Name: Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Öğrenin fare beyninde telomeraz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan TRAP yöntemini. Bu teknik, farklı beyin bölgelerinde ve cinsiyetler arasındaki aktivite farklılıklarını incelemek için zaman ve maliyet açısından etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen B.G. Negev teknolojisi ve Linda Powers'ın katkılarıyla desteklenmiştir.

Hayvan deneyleri Ben-Gurion Üniversitesi&#39;nde (IL-39-08-2010) hayvan deneyleri için etik kurul tarafından onaylandı. 1. Fare Beyin Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Her bir buz üzerinde 5 mi Ringer çözeltisi ve yeri içeren tüplerde 15 ml 3 tüpleri hazırlayın. </li><li> (DİKKAT - kimyasal kaput kullanmak) İsofloran anestezi kullanarak fare Kurban servikal dislokasyon ve hemen dekapitasyon 10-20 sn. </li><li> Kafatası beyin çıkarın ve beyin dokusunda hasar görmesini önlemek için buz gibi soğuk Ringer solüsyonu ile bir kaç saniye için durulayın. </li><li> Cerrahi bıçak kullanılarak, frontal korteks beyincik (CR) ve sapı (BS) ayırır. Sonra, beyin sapından beyincik ayırmak ve frontal korteks, frontal lobu (FL) kesilmiş; frontal lob koku ampulü çıkarın. Belirlenen, 15 ml tüpler içinde 3 beyin bölgelerinin yerleştirin. </li><li> Her bir tüp içinde doku homojenize edilir. Fr EkleESH, buz soğukluğundaki Ringer solüsyonu, her bir tüp, 800 xg da 7 dakika için aynı hacim ve santrifüj içerir. </li><li> Süpernatantı ve her tüp CHAPS lizis tamponu 100 ul ekleyin. , Bir 21 G iğne ile bir 1 ml şırınga ile çözelti, birkaç kez (~ 10) geçirilerek, iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 13,000 x g&#39;de 30 dakika boyunca yeni bir mikro santrifüj tüpüne ve santrifüj tüpünün her aktarın. Yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarılır ve süpernatan, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. -80 ° C&#39;de 10 ul alikolar içinde protein muhafaza edilir. </li></ol> Araçların, Reaksiyon Çözümleri ve Protein Sulandırma Hesaplamaları 2. TUZAK Testi Hazırlık <ol><li> Protein ekstresi seyreltilerde ve telomeraz reaksiyon tamponu için etiketli mikro-santrifüj tüplerine uygun sayıda hazırlayın. Kontaminasyonu önlemek için filtre ipuçlarını kullanarak protokoldeki tüm pipetlenmesini gerçekleştirin. </li&gt; <li> TRAP Reaksiyon karışımı 10x TS astar, dNTP&#39;ler, Ultra saf su ve protein ekstreleri (reaktif ve reaktif konsantrasyonları için malzeme tabloya bakınız): buz aşağıdaki çözümleri çözülme. </li><li> Ultra saf su (Ultra saf su) ile 1 mg / ml nihai konsantrasyona kadar bir protein ekstresi çözeltisi ile seyreltilir. </li></ol> 3. Reaksiyon Telomeraz <ol><li> Bir mikro santrifüj tüpüne aşağıdakiler eklenerek telomeraz reaksiyonu karışımı hazırlayın: 2 ul TRAP karışımı (10x), 1 ul TS primer (0.1 ug), 1 ul dNTPs (10 mM) ve 15 ul UPW. Çoklu örnekler için, numuneler, artı 1 sayısına göre yukarıda sözü edilen birimler çarpın. </li><li> Her reaksiyon tüpüne, reaksiyon karışımı 19 ul ve 20 ul son hacim için, her bir tüpe seyreltilmiş protein ekstresi (1 ug protein) 1 ul. </li><li> 45 dakika süre ile, 30 ° C&#39;de önceden ısıtılmış bir su banyosu içinde, reaksiyon tüpleri yerleştirin. </li></ol> 4. PCR Reaksiyonu: <ol><li> Onbeş milACX astar, Titanyum Taq Buffer, UPW: n telomeraz reaksiyon sonundan önce, aşağıdaki çözümleri eritin. </li><li> 2.5 ul Titanyum Taq Buffer (10x), 1 ul ACX astar (0.1 ug), 2 ul (IC kullanıldığında 1 ul) UPW ve 0.5 ul Titanyum Taq Polimeraz: mikro-santrifüj tüpüne aşağıdaki ekleyerek PCR reaksiyon karışımı hazırlayın (50x). Çoklu örnekler için, numuneler artı 2 sayısına göre yukarıda sözü edilen birimler çarpın. </li><li> PCR 6 ul her bir PCR tüpü 26 ul karıştırmak ve bir son hacim için her bir tüpe telomeraz reaksiyonu (20 ul), tüm birimi ekleyin. </li><li> Bir PCR termo döngü cihazı için PCR tüpleri yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: - 90 ° C - 2 dk. - 94 ° C - 30 san. * - 60 ° C - 30 san. * - 72 ° C -. 45 sn * - 72 ° C - 2 dk. -20 ° C&#39;de muhafaza PCR ürünleri. * = 34 devir </li></ol> 5. Agaroz Mini-gel Hazırlama, Örnekleri Koşu ve Jel Boyama <ol><li> 25 ml soğuk tampon maddesi elektroforezi (TBE) ve tampon solüsyonu 2-4 kez hacminin yavaş yavaş yüksek çözünürlüklü (HR) agaroz toz halinde 1,125 g çözelti hızlı bir şekilde karıştırılır iken serpmek, bir cam kaba, bir karıştırma çubuğu ilave edin . Karıştırma çubuğu çıkarın, havalandırma için küçük bir delik plastik bir şal ve delgi ile beher kaplayın. Daha sonra 3 dakika boyunca &quot;düşük&quot; güç mikrodalga beher ısıtın ve &quot;Yüksek&quot; güç anahtarı ve dökülmesini neden değil itina ile kısa bakliyat çözüm ısıtın. Isıtılarak oluşturulan köpük, birkaç saniye sonra, büyük kabarcıklar haline gelir ve kaybolur, agaroz hazır olduğuna dikkat edin. </li><li> Jel, oda sıcaklığında katılaşan sonra jel, kullanımdan önce 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca soğuk izin yatay mini jel cihazına jel döküm. </li><li> 25 TUZAK numune ul (20 ul TRAP PCR ürünlerinin ve 5 ul 6x jel yükleme boyası) ile her şerit yerleştirin ve 11 çalıştırmak4 ° C soğuk oda içinde 3 saat boyunca 0 V. </li><li> 15 ul 10,000X nükleik asit leke, 0.1 M NaCl (0.29 g) ile 50 ml iki defa destillenmiş su (DDW) stok çözeltisi eklenerek çalışma çözeltisi nükleik asit lekesi 3x hazırlayın. Nazik çalkalama ile 20 dakika boyunca jel Leke. </li><li> TRAP merdiven DNA bantları görmek için 302 nm dalga boyunda UV transilluminator kullanın. </li></ol>

