Düz zeminli Hava kaldırdı Platform: Yeni Bir Yöntem Awake üzerinde Mikroskopi veya Elektrofizyoloji ile davranışı birleştiren için serbestçe Kemirgenler Hareketli
29 Haziran 2014
Bu yöntem, gezinmek ve hayvanın başının sağlam tespiti gerektiren mikroskobik görüntüleme veya tek hücreli elektrofizyolojik kayıtlar sırasında keşfetmek fare için somut, tanıdık bir ortam yaratır.
Merhaba, ben Hel Lin, Helsinki Üniversitesi Yakın Bilim Merkezi'nde yüksek lisans öğrencisiyim. Bugün meslektaşlarım ve ben size uyanık kafa düzeltmede optik ve elektrofizyolojik kayıtların nasıl yapılacağını göstereceğiz, aksi takdirde serbest hareket eden ve hayvanlar gibi davranan hayvanlar. Yöntemimiz, farenin gezinmesi ve keşfetmesi için somut, tanıdık bir ortam yaratır.
Hayvanın kafasının sıkı bir şekilde sabitlenmesini gerektiren mikroskobik görüntüleme veya tek hücreli elektrofizyolojik kayıtlar sırasında, kronik bir kafatası penceresi implante ediyoruz ve fareyi, hayvanın ayaklarının altında kayan, havayla kaldırılmış bir mobil ev kafesine alıştırıyoruz. Düz bir yüzey üzerinde hareket sırasında, mobil ev kafesi, iki foton görüntüleme için standart bir dik mikroskop altına yerleştirilebilir veya bir uyanık fare beyninde yama kelepçesi kayıtları için bir elektrofizyoloji kurulumuna yerleştirilebilir. Burada sunulan tüm deneysel prosedürler yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır.
Kraniyal pencere implantasyonu üzerine küçük değişikliklerle kranial pencereleri yayınlanmış protokollere göre implante ediyoruz. Bu iyileşme döneminde hayvanın en az iki veya üç hafta iyileşmesine izin verilir, pencere normalde şeffaflığını geri kazanır. Ameliyat sonrası herhangi bir kalıntı inflamasyon belirtisi olan hayvanlar deneylerden çıkarılır.
Bir çalışma için seçilen hayvanları, kafa fiksasyonuna alıştırmak için eğitin. Mobil ev kafesinde, fareyi beş ila 10 dakika sakince tutun, ani hareketlerden ve seslerden kaçının, ardından ev kafesine geri koyun. İşlemi eşit olmayan aralıklarla iki veya üç kez tekrarlayın.
Mobil ev kafesi, kafa fiksasyonundan önce hayvanı uyuşturmadan kafa fiksasyonuna izin verir. Fareyi eşit olmayan aralıklarla iki veya üç kez sarmak için bir bez kullanın. Hayvanın sarılırken sakin kaldığından emin olun.
Aksi takdirde, fare tamamen alışana kadar işlemi tekrarlayın. Farelerin günde iki kez mobil ev kafesi üzerindeki eğitimine, elleçleme tamamlandıktan sonraki gün başlayın. Her antrenman seansından önce hayvanları tartın.
%10'un üzerinde kilo kaybı gösteren hayvanlar çalışma dışı bırakılmalıdır. Baş sabitleme kolunun konumunu, eğitilen hayvanın boyutuna uyacak şekilde ayarlayın. Mobil ev kafesi cihazının hava girişini standart laboratuvar basınçlı hava çıkışına bağlayın.
Hava basıncının, havayla kaldırılan ev kafesinin serbest yüzdürülmesi için yeterli olduğundan emin olun. Mobil ev kafesinde alışılmış hayvanların eğitimine başlayın. Fareyi paçavra sararak hareketsiz hale getirin.
Hayvanın kafasına takılan metal tutucuyu kafa sabitleme koluna yerleştirin ve vidaları sıkarak sıkıca sabitleyin. Havayla kaldırılan ev kafesinin havaya kalkmasını sağlamak için hava akışını açın. Paçavrayı çıkarın ve farenin ev kafesini keşfetmesine izin verin.
