Name: Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin böbrek epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum değişikliklerini sitometri ile ölçme yöntemini. Floresan boya ve tripsinizasyon kullanarak hızlı kalsiyum sinyal analizi yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Laboratuvarlarda araştırma Fritz-Bender Vakfı, Münih, Almanya (TD) ve (W.-KL) Witten / Herdecke iç araştırma bursu bir üniversite tarafından finanse edilmektedir. Biz yararlı önerileri için (Fizyoloji, Patofizyoloji ve Toksikoloji, Witten Üniversitesi / Herdecke için Institute) Prof Dr. Frank Thévenod teşekkür etmek istiyorum.

Reaktifler ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> Değiştirilmiş bir Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlanması (mM olarak: 136,9 NaCl, 5.37 KCI, 0.34 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17 NaHCO 3, pH 7.2, fenol kırmızı). 4 ° C&#39;de muhafaza. </li><li> 1.5 M CaCI2 ve 2 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) (pH 7.2) damıtılmış su kullanılarak stok çözeltileri olun. </li><li> Probenesid, bir 250 mM stok çözelti hazırlayın. , 1 N NaOH içinde probenesid tozu çözmek damıtılmış su ile son hacminin dörtte üçüne kadar doldurun ve yavaşça 1 N HCI ile pH 7.4&#39;e titre edilir, serbest asit şekli için (suda çözünür olarak atfedilen). 4 ° C&#39;de muhafaza. </li><li> 1 mM&#39;lik bir stok konsantrasyona susuz dimetil sülfoksit (DMSO) içinde flüoresan membran geçirgen kalsiyum bağlama boya çözülür. Karanlıkta -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Her deneyden önce taze hazırlanması probenesid içeren HTarafından BSS akı (PHF) tamponu (nihai konsantrasyonda), 1.5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7.2,% 5 fetal sığır serumu, 2 mM probenesid ve 5.55 mM glükoz ile HBSS modifiye birleştirilmesi. 37 ° C de ısıtılır. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Standart kültür ortamı içinde bir 6 yuvalı plaka, 35 mm tabak başına iyi Levha, 2.5 x 10 5 böbrek proksimal tübül hücreleri (WKPT-0293 CL.2) ile yaklaşık% 70 arasında bir akışkanlığa eriştikten 2 gün süre ile büyür. </li></ol> 3. Kalsiyum Boya Yükleme <ol><li> Her bir göze ya da çanak için,% 5 fetal sığır serumu, 4 uM hücreden geçebilen kalsiyum bağlama boya ve 2 mM probenesit içeren 1 ml kültür ortamı karıştırın. </li><li> Her bir 1 ml dolum boya karışımı ile, kültür ortamı yerine ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Flüoresan göstergesi ağartma engellenmesi için alüminyum folyo ile plaka örtün. </li></ol> Ce 4. hazırlanmasıAkış Sitometrinin için lls <ol><li> 37 ° C&#39;ye ısınmaya% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi. </li><li> Aspire kalsiyum yükleme boyası, her kuyudan çözeltisi ve kuyunun duvarı boyunca 1 mi tripsin ekleyin. </li><li> Tüm hücreler müstakil kadar 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1 dakika için 10,000 g&#39;da bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile 1.5 ml tüp ve pelet hücreleri aktarın. </li><li> Dikkatle pelet bozmadan süpernatant aspire. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme 1 ml PHF&#39;ye tampon ve tekrar süspansiyon ekleyerek hücreleri yıkayın. </li><li> 1 dakika için 10,000 g&#39;da santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Tekrarlayın 4.6 adımları. ve 4.7. Bir başka iki kere verilir. </li><li> 500 ul PHF tamponu nihai hacim içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 saat içinde deney için hücreleri kullanır. </li><li> İsteğe bağlı: sayımı hücreleri hücre konsantrasyonunu belirlemek ve 5 x 10 4 kullanımı - ölçüm başına 1 x 10 5 hücre. </li></ol> 5. Akış Cytometer Kur <ol><li> , Sitometresinin akışını başlatmak fluidik çekmeceyi açın ve kılıf sıvısı tankının hava basıncı artırmak için havalandırma valfi geçiş anahtarı çevirmek. </li><li> &quot;Prime&quot; iç boru ve akış yönlendirme odacığı içinde potansiyel oturduğu hava kabarcıklarını çıkarmak için cihaz. </li><li> Akış sitometri yazılımında, açık iki nokta arsa pencereler. <ol><li> Birinci nokta örgüsü, sırasıyla, büyüklüğüne ve boyu yoluyla numune içindeki hücrelerin kalitesi kontrol etmek