Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC) İn Vitro İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Bu deneyin genel amacı, otoreaktif veya istenmeyen T hücresi popülasyonlarının tükenmesi için hücresel olmayan HLA IG tabanlı öldürücü yapay antijen sunan hücre veya KAAAPC oluşturmaktır. Bu, fonksiyonel K-A-A-P-C'nin üretilmesi için ilk olarak HLA IG moleküllerinin ve Antifa monoklonal antikorlarının hücre boyutunda demir dekstran parçacıklarına kovalent olarak bağlanmasıyla elde edilir İkinci adımda, K-A-A-P-C, uygun işlevselliklerini sağlamak için akış sitometrisi ile karakterize edilir. Daha sonra, K-A-A-P-C, istenmeyen antijene özgü T hücresi popülasyonunu hedeflemek için farklı peptitlerle yüklenir.

Sonuç olarak, yüklenen akraba tarafından T hücrelerinin antijene özgü anti-yağ aracılı öldürülmesini ölçmek için akış sitrik analizi yapılabilir. K-A-A-P-C. Bu yöntem için fikir ilk olarak, hücre bazlı bir öldürücü antijen sunan hücrenin geliştirilmesi üzerinde çalışırken sorunlarla karşılaştığımızda ve aynı zamanda beat tabanlı bir platformun geliştirilmesi üzerinde çalıştığımızda aklımıza geldi. Bağışıklık hücresi modülasyonu teknolojisi Önce K-A-A-P-C oluşturmak için, bir stoktan 250 mikrolitre epoksi boncuk ve 250 mikrolitre taze hazırlanmış borat tamponunu steril bir vidalı cam şişeye ekleyin.

Boncukların iki dakika sonra yapışmasını sağlamak için şişeyi bir mıknatısın üzerine yerleştirin, tamponu aspire edin ve şişeyi mıknatıstan çıkarın. Boncukları bir kez başka bir mililitre delikli sekiz tamponla yıkayın ve daha sonra 550 mikrolitre HLA A iki IG ve anti-insan CD 95 MAB içinde yeniden süspanse edin. Boncukları antikorlarla karıştırmak için şişeyi hafifçe çalkalayın ve ardından boncukları 24 saat boyunca dört santigrat derecede bir döndürücü ucunda inkübe edin.

Ertesi gün, boncukları 300 Gs ve oda sıcaklığında iki dakika döndürün ve şişeyi tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin. İki dakika sonra yükleme tamponunu aspire edin. Şişeyi mıknatıstan çıkarın ve boncukları dikkatli bir şekilde çalkalayarak bir mililitre yıkama tamponunda yıkayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, kalıntı protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için şişeyi bir mililitre taze boncuk yıkama tamponunda döndürün. Ertesi gün, boncukları tekrar döndürün ve şişeyi tekrar mıknatısın üzerine yerleştirin. İki dakika sonra yıkama tamponunu aspire edin.

Şişeyi mıknatıstan çıkarın ve KAPC'ye bir mililitre PBS ekleyin. Boncukların kalitesini kontrol etmek için, K-A-A-P-C'nin 1,5 katı 10 ila beşte birini bir faks tüpüne aktarın ve bir mililitre faks yıkama tamponu Resus. Boncuk peletini 100 mikrolitre yıkama tamponunda askıya alın ve HLA'yı tespit etmek için bir mikrolitre anti fare IgG, bir PE ekleyin; anti-insan CD'sini tespit etmek için iki IG ve bir mikrolitre anti fare IG, MFI TC, 95 MAB.

Daha sonra, dört santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, boncukları bir mililitre faks yıkama tamponu Resus'ta yıkayın. Bunları 250 mikrolitre yıkama tamponunda askıya alın ve peptit yüklemesi için numuneleri bir akış sitometresinde okuyun. K-A-A-P-C'nin yedide birine 10 kez iki kez aktarın ve yeni bir steril cam şişeye aktarın.

Daha sonra boncukları iki dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirdikten sonra, PBS'yi aspire edin ve boncukları beş mikrogram peptit içeren 500 mikrolitre taze PBS'de yeniden süspanse edin. Şişeyi, yüklenen peptidin tarihi ve adı olan K-A-A-P-C ile etiketleyin. Daha sonra, A-K-A-A-P-C in vitro öldürme testi gerçekleştirmek için HLA A iki IG dimerine yeterli peptit yüklemesine izin vermek için yüklenen KAA-APC'yi en az üç gün boyunca dört santigrat derecede saklayın.

Tüm serbest peptidi çıkarmak için peptit yüklü K-A-A-P-C'yi gösterildiği gibi en az altı kez yıkayın. Daha sonra K-A-A-P-C ve iki kez 10 ila beşinci antijene özgü T hücrelerini, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatörde 48 saatlik kültürden sonra bire bir oranında 200 mikrolitre ko-kültür ortamında 96 kuyulu yuvarlak alt plakanın numunesi başına bir oyuğa aktarın. Numuneleri uygun karşılık gelen faks tüplerine aktarın ve bir mililitre nexin five bağlayıcı tamponda yıkayın.

Daha sonra, peletleri 100 mikrolitrelik bir nexin five bağlayıcı tampon içinde yeniden süspanse edin ve daha sonra numuneleri oda sıcaklığında bir mikrolitre nexin five FITC ve beş mikrolitre yedi a d içinde inkübe edin. 10 ila 15 dakika sonra, numuneleri bir mililitre nexin five bağlayıcı tampon ile yıkayın ve peletleri 250 mikrolitre bir nin beş bağlayıcı tampon içinde yeniden süspanse edin. Ardından numuneleri hemen bir akış sitometresinde okuyun.

K-A-A-P-C, HLA A iki IG ve Antifa MAB'ı aynı anda görüntüler, bu da hücre tabanlı yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, kodlama veya transdüksiyon verimlilikleri tarafından değiştirilmez ve üretim sırasında kolayca modüle edilebilir. K-A-A-P-C, aynı kökenli peptit ile yüklendiğinde in vitro olarak antijene özgü T hücrelerini tüketebilirken, aynı kökenli olmayan bir bez yüklüdür. K-A-A-P-C, T hücresini tüketmez, bu nedenle K-A-A-P-C, antijene özgü bir şekilde T hücresi apoptozunu indükler.

Daha sonra, K-A-A-P-C, sadece farklı T hücresi özgüllüklerinin bir karışımından antijene özgü T hücrelerinin seçici olarak tükenmesi için kullanıldığında, komşu T hücrelerine minimal sitotoksisite sızar. Bu nedenle, K-A-A-P-C, geliştirildikten sonra otoimmün hastalıkların ve allogreft reddinin tedavisi için potansiyel bir klinik uygulanabilirliğe sahip, insan aktif antijene özgü T hücrelerinin in vitro antijen, antijene özgü tükenmesi için mükemmel bir araçtır. Bu teknik, hücresel immünoloji alanındaki araştırmacıların, T hücresi aracılı otoimmün hastalıkların ve nakil reddinin tedavisi için yeni yaklaşımları keşfetmelerinin yolunu açtı.