İlk eğitim seansı sırasında, fareler donma ve titreme davranışı ve kuyruk ereksiyonu sergileyebilir. Hayvanı gürültüye alıştırmak için, örneğin tüm eğitim oturumları sırasında ve deneyler sırasında bir radyo çevirisi veya kaydedilmiş müzik ve konuşma kullanarak ortam seslerine sürekli maruz kalmasını sağlayın. Kronik stresi önlemek için, egzersiz seansının ilk saatinde parlak ışıklı aydınlatma kullanın.
İlk saatten sonra, karanlıkta eğitim yapın ve hayvanın davranışını izlemek için yakın kızılötesi bir kamera kullanın. Eğitim seansı tamamlandığında, vidaları kaybederek hayvanı baş sabitleme kolundan serbest bırakın. Bir sonraki eğitim seansından önce hayvanı en az iki saat ev kafesine geri koyun.
Fareyi iki veya daha fazla fareyle birlikte bir kafeste tutmak stres seviyesini azaltacaktır. İsteğe bağlı olarak, hava asansörlü kafesi hayvanla birlikte ev kafesine yerleştirebilirsiniz. Bu, çevreyi zenginleştirecek ve hayvanın mobil ev kafesine yerleşimini güçlendirebilir.
Son eğitim seansı sırasında, fareler kafa fiksasyonuna alıştırılır ve havaya kaldırılmış ev kafesinin etrafında sakince gezinirken Stressiz davranış sergilemelidir. Görünür ışığın yokluğunda, fare hareketinin yörüngesi, kafes hareketleri yakın kızılötesi kamera veya optik bilgisayar faresi ile izlenerek izlenebilir. Bir veya iki saatten fazla süren uzun süreli eğitim seansları sırasında, fareye manuel olarak veya mobil ev kafesi çerçevesine bağlı bir pipet tutucu kullanarak bir içme suyu sağlamayı düşünün.
Aşağıdaki diyagram, tipik bir deneysel çalışmanın zaman çizelgesini özetlemektedir. Çalışma, fare kullanımından iki hafta önce kraniyal pencerenin implantasyonu ile başlar ve günde iki kez sekiz eğitim seansı ile devam eder. Tipik çalışma, birkaç saat ila birkaç gün veya hafta arasında aralıklarla yapılan bir dizi görüntüleme seansı veya yama kelepçesi kayıt seanslarını içerir.
Hem optik hem de elektrofizyolojik deneyler, bilişsel veya davranışsal uyaranlar ve okumalarla paralel olarak yapılabilir. İki foton mikroskobu, bir kemirgen beyninin derin kortikal katmanlarındaki hücresel ve hatta hücre altı yapıların gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan benzersiz bir doğrusal olmayan optik teknolojidir. İki fotonlu mikroskobik görüntüleme deneyi yapmak için, eğitimli bir hayvanı mobil ev kafesine yerleştirin, mikroskop optiklerini kazara hasardan korumak için tıpaları ayarlayın.
Toz parçacıklarını temizlemek için kafatası penceresinin kapak camını temizleyin. Kapak camına bir daldırma sıvısı bırakın. Su hızla buharlaştığı için viscus solüsyonu kullanmanızı öneririz.
Platform, floresan mikroskobunun geniş alan modu ve uzun geçiren bir emisyon filtresi kullanılarak tipik bir motorlu optik masanın üzerine yerleştirilebilir. Beyin damar sistemini değerlendirin ve ilgilendiğiniz bir bölge seçin. Kortikal vaskülatürü görüntülemek için, kafası sabitlenmiş ve hareketsiz hale getirilmiş bir hayvanın kuyruk damarına enjekte edilir, 70 kiloluk bir Dalton, Texas kırmızı konjuge metin Tran.
Bu görüntü dizisi, davranan bir farenin mobil ev kafesinin etrafında gezinirken korteksindeki mekanların ve arterlerin hızlandırılmış kaydını gösterir. Damar lümeni boyunca çizilen çizgilerin profilini çizerek, damar çapındaki değişiklikler ve tek tek damar segmentlerinin motilitesi ölçülebilir. Atardamar ve toplardamarlardaki kan akış hızı, damar duvarına paralel olarak çizilen çizgiler boyunca çizgi taraması ile ölçülebilir. İyi.
