Kütle spektrometresi ile In-jel Geliştirilmiş İndirgemeli β-Eleme Kapsamlı O-bağlı ve için Sulfo-Glikomik

Bu prosedürün genel amacı, Olink Glikanları hasat etmektir. Bu, önce glikoproteinlerin SDS sayfası ile çözülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, ilgilenilen glikoproteini içeren jel parçalarını yıkamaktır.

Daha sonra, olink glikanları indirgeyici beta eliminasyonu ile salınır. Son adım, faz bölmeli metilasyon başına glikandır. Sonuç olarak, perma metillenmiş glikanlar, yapıları tespit etmek ve bollukları ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile analiz edilir.

Bu tekniğin yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, yöntemimizin metillenmiş glikanlar başına nötr ve yüklü olanları hızlı bir faz bölünmesinde ayırmasıdır. Bu yöntem, çözülmüş glikoproteinlerden salınan glikanların kapsamlı karakterizasyonuna veya bağlı glikanlara izin vererek gliko bilimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamadan önce, jel elektroforezi kullanarak glikoproteinleri çözün.

Elektroforezden sonra, jeli bir cam plaka üzerine yerleştirin ve OG glikanlarının verimini artırmak için temiz bir neşter kullanarak ilgilenilen bölgeyi çıkarın. İlgilendiğiniz jel bandını başka bir cam plakaya aktarın ve parçayı yaklaşık iki milimetre küp halinde kesin. Küçük jel parçalarını paslanmaz çelik bir mikro spatula ile 13 x 100 milimetrelik vidalı cam tüpe aktarın.

Ardından, numune tüpüne bir mililitre 25 milimolar amonyum bikarbonat veya ambi ekleyin. Tüpü bir Teflon hat vidalı üst kapakla kapattıktan sonra, 10 dakika bekletmeden önce tüpü hafifçe vurarak içindekileri hafifçe karıştırın. Ardından ambit'i cam tüpten dikkatlice çıkarın.

Bir mera veya cam pipet kullanarak, jel parçalarını tamamen kaplamak için cam tüpe bir mililitre aseto nitril ekleyin. Tüpü kapattıktan sonra, 10 dakika bekletmeden önce tüpü hafifçe vurarak içindekileri hafifçe karıştırın. Bittiğinde, aseto nitrili cam tüpten çıkarın.

Parlak mavi renk ortadan kalkana kadar önceki adımları tekrarladıktan sonra, iki mililitre etil asetat ekleyin ve tüpü tekrar kapatın. Tüpü gece boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin ve uçtan uca çalkalama yapın. Etil asetat yıkama çıkarıldıktan sonra, iki mililitre deiyonize su ile üç yıkama yapın.

Jel parçaları kuruduktan sonra, 500 mikrolitre 100 milimolar sodyum hidroksit çözeltisi ekleyin. Ve jeli glikan geri kazanımını artıran temel koşullara dengelemek için buz üzerinde üç ila beş dakika bekleyelim. Bunu takiben, 100 milimolar sodyum hidroksit içinde 500 mikrolitre iki molar sodyum boro hidrit ekleyin, bu da 100 milimolar sodyum hidroksit içinde bir molar sodyum boro hidritin nihai konsantrasyonları ile sonuçlanır.

Tüpü nazikçe karıştırdıktan sonra, numuneyi 18 saat boyunca 45 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkanın ilk saatinde, tüpü her 15 dakikada bir yavaşça karıştırın. Beta eliminasyon reaksiyonu tamamlandıktan ve tüp buzun üzerine yerleştirildikten sonra, yavaş yavaş% 10 asetik asit damla damla ekleyin.

Tabanı nötralize etmek için, numune tüpünü asetik asit ilaveleri arasında hafifçe girdaplayın, kabarcıkları ortadan kaldırmak ve gerekirse yayılmayı önlemek için tüpü santrifüjleyin. Küçük bir cam sütun yapmak için, pipet ucunun konikliği yaklaşık bir santimetre uzunluğunda olacak şekilde seramik bir kesici kullanarak bir mera veya cam pipetin ucunu çizin ve kırın. Bir cam yünü tapasını ayırdıktan sonra, reçine yatağı için bir destek oluşturarak uca doğru itin.

Pipet kolonunu bir mandal iğnesi ile sabitleyin ve bir cam test tüpünün üzerine yerleştirin. Daha sonra, cam yünü içeren boş pipeti bir mililitre metanol ve üç mililitre% 5 asetik asit ile yıkayın. Dow X hidrojen katyon değişim reçinesi bulamacını döndürdükten sonra% 5 Asetik asit.

Mera pipet kolonunda bir mililitrelik bir yatak hacmi üretecek kadar aktarın, kolonu% 5 asetik asit kullanarak% beş hacim kullanarak durulayın ve reçine parçacıklarının görünümünü kontrol edin. Kolonu 16 x 125 milimetrelik yeni bir vidalı cam tüpün üzerine yerleştirdikten sonra, numuneyi kolona yükleyin. Akış toplandıktan sonra, en az üç hacim% 5 asetik asit içeren glikanları aynı tüpe boşaltın.

Liyofilizasyonun ardından, kurutulmuş numune tüpüne metanol içinde 300 mikrolitre %10 asetik asit ekleyin. Girdaplamadan sonra, elde edilen trimetil batı 37 santigrat derecede bir nitrojen akışı altında buharlaştırarak çıkarın. Yeniden süspansiyon ve kurutma adımlarını en az dört kez tekrarladıktan sonra, numuneyi %5 asetik asit içinde sulandırın.