<ol><li>Urquidi, V., Tarin, D., Goodison, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+telomerase+in+cell+senescence+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Role of telomerase in cell senescence and oncogenesis.</a> Annu Rev Med. 51, 65-79 (2000).</li>
<li>Cong, Y., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+human+telomerase+beyond+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Actions of human telomerase beyond telomeres.</a> Cell Res. 18, 725-732 (2008).</li>
<li>Tichon, A., et al. Oxidative stress protection by novel telomerase activators in mesenchymal stem cells derived from healthy and diseased individuals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTichon%2C+A+%22Curr.Mol.+Med%22">Curr.Mol. Med</a>. 13, 1010-1022 (2013).</li>
<li>Lannilli, F., Zalfa, F., Gartner, A., Bagni, C., Dotti, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+TERT+associates+to+RNA+granules+in+fully+mature+neurons%3A+Role+in+the+translational+control+of+the+cell+cycle+inhibitor+p15INK4B%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic TERT associates to RNA granules in fully mature neurons: Role in the translational control of the cell cycle inhibitor p15INK4B.</a> PloS one. 8, e66602(2013).</li>
<li>De Jesus, B. B., Blasco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+telomerase+activation+in+extending+health+span+and+logevity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Potential of telomerase activation in extending health span and logevity.</a> Curr opinion in Cell Biology. 24, 1-5 (2012).</li>
<li>Blackburn, E., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%3A+An+RNP+enzyme+synthesizes+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Telomerase: An RNP enzyme synthesizes DNA.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, 1-9 (2011).</li>
<li>Klapper, W., Shin, T., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+telomerase+activity+and+TERT+expression+during+brain+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of telomerase activity and TERT expression during brain development in mice.</a> J. Neurosci. Res. 64, 252-260 (2001).</li>
<li>Caporaso, G. L., Lim, D. A., Alvarez-Buylla, A., Chao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+activity+in+the+subventricular+zone+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Telomerase activity in the subventricular zone of adult mice.</a> Mol. Cell Neurosci. 23, 693-702 (2003).</li>
<li>Eitan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Telomerase-increasing+compound+in+mouse+brain+delays+the+onset+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Novel Telomerase-increasing compound in mouse brain delays the onset of amyotrophic lateral sclerosis.</a> EMBO Mol. Med. 4, 313-329 (2012).</li>
<li>Kim, N. W., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+quantification+and+characterization+of+telomerase+activity+by+the+telomeric+repat+amplification+protocol+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repat amplification protocol (TRAP).</a> Nuc. Acid Res. 25, 2595-2597 (1997).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