Nöron morfolojisinin ayrıntıları, Tayvan promotörü altındaki nöronların alt popülasyonunda YFP'yi eksprese eden transgenik farelerde görselleştirilebilir. Bu iki Zack, anestezi uygulanmış ve uyanık hayvanlar arasındaki görüntüleme stabilitesini karşılaştırır. Sağ yan panel, ketamin ksilazin karışımı ile uyuşturulmuş hayvandan elde edilen dendritleri gösterir.
Sol yan panel, bir mobil ev kafesinin etrafında yürüyen uyanık bir hayvanda bir dendrit görüntüsü gösterirken. Uyanık hayvanlardaki bireysel omurga morfolojisi, anestezi uygulanmış farelerde olduğu gibi aynı güvenilirlik ve hassasiyetle analiz edilebilir. Hayvanlar koşarken beynin yer değiştirmesi tipik olarak bir ila bir buçuk mikrometreyi geçmez.
Bu hareketler yatay yönlerde meydana gelir ve çok nadiren görüntüleme düzleminin kaymasına neden olur ve hareket artefaktlarının düzeltilmesini gereksiz kılar. Çoğu durumda, uyanık canlı beyindeki nöronal aktiviteyi kronik olarak izleme yeteneği, sinir sisteminin organizasyonunu ve işlevini anlamak için gereklidir. Bir G Kampı üç transgenik fareyi kullanarak, mobil ev kafesinde davranan uyanık farelerde spontan nöronal aktiviteyi görüntülüyoruz.
Bu hızlandırılmış görüntü dizisi, nöronal hücre gövdelerinde, nitlerde ve aksonlarda kalsiyum artışlarının temsili örneklerini göstermektedir. İçsel sinyallere dayalı optik görüntüleme, içsel bir optik görüntüleme deneyi gerçekleştirmek için işlevsel alanların uzamsal dağılımının haritalanmasına izin verir. Eğitilmiş hayvanı, kamera objektifinin altına yerleştirilmiş ev kafesine yerleştirin.
Kapak camını tozdan temizleyin. Bir damla gliserol koyun ve beş milimetrelik yuvarlak bir kapak kayması. Yüksek hızlı bir kameranın konumunu ayarlayın.
Kontralateral vibrasyonun karşısına hava üfleme tüpü olan bir manipülatör yerleştirin. Gemi haritasını görüntülemek için yeşil ışıkları kullanın. Kortikal damarların yaklaşık 400 mikrometre altında, korteksin daha derinlerine odaklanın.
Kameranın önüne bir bant geçiren filtre yerleştirin ve korteksi kırmızı ışıkla aydınlatın. Farenin en az 30 dakika platforma uyum sağlamasına izin verin. Altı dakikalık bir bölüm boyunca temel etkinliği kaydedin.
Toplam altı dakikalık süre boyunca her 10 saniyede bir hava üfleme ile titreşimi uyarın. Bu görüntü, 0.05 hertz frekansında titreşim stimülasyonuna yanıt olarak somatosensoriyel korteks boyunca yayılan nöral aktiviteyi göstermektedir. Tek hücreli elektrofizyolojik kayıtlar yapmak için, ters çevrilmiş bir kafatası penceresi ile implante edilmiş eğitimli hayvanı mobil ev kafesine yerleştirin.
Kapak camını yavaş ve dikkatli bir şekilde metal tutucudan çıkarın. Kortikal tamponu yenileyin ve kraniyal pencereyi hemostatik bir tamponla döküntülerden temizleyin. Toprak elektrodunu kortikal tampona yerleştirin.
Yama kelepçesi pipetini hücre içi çözelti ile doldurun. Motorlu bir mikro manipülatör kullanarak kayıt pipetine pozitif bir basınç uygulayın, pipeti kortekse derinleştirin ve ilgilenilen hücre ile giga contalı bir temas elde edin. Kayıttan sonra pipeti çıkarın, kortikal tamponu yenileyin ve bir kapak camında metal tutucuya yapıştırarak kraniyal pencereyi kapatın.
