Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

Bu prosedürün genel amacı, in vivo olarak bulunanlara çok benzeyen bir ortamda oligodendrosit soy hücrelerinin çoğalmasını ve farklılaşmasını araştırmaktır. Bu, ilk olarak erken doğum sonrası transgenik farelerden dört beyin ve beyincik dilim kültürlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Dilimlerdeki tek hücreler daha sonra çoğalmalarının ve farklılaşmalarının hücresel dinamiklerini görselleştirmek için saatler ila günler boyunca görüntülenir.

Görüntülemeden sonra, hücrelerin post hoc immünohistokimyası çeşitli hücresel özellikleri belirlemek için kullanılır. Sonuç olarak, sonuçlar normal koşullar altında ve farmakolojik veya genetik manipülasyondan sonra hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının dinamiklerini gösterebilir. Bu tekniğin ayrışmış kömür, nöron kültürleri ve liga incyte soy hücreleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, dilim kültürlerin doku sito mimarisini korurken aselüler ortamın manipülasyonuna izin vermesidir.

Tüm hayvan prosedürleri yönergeleri takip etmektedir ve diseksiyondan en az iki saat önce Connecticut Üniversitesi'ndeki kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Doku kültürü eklerini her birine altı kuyucuklu plaka halinde hazırlayın. Bir mililitre dilim kültür ortamı ekleyin, ardından plakaları diseksiyondan en az 15 dakika önce% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede hücre kültürü inkübatörüne aktarın.

Diseksiyon tamponunu buzun üzerine koyun ve %95 oksijen, %5 karbondioksit gazı ile köpürtmeye başlayın. Ayrıca tüm aletlerin ve doku doğrayıcının %70 etanol ile sterilize edildiğinden emin olun. Dokuyu buz gibi soğuk oksijenli diseksiyon tamponu içeren 35 milimetrelik steril bir tabağa aktarın.

Daha sonra, bir tıraş bıçağı kullanarak, beyincik ve ön beyni kesin, ardından ön beyin ve beyincik boyunca yarım küreleri ayıran sagital bir kesi ile takip edin. Şimdi manuel doğrayıcıyı kullanarak, dört beyincik ve beyinciğin 300 mikron kalınlığında koronal ve sagital bölümlerini yapın. Her hayvan genellikle altı adet dört brainin dilimi ve altı beyincik dilimi verir.

İdeal olarak, aynı dilimde hem gri hem de beyaz madde bölgelerini incelemek için korpus kallozumun ön üçte birini kapsayan dilimler alır. Ayrılan dilimleri, küçük bir diseksiyon veya tartma spatulası kullanarak tampondaki buz üzerinde taze kabarcıklı soğuk diseksiyon tamponuna aktarın. Tek tek bölümleri ayırın ve önceden inkübe edilmiş olarak aktarın.

Kültür ekleri içeren altı kuyu yemeği. Bir kültüre iki ila üç dilim yerleştirilebilir. Pipeti kültürün yüzeyindeki fazla diseksiyon tamponundan çıkarın.

Plakaları sabitlenene kadar inkübatöre yerleştirin ve aktarın. Dilim ortamı, dilim hazırlandıktan bir gün sonra ve daha sonra protokolde belirtildiği gibi dilim fiksasyonuna kadar her gün değiştirilmelidir. Deneye bağlı olarak, dilimleri beş ila yedi gün sonra kullanın.

Kültürde. Yalnızca ilk birkaç günden sonra saydam hale gelen dilimleri kullanın ve çıplak gözle görülebilen düzensiz opak bölgelere sahip olanları atın. Yüz kontrastı altında, bu opak bölgeler bir karanlık hücre yığını olarak görünür.

Doğru yapılırsa, ölü opak bölgeler dilimlerin en fazla% bir ila 5'inde meydana gelir. NG iki hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının hızlandırılmış görüntülemesini gerçekleştirmek için, NG iki hücrede EGFP'yi eksprese eden farelerden üç ila beş günlük dilimler kullanın. Slaytların 15 dakikadan fazla 37 santigrat derecenin altına düşmesine izin vermeyin.

Görüntüleme seansı başına, plakayı kapalı tutarak, görüntüleri ilk kez yakalamak için ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun 10 x objektifini kullanın. Kültürün noktası. Dilimin hem gri hem de beyaz madde alanlarından her dilimde dört ila sekiz konum görüntüleyin.