PCR 4 ile telomeraz reaksiyonu 3) telomeraz reaksiyon ürünlerinin amplifikasyonu - beyin dokusu 2) spesifik bölgelerinden 1) proteinlerinin ekstre Telomeraz suretiyle, primer uzaması TS: TRAP ile fare beyin telomeraz aktivitesi analizi 4 ana adımdan oluşur yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak, PCR-ürünlerinin) ayrılması. DNA merdiveni ve PAGE PCR ürünleri ayırma hassas bir şekilde tespit radyoaktif dCTP &#39;lerin kullanımı: Bu değiştirilmiş TRAP yönteminin Geleneksel tahlilde yüksele...

Telomeraz telomeraz bir ribonükleoprotein oluşan ters transkriptaz (TERT), telomeraz katalitik alt birimi, ve bir RNA bileşen (TERC) &#39;dir. Telomeraz kanonik rolü, bu nedenle genomik bütünlüğü ve hücre proliferasyonunu 1 teşvik telomerik uçlarına tekrar dizileri (TTAGGG) eklenerek telomerlerin uygun uzunluğunun korumaktır. Bu çeşitli zarar verici madde 2 ile uyarılan apoptoza karşı direnç kazandıran, yani başka roller de, hücrelerde TERT atfedilmiştir oksidatif stres 3 insan mezenkimal kök hücrelerini koruyan ve pozitif RNA TIA1 ile olan ilişkisi ile tam olarak farklılaşmış nöronların hayatta kalma yanlısı bir rol oynar granüller 4. Enzim ekspresyonu ve aktivitesi düzeyleri sıkı Bölünmeyen hücreler 5,6 olarak düzenlenmiş olsa da, TERT, ifade edilen ve daha çok somatik bölünen hücreleri ve kanser tiplerinin çoğunda aktif bir biçimde gösterilmiştir. Çalışmalar r göstermiştirTERT mRNA, erişkin 7 içine daha düşük düzeyde muhafaza edilirken Odent beyin, telomeraz aktivitesi, doğum sonrası 10. günde fark edilemez hale gelecektir. Diğer çalışmalar yetişkin alt-ventriküler bölge, koku ampul, hipokampus içinde telomeraz aktivitesini gösterdi ve yetişkin beyincik ve kortekste 8. , Enjekte edilen fareler SOD1 transjenik amiyotrofik lateral skleroz hastalığının başlamasını ve ilerlemesini yavaşlattığı - Yakın zamanda beyin ve omurilik telomeraz ekspresyonunu ve aktivitesini de artırır yeni bileşikler, N-metil-D-aspartat (NMDA) nöro-koruyucu etkiler üretmiştir göstermiştir fare ve bu farelerin 9 omurilikteki motor nöronların hayatta kalma artmıştır. Tam nöronlarda ve beyinde telomeraz pro survival rolünü anlamak için, beynin farklı bölgelerinde telomeraz aktivitesinin tespit edilmesi için basit, hızlı ve nispeten hassas bir analiz geliştirmek için gereklidir. Telomerik rEPEAT amplifıkasyon protokolü (TRAP) sıraları düzenlenmiştir telomeraz aktivitesi kanonik ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) birleştiren bir iyi bilinen hassas bir deneydir. Bu deneyde, telomeraz TTAGGG telomeraz substrata TH ters primeri kullanılarak 6 baz çifti (bp) DNA merdiveni oluşturur PCR amplifikasyonu takiben (TH astar) oligonükleotid, tekrar ekler -. ACX 32P dCTP etiketli en tespit etmek için kullanılır PCR ürünlerinin, düşük miktarda. DNA merdiveni dizileme poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözümlenir. Her iki DNA bantların yoğunluğu ve DNA merdiven uzunluğu, aktif enzim moleküllerinin miktarını ve işlem kapasitesi, sırasıyla 10 yansıtmaktadır. Bu geleneksel tahlil bazı önemli zorluklar tutar: (gecede her iki durumda) sıralama PAGE ve jel çalışan zaman tüketimi ve radyoaktif ürünün filmi pozlama işlemek için büyük ve sert radyoaktif maddelere maruz kalma tehlikesi. </p&gt; Bu protokol, gelişmiş bir radyoaktif olmayan bir agaroz mini jel bazlı bir deney sağlar. DNA, 6 bp&#39;lik bir basamağı% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel kullanılarak çözümlenir ve algılama son derece hassas bir nükleik asit leke kullanılarak başarılabilir. Agaroz mini yüksek çözünürlük jel ve duyarlı nükleik asit leke kullanılarak kombinasyonu, analizi kullanımı kolay sunar radyoaktiviteye maruz tehlikesini bertaraf eder ve önemli bir kaç saate kadar 3 gün genel deney süresini kısaltır.