için Y parametresi için X parametresi ve yan saçılan ışığa (SSC) için saçılan ışık (FSC) gerektirir. </li><li> İkinci nokta arsa kalsiyum bağlanmış boya floresans yoğunluğunu ölçer. Doğrusal bir ölçek üzerinde X parametresi için saniyede bir logaritmik ölçek ve zaman kullanarak Y parametresi için uygun floresan algılama kanalı seçin. </li></ol></li><li> &#39;Yüksek&#39; olarak akış hızını ayarlayın. </li></ol> 6. Akım Sitometri Measurement <ol><li> RT&#39;de ölçümleri yapın. Örnek tüpü (11.5 x 75 mm) sitometri akışı olarak, 480 ul, PHF tampon ekleyin. </li><li> Karıştırmak için 20 ul hücre süspansiyonu ve kısaca vorteks ekleyin. </li><li> Tarafına, boru destek kolunu hareket ve bir sıkı conta oluşana dek örnek enjeksiyon borusu üzerindeki numune tüpü yerleştirin. Orijinal merkezli konumuna boru destek kolunu dönün. </li><li> Numunenin ortalama florasan yoğunluğu yaklaşık 10 2 y-ekseni üzerinde olacak şekilde floresan kanalı ayarlayarak ölçümü optimize. Kaydedin ve daha sonraki deneyler için kullanılacak. </li><li> Bir denemeyi başlatmak için, tekrar 6,1-6,3 adımları. </li><li> 50 sn için rekor taban floresans. </li><li> Kısaca eklemek, ilgi, girdap bileşik örnek tüpü çıkarın ve örnek enjeksiyon tüp dönmek, ölçüm Pause. Bu adım fazla 15 saniye sürmez. </li><li> Ölçüm Devam ve 204,8 saniyelik bir toplam devam etmektedir. </li><li> Bir kalsiyum i kullanınonophore gibi iyonomisin (10 uM), ve etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) gibi bir kalsiyum kenetleme maddesi, MnCl2 ve CoCl2 (2 nM), sırasıyla pozitif ve negatif kontroller için. </li></ol> 7. Veri analizi <ol><li> Böyle WınMDI (Akış Sitometrinin Windows Çoklu Belge Arabirimi), Scripps Enstitüsü&#39;nden, Sitometrisi Çekirdek Tesisi&#39;nde Joe Trotter tarafından geliştirilen ücretsiz bir yazılım paketi olarak çevrimdışı analiz için özel bir akış sitometri yazılımı kullanarak veri, analiz edin. </li><li> SSC ve FSC parametreleri ile bir nokta arsa açın. </li><li> &quot;Bölgeler&quot; aracını kullanarak analiz için hücrelerin bölgeyi seçin ölü hücreleri ya da veri analizi sol alt köşesinde bulunan hücre artıkları (Şekil 1) dışlamak için (resmin üzerine sağ tıklayın). </li><li> Quadrant analizi (Şekil 2) <ol><li> Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve floresan yoğunluğu ile zaman bir yoğunluk arsa açın. Tüm olayları kullanın. </li><li> Bize7.3 olarak aynı yolluk bölgeyi e. </li><li> &quot;Quadrant&quot; aracını kullanarak, verileri niceliğini. </li><li> Dikey çizgi bileşiği, ilave bir zamanda ve yatay çizgi kontrollerde taban floresans ortasına yerleştirilir, böylece kadran ayırıcılar ayarlayın. Kadranda ayırıcılar konumlandırma tüm örneklerde eşit olduğundan emin olun. </li><li> Ayrıca herbir çeyrek içindeki hücrelerin yüzdesi her bir köşesinde (Şekil 2) olarak gösterilir. Örnekler arasındaki sağ üst kadranda (UR) karşılaştırın. </li></ol></li><li> Histogram analizi (Şekil 3) <ol><li> Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve olaylar floresan yoğunluğu olan bir histogram pencerede kontrol verilerini açın. Tüm olayları kullanın. </li><li> Resimsel bir bakış için, bindirme araziler olarak kontrol parseline (Dosya seç → Kaplama → Open File → Dosya gidin) karşılaştırılmak üzere test verileri ekleyin. </li><li> Kantitatif analiz için, tek histogram kazanmakCamlar kullanılmalıdır. Gate adım 7.3 bölgesi R1 kullanarak hücre popülasyonu. </li><li> Muamele edilmemiş kontrolde, azami floresan yoğunluğu olarak ve minimum kontrol pik maksimum floresans ve bitiş kısmı arasındaki orta nokta başlayarak analiz alanı işaretlemek için (&quot;marker&quot;) işareti işlevini kullanın. Bu bölgede hücrelerin yüzdesi hesaplanır. </li><li> Istatistik penceresinden veri almak. Analiz için aynı işaretli alana kullanarak veri dosyalarını geri kalan için tekrarlayın. </li></ol></li><li> Flüoresan yoğunluğu analizi (Şekil 4) <ol><li> Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve floresan yoğunluğu ile zaman, bir nokta arsa açın. Tüm olayları kullanın. </li><li> &quot;Kinetik Modu&quot; ve &quot;Kaplama Kinetik Çizgi&quot; etkinleştirin. Mavi çizgi ortalama floresan yoğunluğu temsil nokta arsa görünecektir. </li><li> Birden fazla dikdörtgen bölgeler oluşturarak bağıl kalsiyum girişini niceliğini. Her bölge aw olmalıdır&quot;10 saniye&quot; eşdeğer &quot;50&quot;, yaklaşık bir likli. 