde indüklenebilir krema rekombinasyonu gibi kader haritalama tekniklerini kullanırken hücresel ortamın manipülasyonuna da izin verir.

organotypic-slice-cultures-to-study-oligodendrocyte-dynamics

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu piramidal nöronların elektriksel kayıtlar yapma amaçlı bir Organotipik kültür neokortikal dilim hazırlama hazırlamak ve sürdürmek için bir protokoldür.

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

Bu video, sitotoksik CD8+ T hücrelerinin aracılık ettiği beyin hücresi ölümünü indüklemek için ex vivo bir tekniği göstermektedir. Beyin dilimleri elde edildikten sonra, aktive edilmiş oligodendrosit yönelimli CD8 + T hücreleri, miyelin kılıfını ve oligodendrositleri hedeflemek için dilimlere aktarılır. İnkübasyon sonrası, miyelin hasarı ve nöronal ölüm, ilgilenilen bölgelerde histolojik olarak değerlendirilebilir.

Oligodendrosit Spesifik CD8 + T Hücreleri Yoluyla Nöronal Ölümü İndüklemek için Ex Vivo Bir Teknik

Kaynak: Kennedy, L. H., et. al. Organotipik Beyin Dilimlerinde Oligodendrosit Organellerinin Adeno İlişkili Virüs ve Konfokal Mikroskopi Kullanılarak Görselleştirilmesi ve Canlı Görüntülenmesi. J. Vis. Uzm. (2017)Bu video, organotipik fare beyin dilimlerinde oligodendrosit mitokondrinin görüntülenmesini göstermektedir. Dilim, sürekli sıvı sirkülasyonu ve kontrollü sıcaklığa sahip bir banyo odasının içine yerleştirilir. Konfokal mikroskobun çeşitli parametrelerini ayarladıktan sonra, kırmızı...

Organotipik Beyin Dilimi Kültürlerinde Oligodendrositler İçindeki Mitokondriyal Hareketin Konfokal Görüntülenmesi

İnflamatuar demiyelinizan bozuklukların kortikal lezyonlarında demiyelinizasyon ve nöronal apoptoz mekanizmalarını ele almak için farklı hayvan modelleri kullanılır. Biz burada, beyin dilimlerinde oligodendrosit spesifik CD8 + T hücreleri kullanarak, oligodendroglial ve nöronal ölümle sonuçlanan ex vivo bir yaklaşımı tanımladık. Modelin potansiyel uygulamaları ve sınırlılıkları tartışılmıştır.

Bir Ex vivo Akut Beyin Dilimleri bir Oligodendrosit yönelik T-Hücre Saldırı Modeli

Burada organotipik dilim kültür tekniği kullanılarak hipokampal doğum sonrası nöron incelemek için bir teknik tarif. Bu yöntem, yetişkin nöron in vitro müdahale edilebilmesini sağlar ve kültürlenmiş hipokampus farmakolojik maddelerin doğrudan uygulama için izin verir.

POSTNATAL nöron Çalışmaları için organotipik Dilim Kültürler

Organotypic Hipokampal dilim kültürler (OHSC) vivo durumu çok iyi taklit bir vitro modeli temsil. Burada biz vibratome tabanlı açıklar yüksek kaliteli dilimleri tümör hücreleri biyolojik davranışını veya yeni maddeler nöroprotektif potansiyelini değerlendirmek amacıyla elde etmek için iletişim kuralı Dilimleme geliştirilmiş.

Organotypic Hipokampal dilim kültürler çalışma Neuroprotection ve tümör hücrelerinin Invasiveness Model olarak

Myelinating oligodendrocytes hızlı aksiyon potansiyeli yayılması ve nöronal hayatta kalma teşvik. Burada açıklanan bir oligodendrocyte özel mesaj organotypic floresan proteinlerin beyin dilimleri ile sonraki zaman hata görüntüleme iletişim kuralıdır. Ayrıca, günahı miyelin görüntülenmesi için basit bir prosedür sunulur.

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Bir ex vivo dilim tahlil gerçek zamanlı olarak görüntülenmiş olmak okülomotor sinir büyüme sağlar. Dilim E 10.5 ISLMN katıştırarak oluşturulur: agarose 'de Gfp embriyolar, bir vibratom üzerinde dilimleme, ve bir aşama-üst kuluçç büyüyen. Axon rehberlik yollarının rolü, kültür ortamına inhibitörler ekleyerek değerlendirilir.

Olomotor sinir gelişimi için zaman aşımı görüntüleme için embriyonik GFP-Ifade fareler dan ex vivo okülomotor dilim kültürü

Burada, oligodendrositlerin saflaştırılması ve ortak kültür deneyleri için kullanılabilecek oligodendrosit şartlı ortamın üretimi için etkili bir yöntem gösteriyoruz.

Oligodendrocytes ve Oligodendrocyte-Ko-Kültür Deneyleri için Şartlı Orta Üretimi

Öğrenin oligodendrosit soya hücrelerinin proliferasyon ve diferansiyasyonunu in vivo benzeri koşullarda incelemek için. Fare beyni ve serebellum organotipik dilim kültürleri kullanılarak hücre dinamikleri görüntülenir.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Daha fazla video keşfet