<table><tbody><tr><td>TRAP Karışımı (10x)</td><td></td><td></td><td>Manuel olarak yapıldığında, aşağıdakileri UPW'de karıştırın: 630 mM KCl, 200 mM Tris-HCl pH 8.2, 10 mM EDTA, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, %0.5 TWEEN (Sigma'dan satın alınmıştır). Alikotlar -20 ° C'de dondurulur.</td></tr><tr><td>Ringer'ın çözümü</td><td></td><td></td><td>Manuel olarak yapıldığında, aşağıdakileri DDW'de karıştırın: 124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4&middot; H2O, 2 mM MgSO4, 26 mM NaHCO3, 1.802 g / L D- (+) - glikoz susuz.</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>Minrad A.Ş.</td><td>NDC 60307-110-10</td><td>Kimyasal başlıkta dikkatli kullanım</td></tr><tr><td>dNTP'ler (10 mM)</td><td>Sigma</td><td>D7295</td><td></td></tr><tr><td>TS astar (5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3')</td><td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligoları DRY formatında sipariş edildi ve gerekli konsantrasyona göre UPW eklendi</td></tr><tr><td>ACX primer (5'-GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC-3')</td> <td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligoları DRY formatında sipariş edildi ve UPW isteğe göre eklendi konsantrasyon</td></tr><tr><td>Titanyum Taq Polimeraz / Tampon</td><td>Clontech</td><td>S1792 / S1793</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Çözünürlüklü agaroz</td><td>Sigma</td><td>A4718</td><td>Herhangi bir yüksek kaliteli yüksek çözünürlüklü agaroz sütlenebilir</td></tr><tr><td>Mini jel aparatı</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4466</td><td></td></tr><tr><td>Nükleik Asit Lekesi (JEL-KIRMIZI)</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>IC astar (5'-ATCGCTTCTCGGCCTTTT-3')</td> DRY formatında sipariş edilen <td>Sigma</td><td></td><td>DNA oligoları ve gerekli konsantrasyona göre eklenen UPW</td></tr><tr><td>CHAPS lizis tamponu</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi</td><td>9852S</td><td>1 mM'lik nihai konsantrasyona PMSF (proteaz inhibitörü) ekleyin</td></tr><tr><td>Ultra Saf Su (UPW)</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>01-866-1B</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 fareler</td><td>HARLAN Laboratories INC.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare beyin Çeşitli bölgelerinde telomeraz aktivite: radyoaktif olmayan telomeraz amplifikasyon protokolü tekrarlayın (trap) deneyi

Telomerase Activity in the Various Regions of Mouse Brain: Non-Radioactive Telomerase Repeat Amplification Protocol (TRAP) Assay