15 dikdörtgen bölgelere kadar tanımlayın. </li><li> Istatistik penceresinden ölçümlerini almak ve bir tablo içine kopyalayın. </li><li> Analizi için y-ortalama veri kullanılır. 20 saniye 50 eşdeğerdir R6, R2 ila ortalamasını hesaplayın. Bu, temel değerdir. </li><li> Kalsiyum akını analizi (başlangıçlı, süresi ve yoğunluğuna bağlıdır) için uygun bir zaman aralığı seçin. </li><li> , Ortalama bazal değer, bu zaman aralığı, göreli içinde% 100 olarak ayarlanmış bileşik ilavesinden önce yani flüoresans sinyali, her bir bölgeden kalsiyum sinyallerini hesaplar. Bileşik ek sonrası ortalama ve bölgelerin standart sapmasını belirlemek; Bu bileşik ile uyarılmış ortalama kalsiyum sinyalidir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+pumps+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger%2C+inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li>
<li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li>
<li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STIM+proteins%3A+dynamic+calcium+signal+transducers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li>
<li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li>
<li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+channels+and+pumps+in+cancer%3A+changes+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li>
<li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+in+the+heart%3A+when+it%27s+good%2C+it%27s+very+very+good%2C+but+when+it%27s+bad%2C+it%27s+horrid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li>
<li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li>
<li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+and+immunopathology+research%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li>
<li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li>
<li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+Ca2%2B+flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li>
<li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133%2B+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+and+development%22%5BJournal%5D)">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li>
<li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Thévenod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1%2F2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li>
<li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li>
<li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benemid%2C%27+p-%28di-n-propylsulfamyl%29-benzoic+acid%3B+its+renal+affinity+and+its+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li>
<li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li>
<li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations%2C+anions+and+zwitterions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+aspects+of+medicine%22%5BJournal%5D)">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li>
<li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+ATP-binding+cassette+%28ABC%29+transporter+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li>
<li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li>
<li>Thévenod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li>
<li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Thévenod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102(2010).</li>
<li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li>
<li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Kalsiyum ikinci mesajcı sinyal molekülü olarak ve aynı zamanda, ER ve mitokondri arasında iletişim kurmak için bir araç olarak hareket eden bir çok hücresel süreçlerde önemli bir olaydır. Ücretsiz Sitozolik kalsiyum konsantrasyonları değişiklikleri ölçmek için yeteneği hücre biyolojisi tüm alanlarında uygulayabileceğiniz yararlı bir tekniktir. Sitozolik kalsiyum sinyalleri algılamak için çeşitli yöntemler vardır. Klasik olarak, bu tür Fura-2 gibi, bir oran ölçer kalsiyum göstergesi, gelen sinyaller, bir flüoresan görünt...