Numune dengelenmiş bir C 18 kolonuna yüklendikten sonra, akışı 13 x 100 milimetrelik bir cam vidalı kapaklı tüpe toplayın. OOG glikanlarını üç mililitre% 5 asetik asit ile aynı tüpe boşaltın. Daha sonra, perma metilasyonu için baz reaktifi hazırlamak üzere numuneyi liyofilize edin.

Temiz bir 13 x 100 milimetre cam vidalı tüpe 400 mikrolitre% 50 sodyum hidroksit ekleyin. Daha sonra aynı tüpe 800 mikrolitre susuz metanol ekleyin. Beyaz bir çökelti oluşturmak için dört mililitre susuz dimetil sülf oksit ve girdap ekleyin.

Çökeltiyi peletlemek için numuneyi bir dakika boyunca 600 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan ve pelet girdabına dört mililitre susuz dimetil sülf oksit ekledikten sonra, reaktif Baz bulamaç yarı saydam hale gelene kadar dört kez daha tekrarlayın. Peletlenmiş tabanı üç mililitre susuz dimetil sülf oksit içinde çözün ve temiz bir mera pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın.

Daha sonra, kurutulmuş numuneye 200 mikrolitre susuz dimetil sülf oksit ekleyin ve girdap yapın. Yeniden askıya almak için, numuneye 300 mikrolitre yeniden askıya alınmış baz bulamacı ekleyin ve hemen 100 mikrolitre ITOM metan ekleyin. Tüpü Teflon kaplı bir kapakla kapatın ve girdapla beş dakika

Perma metilasyon reaksiyonunu durdurmak için tüpü buzun üzerine yerleştirin ve iki mililitre% 5 asetik asit ekleyin. Girdaplamadan sonra, buharlaşma yoluyla kalan ITOM metan hacmini azaltmak için çözeltiyi beş kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Bu noktada, girdaplama ve santrifüjlemeyi takiben numuneye iki mililitre di kloro metan ekleyin.

Üst sulu tabakayı 13 x 100 milimetrelik yeni bir cam tüpe aktarın. Di kloro metan tabakasının sulu yıkamasını tekrarladıktan sonra, ikinci sulu fazı birinci sulu tabaka ile birleştirin. Di kloro metan fazının suyla yıkanması iki ila üç kez tekrarlandıktan sonra, di kloro metan fazını temiz bir mera pipeti ile temiz bir cam tüpe aktarın.

Daha sonra organik fazı 42 santigrat derecede bir nitrojen akışı altında kurutun. Bir C 18 kolonunu dengeledikten ve sulu tabakayı üzerine yükledikten sonra. C 18 kolonunu suyla yıkayın ve ardından perma metillenmiş sülfatlanmış o glikanları iki mililitre% 50 Aseton nitril ile yeni bir cam tüpe boşaltın, perma metillenmiş OG glikanlarını doğrudan infüzyonla uygun bir kütle spektrometresine analiz edin, bir nano elektro sprey kaynağı kullanarak bir nano elektro sprey kaynağı kullanarak 210 santigrat derecede dakikada 0.4 ila 0.6 mikrolitre akış hızında.

MSM S'de çarpışma ile parçalanma için kılcal sıcaklık ve bir iyon tuzağı aletinin çok boyutlu MS'si, ingel indirgeyici beta eliminasyonu kullanılarak sığır müsininden salınan perma metillenmiş olink glikan örneklerinin %30 ila 40 çarpışma enerjisi temsili kütle spektrumu uygular, burada üst panelde gösterilmektedir. Spektrumlara, poli akrilamid jelden türetilen bir poli dispers kirletici hakimdir. Alt panel, beta eliminasyonundan önce jel parçalarının etil asetat ile yıkanmasının bu sorunu ortadan kaldırdığını göstermektedir.

Yontulmuş glikanlar, küçük veya büyük dilimlenmiş jel parçaları kullanılarak Ingel indirgeyici beta eliminasyonu ile sığır sub maksiller müsininden salındı. Küçük jel parçalarından oinked glikanların geri kazanımı, büyük jel dilimlerinden neredeyse on kat daha fazlaydı. Nötr perma metillenmiş glikanlar, organik di kloro metan fazında geri kazanılır.

Onik perma metillenmiş glikanlar ise kantitatif olarak su fazına bölünür. Faz bölme yönteminin verimliliği ve basitliği, numune verimini ve müteakip analitik yaklaşımları büyük ölçüde kolaylaştırır. Sülfatlanmamış perma metillenmiş O glikanları organik fazdan geri kazanıldı ve perma metillenmiş sul glikanların tamamı sulu fazdan geri kazanıldı, bu da neredeyse İzobar sülfatlanmış ve sülfatlanmamış glikanların tanımlanmasını ve karakterizasyonunu kolaylaştırdı.

Bu glikanlar sadece 0.1 kütle birimi ile farklılık gösterir ve iki türü faz bölünmesine göre fiziksel olarak ayırmadan çözülmesi zor olacaktır Gelişiminden sonra. Bu teknik, doku örneklerinde, kültürlenmiş hücrelerde, model sistemlerde ve hasta örneklerinde glikan çeşitliliğinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasına izin vermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, gly proteinlerinden salınan tüm bağlantılı glikanları nasıl başarılı bir şekilde avuçlayacağınızı ve böleceğinizi iyi anlamalısınız.

SDS sayfası tarafından çözüldü.