Telomeraz, bir ribonükleoprotein, telomer uzunluğu muhafaza ve dolayısıyla genomik bütünlüğü, çoğalmasını ve ömrünü teşvik sorumludur. Nöronlar gibi mitotik olmayan, son derece aktif hücreler için hayatta kalan olası önemini göstermektedir, ilave olarak, telomeraz gibi oksidatif stresten mitokondri korur ve apoptoza direnç kazandırmaktadır. Daha önce çeşitli fare beyin bölgelerinde telomeraz aktivitesi ve ekspresyonunu artırmak ve oksidatif stres motor nöronlar hücreleri korumak için yeni telomeraz aktivatörlerinin yeteneğini gösterdi. Bu sonuçlar telomeraz çeşitli lezyonlar gelen nöronların korunması dahil olduğu görüşünü güçlendirmektedir. Beyinde telomeraz rolünü vurgulamak amacıyla, burada erkek ve dişi fare beyninde telomeraz aktivitesini ve yaş olan bağımlılığını karşılaştırın. TRAP yönteminin çeşitli dokular veya hücre hatlarında telomeraz aktivitesini tespit etmek için standart bir yöntemdir. Burada analı göstermekCHAPS kullanılarak protein çıkarımı ile denatüre edici olmayan fare beyninin üç bölgede telomeraz aktivitesi sis, standart TRAP modifikasyonu ile, ardından tampon lisis. Bu 2-aşamalı bir deneyde, endojen telomeraz TTAGGG 6 bp&#39;lik bir tekrar (telomeraz reaksiyonu) ekleyerek belirli bir alt-tabaka, telomeraz (TH primer) ilerlemektedir. Telomeraz reaksiyonu ürünleri 6 bp&#39;lik fazlalıklarının bir DNA merdiveni oluşturarak bir PCR tepkimesi ile yükseltilir. DNA merdiveni analizi son derece hassas bir nükleik asit boyası ile boyandı, ardından% 4.5 yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi ile yapılır. 32P DNA tespiti ve DNA merdiveni çözülmesi için poliakrilamid jel elektroforez için radyoaktif dCTP etiketlenmiş kullanabilecektir geleneksel TRAP ile karşılaştırıldığında, bu protokol, fare beyninin telomeraz aktivitesini değerlendirmek yeteneğini göstermek için TRAP tasarruf toksik olmayan bir zaman sunar telomeras farklılıkları tespitÇeşitli dişi ve erkek fare beyin bölgesinde aktiviteye sahiptir.

Tüm hücre protein için 1 ve 3 aylık yaş 3, CD-1 erkek ve 3, CD-1 erkek fareler türetilen, frontal lob (FL), beyin sapı (BS), serebellum (CR) hazırlanmıştır modifiye TRAP tahlil ve radyoaktif TRAP eski 2 aylık yaşta 3 CD-1 erkek fareler. Telomeraz aktivitesi modifiye TRAP deneyi kullanılarak ayıkla 1 mcg proteinler tespit ve 2 mcg proteinler radyoaktif TRAP için ayıklamak edildi. Radyoaktif TRAP ile ve modifiye TRAP ile telomeraz aktivitesinin tespiti 1C genel DNA merdiveni (Şekil 1A</st...

Telomeraz yenidoğan beyninde ve ayrıca yetişkin beyninin farklı bölgelerinde ifade edilir. Fare beyninin çeşitli bölgelerindeki telomeraz aktivitesinin analizi ve erkek ve dişi fare beyinleri arasındaki telomeraz aktivitesindeki farklılıkların tespiti için toksik olmayan, zaman kazandıran bir TRAP testi sunuyoruz.

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Telomerase, a ribonucleoprotein, is responsible for maintaining the telomere length and therefore promoting genomic integrity, proliferation, and ...