Kalsiyum hücre fizyolojik ve patofizyolojik sinyallerinin 1 aktarılmasından sorumlu önemli bir ikincil habercidir. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonları kalsiyum pompaları ve kalsiyum değiştirgeçlerinin aktivite yoluyla düşük tutulur. Sarkoplazmik / endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz&#39;ın (SERCA) ATP&#39;ye bağımlı şekillerde hem de plazma membran kalsiyum ATPaz&#39;ın (PMCA) Hücre dışı bölüme kalsiyum ekstrüde ise &quot;pompa kaçak&quot; sisteminin bir parçası olarak endoplazmik retikulum (ER), kalsiyum deposunu doldurabilir 2. Gibi hormonlar veya sinir taşıyıcıları gibi fizyolojik haberciler, G-proteini ile bağlanmış reseptörler, diasilgliserol ve inositol trifosfat (IP3) 3 oluşturmak için, plazma membranında, fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) hidrolize eden, fosfolipaz C aktivasyonu yoluyla iletir. Diaçilgliserol plazma membranında kalırken, IP3 sitozol içine girer ve IP3 reseptörüne bağlananER membran ve kalsiyum bulunan bağ kalsiyum kanallarını aktive S (IP3Rs), sitozolik kalsiyum konsantrasyonları 4 bir artışa sonuçlanan ER lümen deposundan salınır. Sitoplazmada ulaşmak için kalsiyum için alternatif bir yol, plazma membranında bulunan kalsiyum kanallarda ve değiştiricilerde geçer. Bu iki bölme arasındaki çapraz karışma tarif edilmiştir: kalsiyum kaynaklı kalsiyum dışı kalsiyum ER depolar 5 kalsiyum serbest kalmasına sebep olur salım (YÜÇAM) ve depolamak stimülasyonu tarafından algılanan ER mağaza boşaltılmasından kalsiyum girişini (Soce) çalıştırılabilir ve Orai açılmasına neden olur plazma membranında kalsiyum kanalları ER mağaza 6 yeniden dolmasını teşvik etmek. Patofizyolojik koşullar altında, hücresel kalsiyum tepki de fizyolojik uyarıyıcıya 1 yokluğunda serbest ve sitosolik kalsiyum artar. Kalsiyum yanıtı çeşitli yollarla etkilenebilir: kalsiyum uzun sürelisinyali, sitosolden kalsiyum çıkarılmasını, kalsiyum mağazalarda veya kalsiyum lokalize değişikliklerin tükenmesi erteledi. Ayrıca, mitokondri tamponlama merkezi bir rol almak ve kalsiyum 7 serbest. Uzun süreli ve / veya supramaksimal sitosolik kalsiyum artışı hücre ölümüne sebep olur. Aslında, kalsiyum daha çok hücresel patofizyolojik yanıtta ve bu tür daha çok hücre ölümü ile ilişkili nörodejeneratif hastalık, kalp hastalığı, kanser, kemik hastalığı ve böbrek hastalığı gibi hastalıklar, geniş bir dizi önemli bir olay değildir daha kayıp veya organ veya doku işlevinin 8-10 değiştirilmesi ve. Üstelik, kalsiyum sinyallerinin pertürbasyon hücre uyarlanması ve hücresel işlevleri ve yanıtları değişikliklere bağlanmıştır. Geleneksel olarak, kalsiyum sinyalleri hücre geçirgen asetoksimetil (AM) bir ester formunda hücrelere yüklenen bir negatif yüklü bir fluoresan kalsiyum göstergesi ile ölçülür. Bir kez hücre esteras parçalanabilenES floresan göstergeler hücre bölmesi içinde kalır ve kalsiyum bağlı olduğunda, flüoresans yoğunluğunda artış. En iyi bilinen ve kullanılan kalsiyum göstergesi rasyometrik Fura-2 Roger Tsien ve arkadaşları 11 tarafından geliştirilen. Kalsiyum için farklı afinitelerle kalsiyum göstergeleri farklı kalsiyum havuzları izlenmesine olanak tanır. Tespit yöntemleri, canlı hücre görüntüleme, floresan