Hava asansörlü bir ev kafesinin kullanılması, görüntüleme ve elektrofizyolojinin öğrenme, rehabilitasyon veya kaygı ile ilgili davranış gibi klasik davranış paradigmalarıyla birleştirilmesine izin verir. Koku alma, fareler için önemli bir duyusal girdidir ve hafıza testlerinde stimülasyon ve yeniliğe tepkinin değerlendirilmesi için kullanılabilir. Koku alma testi yapmak için, eğitimli hayvanı mobil ev kafesine yerleştirin ve evlat edinmesine izin verin.
30 dakika boyunca, musluk suyuna batırılmış temiz bir pamuk parçasını iki taraflı yapışkan bir bant kullanarak mobil ev kafesinin iç duvarına yapıştırın. Beş dakika sonra, ev kafesi duvarındaki temiz pamuğu, vanilya kokusu içeren bir sıvıya batırılmış yenisiyle değiştirin. Vanilya kokusuna beş dakikalık maruziyetleri, seanslar arasında beş dakikalık aralıklarla üç kez tekrarlayın.
Kokuya olan ilgi düzeyini ölçmek. Hayvanın hedef bölgeye bakacak şekilde geçirdiği kümülatif süreyi ve mobil ev kafesi hareketinin toplam süresini sayın. Son beşinci seansta, sosyal olarak önemli bir koku sunun.
Yeni pamuk aplikatörünü karşı cinsten farelerden birkaç damla idrarla ıslatın. Yeniliğe verilen tepkiyi değerlendirmek için, mobil ev kafesini dört bölgeye ayırın. Birbirine zıt iki pamuk parçası takın. Renk.
İlk deneme sırasında bunları ev kafes duvarlarının dış tarafındaki işaretleyicilerle kodlayın. İki temiz pamuk parçası yerleştirin. Daha sonra her ikisini de %1 vanilya özütüne batırılmış pamukla değiştirin.
Üçüncü deneme sırasında, vanilya pamuğunu bir numaralı bölgeye ve %1 muz özüne batırılmış pamuk parçasını bölgeye koyun. İkincisi, koku almama tercihini ölçmek için. Hayvanların koku almamak için harcadıkları zamanı, diğer bölgelere karşı karşıya kalan kümülatif sürenin yüzdesi olarak hesaplayın.
Merhaba, ben Leo Kiro, Helsinki Üniversitesi Nörobilim Merkezi'nde baş araştırmacıyım. Umarım videoyu izlemekten keyif almışsınızdır ve faydalı bulmuşsunuzdur. Son beş yıldır in vivo mikroskopi üzerinde iki yönlü çalışıyoruz ve genel ve estetiğin kullanımı her zaman büyük bir endişe kaynağı olmuştur çünkü estetik beyin fonksiyonuna, kan akışına ve her şeye müdahale eder.
Ve bugün, uyanık hayvanlarda çalışabildiğimiz ve stabil mikroskobik görüntüleme deneyleri yapabildiğimiz ve daha önce anestezi uygulanmış hayvanlarda elde ettiğimiz sonuçları doğrulayabileceğimiz ve doğrulayabileceğimiz için mutluyum. Mobil ev kafesinin kullanımının ve bugün sunduğumuz yöntemlerin genel olarak in vivo araştırmaların alaka düzeyini artıracağından ve yeni ve çığır açan sonuçlara yol açacağından eminim ve bunu dört gözle bekliyorum.
Genel Bakış
Bu yöntem, mikroskobik görüntüleme veya tek hücreli elektrofizyolojik kayıtlar sırasında farelerin gezinmesi ve keşfetmesi için somut, tanıdık bir ortam yaratır ve hayvanın kafasının sağlam bir şekilde sabitlenmesini gerektirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Elektrofizyoloji
- Mikroskopi
Arka Plan
- Kafanın sabitlenmesi, doğru görüntüleme ve elektrofizyolojik kayıtlar için gereklidir.
- Kronik kafa pencereleri, beyin aktivitesinin uzun süreli gözlemini sağlar.
- Deneysel kuruluma alıştırma, hayvanlarda stresi azaltmak için önemlidir.