Bu prosedürün genel amacı, normal beyin dokusundaki telomeraz aktivitesini ölçmektir. Bu, ilk önce aktif bir telomeraz enzimi için kaynak olarak çeşitli beyin dokularından tam hücre protein ekstraktlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, telomeraz aktivitesi için gerekli substrat ve nükleotidleri içeren spesifik bir telomeraz reaksiyon karışımına eşdeğer miktarlarda protein ekstraktlarının eklenmesidir.Daha sonra, telomeraz reaksiyon ürünleri PCR ile amplifiye edilir ve yüksek çözünürlüklü aros jel elektroforezi ile analiz edilir. Son adım, aros jelini oldukça hassas bir DNA boyama maddesi ile boyayarak amplifiye edilmiş telomeraz reaksiyon ürünlerini görselleştirmektir, sonuçta bu thoma ışınının tekrar amplifikasyon protokolü testinden elde edilen sonuçlar, thoma ışınının çeşitli beyin dokularındaki aktivitesine eşdeğer altı baz çifti artışı, DNA merdivenleri gösterir. Bu tekniğin, radyoaktif tuzak tahlili veya ticari tuzak tahlil kitleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu protokolün nispeten zaman ve maliyet açısından verimli bir alternatif sunmasıdır.Bu yöntem beyin dokusundaki aktivite hakkında bilgi verebilse de, diğer herhangi bir canlı doku veya hücre kültürüne de uygulanabilir. Bu işleme başlamadan önce, her biri beş mililitre zil çözeltisi içeren üç adet 15 mililitrelik tüp hazırlayın. Beyni ötenazi yapılmış bir fareden çıkardıktan sonra tüpleri buzun üzerine yerleştirin.Beyin dokusuna zarar vermemek için beyni buz gibi soğuk zil solüsyonu ile birkaç saniye durulayın. Cerrahi bir bıçak kullanarak beyincik ve beyin sapını frontal korteksten ayırın. Sonra, beyinciği beyin sapından ayırın.Koku soğancığını frontal lobdan çıkarın ve frontal lobu frontal korteksten kesin. Üç beyin bölgesini belirlenen 15 mililitrelik tüplere yerleştirin, her tüpteki dokuyu homojenize edin. Daha sonra, her tüp aynı hacmi içerecek şekilde taze buz gibi soğuk zil çözeltisi ekleyin ve 800 kez G'de yedi dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve 100 mikrolitre chap dilimi ekleyin.Her tüpe tampon koyun. Çözeltiyi yaklaşık 10 kez bir mililitrelik şırıngadan geçirerek 21 gauge erişte ile iyice karıştırın, 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. 30 dakika sonra, her tüpün içeriğini yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 30 dakika boyunca santrifüjleyin.13.000 kez, G'de, supinatı yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanarak, protein ekstraktlarını eksi 80 santigrat derecede 10 mikrolitrelik alikotlarda saklayın. Protokolün bu bölümüne, protein özütü dilüsyonları için uygun sayıda etiketli mikro santrifüj tüpü ve buz üzerinde aşağıdaki çözeltiler için telomeraz reaksiyon tamponu hazırlayarak başlayın.10 x tuzak reaksiyon karışımı DS primer dn tps, ultra saf su ve protein ekstraktları, protein ekstraktının çözeltisini mikrolitre başına bir mikrogramlık nihai konsantrasyona seyreltir. Ultra saf su kullanarak, kontaminasyonu veya telomer reaksiyonunu önlemek için tüm pipetleme işlemlerini filtre uçlarını kullanarak gerçekleştirin. Her numune, birden fazla numune için iki mikrolitre tuzak karışımı, bir mikrolitre TS astarı, bir mikrolitre DN NTP ve 15 mikrolitre ultra saf sudan oluşan bir telomer reaksiyon karışımı gerektirir.Bu hacimleri numune sayısı artı bir ile çarpın, her bir reaksiyon tüpüne 19 mikrolitre MASE reaksiyon karışımı ekleyin, ardından bir mikrolitre seyreltilmiş protein özütü ekleyin. 