mikroplaka okuyucu içerir ve akış sitometresi. (Genellikle birkaç dakika için birkaç saniye içinde) kalsiyum sinyallerinin görece hızlı kinetik kalsiyum sinyalinin özellikleri hakkında en çok bilgi kazanmak için en iyi yöntem görüntüleme canlı hücre yapar. Kenara (milisaniye içinde) kalsiyum sinyallerin hızlı kinetik, canlı hücre görüntüleme tek bir hücrenin 12 içinde kalsiyum sinyal hücresel compartmentalization çalışmak için iyi bir yöntemdir. Mutlak kalsiyum konsantrasyonları kalsiyum ind minimum ve maksimum floresans belirlenmesi ile hesaplanabilirGrynkievvicz et al. 11 tarafından tarif edildiği gibi, sırasıyla, bir kalsiyum tutucusunun eklenmesi ve hücrelerin geçirimli ile icator. Kalsiyum sinyallerinin ölçülmesi için akış sitometrisi kullanımı, ilk olarak bir fırsat zar bütünlüğü ve hücre grubunun ayrılması ve tek bir dalga boyu gelişimi ile birlikte süspansiyon içinde hücrelerin gereği olarak, birden çok parametre ölçmek için burada immünolojik hücrelerde 1980&#39;li yıllarda geliştirilen kalsiyum göstergeler bir ideal ve convenientdetection yöntemle 13-15 flow sitometri yaptı. Yapışık hücrelere, canlı hücre görüntüleme kalsiyum sinyalizasyonu, en önemlisi kinetiği hakkında en çok bilgi sağlar, ancak elde etmek için bir sıcaklık gibi bir floresan mikroskop, bir perfüzyon sistemi, hücresel çevre bakımı, oluşan karmaşık kurulum ve özel mikroskop yazılım gerektirir ve verileri analiz. Bu tür bir floresan mikroplaka okuyucu ya da Pharmacol gibi seçenek yöntemlerKalsiyum kenetleme maddelerinin kullanımı yoluyla ogical araçları elde edilen bilgilerin açısından eşsiz. Akış sitometrisi, daha yaygın olarak, çalışmaların çoğunda olsa da, ölçümler yapılmıştır sadece son-nokta yapışık hücreler sitosolik kalsiyum izlemek için kullanılabilir hale gelmektedir. Başlangıçta Gergely ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntem kullanılarak. Imünolojik B hücreleri 16, gerçek zamanlı kinetiği olan akış sitometrisi ve bir numune bir gruptan hücrelerinde floresan yoğunluğunun izlenmesi ile sitosolik serbest kalsiyum konsantrasyonunda değişiklikler başarıyla kanser epitelyal hücrelerinde ölçülmüştür ve kanser kök hücresi 17 melezler. Bu yöntem, bundan başka, kalsiyum göstergeleri 18, yükleme zordur yapışık epitel hücrelerinde, kullanım için adapte edilmiştir. Burada, sıçan böbrek proksimal tübül (WKPT-0293 CL.2) 19 S1 kısmında elde edilen ölümsüzleştirilmiş yapışkan epitel hücre soyunu kullanarak, biz, optimize edilmiş bir basitleştirilmiş m açıklamakAkış sitometrisi ile sitosolik kalsiyum konsantrasyonundaki ^ değişikliklerin ölçülmesi için METOT. Birçok epitel hücreleri anyonik bileşikler için organik taşıyıcıların bir dizi sahip olduğu için, bir kalsiyum göstergesi ile hücrelerin yük bir meydan okuma olarak kanıtlamak olabilir. Kalsiyum göstergeleri, probenesid, penisilin 20 ekskresyonun düşürmek için geliştirilmiş başlangıçta prototipik organik anyon nakil inhibitörü ve akışını önlemek için, kuluçkalama ortamı içinde eş zamanlı olarak uygulanır. Hücreler, kalsiyum indikatör yükleme için tek tabaka halinde tutulan bir bileşik ilave edildikten sonra hemen tespit edilebilir süspansiyon ve kalsiyum sinyalleri haline getirilir.