Ayrıca, yer değiştirme amacıyla dilimlerin kenarları, belirli hücreler veya beyaz madde yollarının yönü gibi yararlı yer işaretlerini görüntüleyin. Önceki zaman noktası görüntüsü, NG iki hücre bölünmesi ve oligodendrosit farklılaşması için yer değiştirme sırasında bir referans görüntü olarak kullanılabilir. İdeal olarak beş ila yedi gün boyunca her dört ila altı saatte bir görüntü yakalayın.

İndüklenebilir işaretleyici NG iki cre, ER YFP kullanılıyorsa, 100 nano molar ile kültür ortamı kullanarak raportör ifadesini indükleyin. Etanol raportör aktivitesinde çözünen dört hidroksi tamoksifen bir ila iki gün içinde ortaya çıkmalıdır. Fiksasyon için, kültürün dibine bir mililitre fiksatif ekleyin.

Dilimlerin üzerine bir mililitre daha yerleştirin ve ekleyin. Sabitleyiciyi doğrudan dilimlerin üzerine sıkmayın, aksi takdirde ayrılabilirler. Dokuyu dört santigrat derecede 30 dakika boyunca sabitleyin ve ardından bir neşter kullanın.

Zarları dilimler takılı olarak kesin. Cımbız kullanarak, dilimleri PBS ile yüklenmiş 24 oyuklu bir plakanın tek tek kuyucuklarına dikkatlice aktarın. Daha sonra, dilimleri PBS'de% 5 normal keçi serumu ve% 0.1 tritton X 100 içeren bloke edici çözelti ile yüklenmiş ikinci bir 24 oyuklu plakaya aktarın.

Engelleme çözeltisinde oda sıcaklığında bir saat inkübe etmelerine izin verin. Bloke edildikten sonra, dilimleri %5 NGS ile PBS'de primer antikor yüklü bir plakaya taşıyın. Ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatmalarına izin verin.

Dilimleri PBS'de yıkayın. Daha sonra dilimleri% 5 NGS ile PBS'de ikincil antikorlarla inkübe edin. Kuluçka makinesinin oda sıcaklığında bir saat bekletilmesine izin verin.

Bunu, daha önce olduğu gibi PBS'de üç yıkama daha ile takip edin ve dilimleri, objektif ile doku arasında olmayacak şekilde zar slayta bakacak şekilde monte edin. Oligodendrosit farklılaşmasının zamansal dinamiklerini analiz etmek için, NG iki hücre bölünmesinin görüntüleri, birkaç gün boyunca P sekiz NG iki sürüngen transgenik fareden ön beynin dilim kültürlerinden elde edildi, 122 saat boyunca hızlandırılmış diziler alındı. Bölünen hücrelerin fenotipi NG iki ve CC bir antikorları ile belirlendi.

Hücre proliferasyonu, hücre proliferasyon belirteci için immünohistokimyasal boyama kullanılarak da değerlendirildi. NG iki hücrenin KI 67 yem haritalaması, NG iki CRE YFP faresinden alınan dilimlerde CRE rekombinasyonunun indüksiyonundan sonra gerçekleştirildi. Dört hidroksi tamoksifen ekledikten iki gün sonra.

NG eksprese eden YFP muhabiri kültürlerde iki pozitif hücre bulundu. Dört gün sonra, bu hücrelerin bir kısmı CC bir pozitif oligodendrosit sitlerine farklılaştı. Olgun oligodendrositler, P-L-P-D-S'den serebellum dilim kültürlerinde görüntülendi.

Bu kültürlerde kırmızı fareler, miyelinli Perkin nöronları mevcuttu. Tekrarlanan görüntüleme, bu dilimlerde oligodendrositleri immünohisto kimyasını eksprese eden miyelinizan DS kırmızısının eklendiğini gösterdi ve miyelin bazik proteininin önemli ölçüde ekspresyonunu gösterdi. Son olarak, daha yüksek temporal çözünürlüklü görüntüleme, distal süreçlerde bazı küçük hareketlerle stabil oligodendrosit hücre gövdelerini ortaya çıkardı.

Bu videoyu izledikten sonra, hem dört beyinden hem de beyincikten dilim kültürlerinin nasıl hazırlanacağını, tek hücrelerin günler ila saatler boyunca tekrar tekrar nasıl görüntüleneceğini ve post ho immünohistokimya kullanarak görüntü hücrelerinin kaderini nasıl analiz edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Görüntülemeye ek olarak, bu dilimler, hazırlanmış bir dilimde indüklenebilir krema rekombinasyonu gibi kader haritalama tekniklerini kullanırken hücresel ortamın manipülasyonuna da izin verir.