20 mikrolitrelik son hacim için, reaksiyon tüplerini 45 dakika boyunca 30 santigrat derece önceden ısıtılmış su banyosuna yerleştirin. Harman reaksiyonunun bitiminden 15 dakika önce, aşağıdaki çözeltileri, bir CX astarını, titanyum yapışkan tamponu ve ultra saf suyu hasat ederek harman reaksiyon ürünlerinin amplifikasyonu için hazırlanın.Her numune, birden fazla numune için 2,5 mikrolitre titanyum teknoloji tamponu, bir mikrolitre CX astarı, iki mikrolitre ultra saf su ve 0,5 mikrolitre titanyum teknoloji polimerazdan oluşan bir PCR reaksiyon karışımı gerektirir. Bu hacimleri örnek sayısı artı iki ile çarpın. Her bir PCR tüpüne altı mikrolitre PCR reaksiyon karışımı ekleyin ve her tüpe mase reaksiyonu ile tüm hacmi ekleyin.26 mikrolitrelik son hacim için, PCR tüplerini bir PCR termocycler'a yerleştirin ve aşağıdaki programı, iki dakika boyunca 90 santigrat derece, ardından 30 saniye boyunca 94 santigrat derece 34 döngü ile çalıştırın. 30 saniye boyunca 60 santigrat derece ve 45 saniye boyunca 72 santigrat derece. Ve 72 santigrat derecede son iki dakika.PCR reaksiyonu tamamlandığında, PCR ürünlerini eksi 20 santigrat derecede saklayın. Yumurta güllerini önce mini jeli dökmeye hazırlamak için, tampon çözeltisinin hacminin iki ila dört katı olan bir behere 25 mililitre soğutulmuş TBE Elektroforez tamponu ve bir karıştırma çubuğu ekleyin ve karıştırmaya başlayın. Daha sonra 1.125 gram yüksek çözünürlüklü aros tozunu yavaşça serpin.Çözelti hızla karışırken, yıldız çubuğunu çıkarın. Beheri streç filmle örtün ve havalandırma için küçük bir delik açın. Agrosları vururken, agrosları tamamen çözmek için kaynama noktasına ulaşmak çok önemlidir.Oluşan köpüğün dökülmeyeceğinden emin olmak için tüm dikkatinizi mikrodalgadaki behere verdiğinizden emin olun. Beheri mikrodalgada üç dakika düşük güçte ısıtın, ardından yüksek güce geçin ve dökülmeyi önlemek için dikkatli bir şekilde çözeltiyi kısa darbelerle ısıtın. Jeli yatay bir mini jel aparatına dökün ve jel katılaştıktan sonra dört santigrat derecede 20 dakika boyunca oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.Elektroforez için kullanmadan önce, her şeride 25 mikrolitre tuzak numunesi yükleyin ve jel çalışırken dört santigrat derece soğuk bir odada üç saat boyunca 110 voltta çalıştırın. 0.1 molar sodyum klorür ile 50 mililitre çift damıtılmış suya 15 mikrolitre 10.000 x nükleik asit leke stok çözeltisi ekleyerek üç x nükleik asit lekesi çalışma çözeltisi hazırlayın. Numunelerin elektroforezi tamamlandığında, jeli oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hafifçe çalkalayarak boyayın.Son olarak, 302 nanometre dalga boyuna sahip bir UV trans aydınlatıcı kullanın. Tuzak merdivenini görüntülemek için, fare beyninin bölgelerinde hem geleneksel hem de modifiye tuzak tahlilleri ile DNA bantları telomer aktivitesi tespit edildi. DNA merdiveninin uzunluğu ve yoğunluğu ile görüldüğü gibi, modifiye edilmiş tahlil ile telomer DNA ürünlerinin daha iyi görselleştirilmesi ve çözünürlüğü gözlendi.Modifiye tuzak tahlilinde protein ekstraktlarının azalan konsantrasyonları kullanıldığında telomer DNA ürünlerinde kademeli bir azalma gözlendi, bu da daha düşük protein konsantrasyonlarında telomer aktivitesinin tespiti için duyarlılığını düşündürdü, telomeraz aktivitesinin saptanması bir aylık dişi ve erkek farelerin üç beyin bölgesinde modifiye tahlil ile önemli bir fark göstermedi. Bununla birlikte, üç aylık farelerde, DNA bantlarının yoğunluğu ve DNA ürünleri merdiveninin uzunluğu ile ortaya çıktığı gibi, frontal lob ve beyin sapında beyinciklere kıyasla daha yüksek telomeraz aktivitesi gösterilir. Farenin yetişkinliğe geçişi sırasında, thoma ışınının aktivitesi frontal lobda artar ve beyin sapı ve beyincikte azalır.Ome telomer aktivitesi de kadınlarda frontal lobda daha yüksek görünmektedir. Erkeklerde beyin sapı ve beyincikteki daha yüksek telomer aktivitesinin aksine, bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa altı ila yedi saat içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, seçtiğiniz dokudaki thoma aktivitesini nasıl kolayca belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