<table><tbody><tr><td>Fluo-3,</td><td>Invitrogen</td><td>F-1241 ve nbsp;</td><td>Hücre geçirgen</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8761</td><td>Suda çözünmez, 1 N NaOH içinde çözülür</td></tr><tr><td>%0.05 Tripsin-EDTA (1X)</td><td>İnvitrojen</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>İyonomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1138</td><td></td></tr><tr><td>Tunikamisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur Akış Sitometresi + CELLQuest yazılımı</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows Akış Sitometrisi için Çoklu Belge Arabirimi (WinMDI)</td><td>Joe Trotter, The Scripps Institute</td><td></td><td>Lütfen bunun FCS 2.0 uyumlu dosyaları okuyan ancak FCS 3.0 dijital verilerini tanımayan eski bir 16 bit uygulama olduğunu unutmayın.</td></tr><tr><td>WKPT-0293 Cl.2 sıçan böbrek proksimal tübül hücre hattı</td><td></td><td></td><td>Dr. Ulrich Hopfer (Fizyoloji ve Psikoloji Bölümü Biyofizik, Vaka Western Reserve Üniversitesi, Cleveland, OH)</td></tr></tbody></table>

sitometrisi ile böbrek hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Hem fizyolojik hem de patofizyolojik çeşitli hücresel süreçler, ekzositoz, mitokondriyal fonksiyon, hücre ölümü, hücre metabolizması ve hücre göçü dahil olmak üzere kalsiyum gerektirir veya kalsiyum tarafından yönetilir. Sitozolik kalsiyum normalde düşük nanomolar konsantrasyonlarda tutulur; daha ziyade endoplazmik retikulum, mitokondriyal matriks ve hücre dışı bölmede yüksek mikromolar ila milimolar konsantrasyonlarda bulunur. Stimülasyon üzerine, sitozolik kalsiyumda geçici bir artış, aşağı akış olaylarını işaret etmeye hizmet eder. Sitozolik kalsiyumdaki değişikliklerin tespit edilmesi, normal olarak, floresan yoğunluğunda bir artış veya kalsiyum bağlanması üzerine emisyon dalga boyunda bir kayma gösteren kalsiyum bağlayıcı boyalarla ayarlanmış bir canlı hücre görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, canlı hücre görüntüleme kurulumu tüm araştırmacılar tarafından ücretsiz olarak erişilebilir değildir. Alternatif tespit yöntemleri, akış sitometrisi ile immünolojik hücreler ve floresan mikroplaka okuyucusu olan immünolojik olmayan yapışkan hücreler için optimize edilmiştir. Burada, tek dalga boylu bir kalsiyum bağlayıcı boya kullanarak akış sitometrisi ile epitel hücrelerindeki değişiklikleri tespit etmek için optimize edilmiş, basit bir yöntemi açıklıyoruz. Normalde boya ile yüklenmesi zor olan yapışık renal proksimal tübül epitel hücrelerine probenesid varlığında floresan hücre geçirgen kalsiyum bağlayıcı boya yüklenerek süspansiyona getirildi ve tapsigargin, tunikamisin ve iyonomisin ilavesi öncesi ve sonrası kalsiyum sinyalleri izlendi.