- İki-foton mikroskobu, hücresel yapıların in vivo görselleştirilmesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Uyanık, hareket halindeki farelerde optik ve elektrofizyolojik kayıtlar yapılması için bir yöntem geliştirmek.
- Deneyler sırasında stresi en aza indiren tanıdık bir ortam yaratmak.
- Davranışsal uyaranlara tepki olarak beyin aktivitesinin çalışılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kronik kafa penceresinin implantasyonu.
- Kafanın sabitlenmesi için mobil ev kafesinin kullanılması.
- Fareleri mobil ev kafesine alıştırmak için eğitmek.
- Davranış sırasında iki-foton görüntüleme ve patch clamp kayıtları.
Ana Sonuçlar
- Fare, kayıtlar sırasında mobil ev kafesinde başarılı bir şekilde gezindi.
- Anestezi olmadan kafa sabitlenmesi sağlandı, doğal davranışa izin verildi.
- İki-foton mikroskobu, beyin vaskülatürünün gerçek zamanlı görüntülemesini sağladı.
- Hayvanlar, alıştırma eğitiminden sonra daha düşük stres seviyeleri gösterdi.
Sonuçlar
- Bu yöntem, beyin fonksiyonunun daha doğal bir ortamda çalışılmasını sağlar.
- Alıştırma eğitimi, stresi en aza indirmek ve veri kalitesini artırmak için kritik öneme sahiptir.
- Görüntüleme ve elektrofizyolojinin kombinasyonu, sinir dinamiklerinin anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables stable, high-resolution imaging and electrophysiology in awake, behaving rodents, addressing a critical limitation in preclinical neuroscience where anesthetic confounds reduce translational relevance. By combining behavioral paradigms with cellular-level readouts, it supports mechanistic de-risking of therapeutic targets involved in cognition, sensory processing, and neural circuit function. The approach enhances predictive confidence in early discovery by aligning animal model data with naturalistic brain states.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in neural circuits without anesthetic-induced confounds on neuronal activity or neurovascular coupling.
- Operational Value: Supports functional validation of targets involved in learning, memory, and sensory processing through concurrent behavior and physiology monitoring.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized platform for quantifying neuronal and vascular responses to behavioral stimuli, enabling assay readiness for compound screening.
- Operational Value: Facilitates reproducible, longitudinal measurements of brain function across days or weeks, supporting assay stability and cross-session comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical validation by allowing chronic monitoring of neuronal dynamics in disease-relevant behavioral contexts.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing biological variability introduced by anesthesia or restraint.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling iterative refinement of targets based on behaving-animal physiology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by linking cellular activity to naturalistic behaviors such as exploration and habituation.
- Screening: Enables quantitative, behavior-linked readouts (e.g., calcium fluxes, vascular dynamics) for evaluating compound effects on neural circuit function.
- Analytics: Generates spatiotemporal maps of neuronal and vascular activity that inform dose-response and target engagement assessments.
- Translational Research: Enhances continuity to preclinical models by preserving ethological relevance in neural readouts.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, platform-compatible capability for repeated use across multiple projects and imaging modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive validity of preclinical data by capturing brain function in awake, behaving states.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through habituation protocols and stable head fixation without anesthesia.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-aware prioritization of targets based on functional relevance in naturalistic brain circuits.
Implementation Considerations
- Expertise in neurosurgical techniques such as chronic cranial window implantation and head plate attachment.
- Access to two-photon microscopes, electrophysiology rigs, and environmental control systems for airflow and monitoring.
- Standardized training protocols for animal habituation to minimize variability across operators and studies.
- Adaptation considerations for different mouse strains, ages, and behavioral paradigms.
- Practical limitations include the need for prolonged training periods and careful monitoring of animal health and weight during habituation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:12
Cranial Window Implantation
1:33
Training
5:35
Applications: Two-photon Microscopy Imaging
8:41
Applications: Intrinsic Optical Imaging
9:59
Applications: Electrophysiology
10:54
Behavioral Experiments
11:08
a) Habituation-dishabituation Olfactory Test
12:17
b) Reaction to Novelty
13:03
Conclusions