telomerase-activity-various-regions-mouse-brain-non-radioactive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

EpiMark 5-HMC ve 5-mC Analiz Kiti, analiz etmek ve SPE larındaki lokus içinde 5-methylcytosine ve 5-hydroxymethylcytosine ölçmek için kullanılabilir. Kiti, 5-HMC hidroksil grubu β-glukoziltransferaz (T4-BGT) kullanan bir enzimatik reaksiyon ile glikoz eklenmesiyle 5-5-HMC mC ayırır. 5-HMC CCGG bağlamında oluştuğunda, bu değişikliği olmayan bir cleavable sitesine cleavable MspI sitesi dönüştürür.

Balb / C Beyin Dokusu Yüksek Hassasiyet 5-hydroxymethylcytosine Algılama

Doğru, kısa sofistike ve ucuz bir yöntem birden fazla doku ve Mah-PCR kullanarak türlerde telomer uzunluğu değerlendirir olduğu açıklanmıştır. Buna ek olarak, telomer uzunluğu için tamamlayıcı bir omurga test olarak telomeraz aktivitesini değerlendirmek için basit bir test tarif edecektir.

Telomer uzunluğu ve Telomeraz Aktivitesi, Hücre Yaşlılık bir Yin ve Yang

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

Telomer ve telomeraz yaşlanma ve tümör oluşumunda önemli roller oynar. Bu protokolün amacı, murin ile indüklenebilir iki telomeraz knock-in alelinin nasıl oluşturulacağını ve bunların doku dejenerasyonu/rejenerasyonu ve kanser çalışmalarında nasıl kullanılacağını göstermektir.

Doku Dejenerasyonu / Yenilenme ve Kanser Araştırmaları Murin İndüklenebilir Telomeraz allelleri kullanılması

RNA in situ hibridizasyon (ISH), hücre ve dokulardaki RNA'ların görselleştirilmesini sağlar. Burada, RNAscope ISH'nin immünohistokimya veya histolojik boyalarla kombinasyonunun, fare ve insan beyninin bölümlerinde aksonlara lokalize mRNA'ları tespit etmek için nasıl başarılı bir şekilde kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

İnsan revers transkriptaz (TERT) hem de çift iplikçikli RNA RNA'ya bağımlı RNA polimeraz faaliyetleri ile telomeric DNA sentezler. Burada, RNA'ya bağımlı RNA polimeraz etkinliği endojen TERT algılamak için yeni kurulan bir tahlil açıklayın.

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Burada, tek bir subtelomere bir MS2 sıra etiketi içeren kanser hücre klonlar oluşturmak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım MS2 GFP sistemde güvenerek, endojen tutanaklar, telomeric tekrar içeren RNA (canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade TERRA) görselleştirme sağlar.

Canlı hücreler içinde tek bir telomer üzerinden ifade Telomeric tekrar içeren RNA TERRA görselleştirmek için kanser hücre klonlar nesil

Burada, rastgele olmayan X kromozom inactivation ile uygulanabilir bir kadın duvar modeli oluşturmak için bir protokol tarif, yani, maternally miras X kromozom hücrelerde% 100 ' de aktif değildir. Ayrıca, pasif X kromozom in vivo farmakolojik reaktivasyonunun fizibilite, tolerabilite ve güvenliğini test etmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Pasif X kromozom üzerinde Mecp2 farmakolojik yeniden aktivasyonu için rasgele olmayan bir fare modeli

Biz başarıyla standart telomer tekrar amplifikasyon Protokolü (Trap) tahlil damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonları istihdam edilecek dönüştürülür. Bu yeni tahlil, ddTRAP denilen, daha hassas ve niceliksel, daha iyi algılama ve çeşitli insan hücreleri içinde telomeraz aktivite istatistiksel analiz için izin.

Damlacık dijital tuzak (ddTRAP): telomere tekrar amplifikasyon protokolünün droplet dijital polimeraz zincir reaksiyonuna adaptasyon

İndüklenebilir bir transgenik soy izleme fare çizgisi kullanarak kök hücreleri ve soylarını bir florofor ile kalıcı olarak işaretleme yeteneği, in vivo aktivasyon, proliferasyon, göç ve / veya farklılaşmanın mekansal ve zamansal analizine izin verir. Soy izleme, soy bağlılığı, müdahaleye yanıt ve çok potansiyelli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Yetişkin Fare Beynindeki İndüklenebilir Floresan Etiketli Kök Hücrelerin Soy İzi

Öğrenin fare beyninde telomeraz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan TRAP yöntemini. Bu teknik, farklı beyin bölgelerinde ve cinsiyetler arasındaki aktivite farklılıklarını incelemek için zaman ve maliyet açısından etkilidir.

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi (Video) | JoVE Journal

Fare Beyin Çeşitli Bölgelerinde Telomeraz Aktivite: Radyoaktif olmayan Telomeraz Amplifikasyon Protokolü tekrarlayın (TRAP) Deneyi

Daha fazla video keşfet