Sitozolik kalsiyum artırmak için, iki farmakolojik bileşikler hücre geçirgen kalsiyum bağlama boyası, Flu-3-AM ile yüklendi, renal proksimal tübüllerde (WKPT-0293 CL.2) uygulanmıştır. İşlem görmemiş kontrol numuneleri probenesid mevcudiyetinde kalsiyum bağlama boya ile yüklenir ve karıştırılır, ancak herhangi bir bileşik ilavesi olmaksızın edildi. Thapsigargin (TG) ER dışarı sızıntı yol açan ve artan sitosolik kalsiyumun elde SERCA pompanın klasik bir inhibitörüdür. Tunikamisin (TUN) blokları katlanmamış protein karşılı...

Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Bu prosedürün genel amacı, renal epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyumdaki değişiklikleri tespit etmektir. Bu, hücrelerin önce bir anyon taşıyıcı inhibitör probit varlığında floresan kalsiyuma duyarlı bir boya ile yüklenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, hafif tripsin izasyonu ile hücreleri süspansiyon haline getirmektir.Santrifüj işleminden sonra hücreler HBSS tamponu içeren probitte yıkandı. Son adım, bir akış sitometresi kullanarak bileşik kaynaklı değişiklikleri ölçmektir. Sonuç olarak, akış sitometrisi, renal epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyumdaki değişikliklerin kinetiğini göstermek için kullanılır.Bu nedenle, bu tekniğin yaşam tarzı görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hızlı bir şekilde gerçekleştirilmesinin kolay olması ve bileşiklerin taranması için uygun olmasıdır. Bu kas, bireylerin fizyolojik ve patofizyolojik hücresel sinyalleşme bağlamında kalsiyumun rolünü araştırmasına izin vererek hücre içi sinyalleşme alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu prosedürü göstermek, grubumuzdan bir teknisyen olan Sylvia Kyle olacak.Bu deney, kalsiyum D yükleme plakasından iki gün önce sıçan böbrek proksimal tübülünün S bir segmentinden

cytosolic-calcium-measurements-renal-epithelial-cells-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, flow sitometri kullanarak sabit ve canlı hücrelerin calpain aktivitesini ölçmek için ayrıntılı protokol.

Sabit ve Yaşam Hücreler Sitometrisi ile Calpain Aktivitesi Ölçme

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Bu videoda, kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için konfokal mikroskopi görüntülemeye dayalı bir test açıklanmaktadır. Test, geçirgenleştirilmiş kültürlenmiş hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyumu ölçmek için kalsiyuma duyarlı floresan boya Rhod-2 /'yi kullanır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Mitokondriyal Kalsiyum Alımını Ölçmek için Kalsiyum Akışı Testi

Podositlerdeki hücre içi kalsiyum seviyelerindeki değişiklikler, glomerüllerin filtrasyon fonksiyonunu kontrol etmenin en önemli yollarından biridir. Burada, yeni izole edilmiş glomerüllerin podositlerinde gerçek zamanlı kalsiyum işlemenin ve tek iyon kanalları aktivitesinin tespit edilmesini sağlayan yüksek verimli bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Taze İzole glomerulusların Podositler Tek kanallı Analizi ve Kalsiyum Görüntüleme

Renal tübüler epitel ifade iyon kanalları polikistik böbrek hastalığı patolojisinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada taze kemirgen böbrekler izole kistik epitel patch-kelepçe analizi ve hücre içi kalsiyum seviyesi ölçümleri gerçekleştirmek için kullanılan deneysel protokolleri açıklayın.

Patch Kelepçe ve Canlı Floresan Mikroskobu uygulanması Taze İzole PKD Epitelinin Fonksiyonel Properties Monitör

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Tek hücreli duyarlılığı sağlayarak, gerçek zamanlı Akış Sitometresi multimodal reseptör işlevleri canlı kültürlerin ölçmek için benzersiz olarak uygundur. Yetişkin nöral progenitör hücreler kullanarak, P2X7 reseptör işlevi tarafından elde kalsiyum göstergesi boya, transmembran gözenek oluşumu etidyum bromür alımı ve floresan lateks boncuk kullanarak fagositoz ile kalsiyum akını ile değerlendirildi.

Kalsiyum akını, gözenek oluşumu ve P2X7 reseptörleri yetişkin nöral progenitör hücreler tarafından fagositoz araştırmak için gerçek zamanlı canlı hücre Akış Sitometresi

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Kalsiyum sinyalinin canlı hücre görüntülemesi, monokatmanlarda yetiştirilen stabil hücre hatlarında kalsiyum mobilizasyonunu incelemek için yoğun şekilde kullanılır. Bu protokol, karmaşık ve birincil dokuda canlı hücre boyaları kullanılarak kalsiyum sinyalinin canlı hücre floresans görüntülemesini tanımlar ve binlerce bireysel hücrenin floresan yoğunluğunu aynı anda nicelikten ölçmek için makine öğrenimi yazılımını kullanarak analizleri kolaylaştırır.

Otomatik hücre segmentasyonu kullanılarak birincil insan hava yolu epitelyal kültürlerinde floresans tabanlı kalsiyum görüntüleme

Öğrenin böbrek epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum değişikliklerini sitometri ile ölçme yöntemini. Floresan boya ve tripsinizasyon kullanarak hızlı kalsiyum sinyal analizi yapın.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

Daha fazla video keşfet