Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir
30 Eylül 2014
Streptococcus pneumoniae'deki rekabete, pnömokok ve diğer ilgili türlere karşı inhibe edici aktiviteye sahip bakteriyosinler, küçük antimikrobiyal peptitler aracılık eder. Burada, bakteriyosin aktivitesinin ve inhibitör spektrumun karakterizasyonuna, bakteriyosine özgü bağışıklığa ve salgılanan çekirdek algılama peptitlerinin saptanmasına izin veren optimize edilmiş bir bakteri kaplama testini açıklıyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, bindirme tahlili kullanılarak streptococcus pnömonisinin bakteri ve aktivitesini görselleştirmektir. Bu, önce üretici suşunun bir TSA plakasına bıçaklanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, kaplama gerinim karışımı hazırlanır ve daha sonra kademeli üretici gerinimini içeren TSA plakasına yavaşça pipetlenir.
Son adımda, bakteri aktivitesi değerlendirilir. Sonuç olarak, bindirme testi, bıçaklanmış ilgilenilen suş tarafından bakteri inaktivitesini, inaksiyonunu veya feromon üretimini göstermek için kullanılabilir. Bu tekniğin, Bacterin'in doğrudan saflaştırılması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin bir dizi bakteri, hareketsizlik ve üretimdeki bakteriler için birden fazla suş taramanın hızlı bir yolu olmasıdır.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Natalie Marchek olacak: Üreticideki bakterileri hazırlamak için, ilgilenilen pnömokok suşunu %5 koyun kanı TSA plakasına çizerek başlayın ve plakayı gece boyunca %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, 25 mililitre TSA içeren plakalara 3000 ila 4.000 birim katalizör pipetleyin ve katalizörleri plakalara yaymak için steril cam boncuklar kullanın. Plakaları biyolojik bir güvenlik kabini altında yaklaşık 10 dakika kurumaya bıraktıktan sonra, bir pipet ucuna görünür miktarda bakteri toplayın ve pipet ucunu kurutulmuş TSA plakasına saplayın.
Mümkünse, pozitif kontrol olarak bilinen bir bakteri günah üreticisini ve negatif kontrol olarak kaplamada kullanılacak suşu dahil edin, böylece büyüme halelerinin üst üste gelmemesi için bıçaklar arasında yeterli boşluk sağlayın. Daha sonra, bıçak kültürlerini% 5 karbondioksit ile% 37 santigrat derecede, kaplama testinden bir gün önce altı saat boyunca inkübe edin,% 0.5 maya özütü içeren beş mililitre THY ortamı içeren cam tüplerde test edilmek üzere pnömokok suşunun beş ila 10 kolonisini aşılayın. Daha sonra bu gliserol suş kültürlerinin kapaklarını kapatın ve çalkalamadan 37 derecelik bir su banyosunda inkübe edin.
Dört ila beş saat sonra, tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirin ve ardından od'yi ölçün. Kültürler 0.3 ila 0.5'lik bir OD iki 60'a ulaştığında,% 20'lik bir nihai konsantrasyona gliserol ekleyin, ardından kültürleri 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine ayırın ve tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ertesi sabah, oda sıcaklığında bir gliserol stoğu alikotunu çözün.
Daha sonra kaplama uygulamasından hemen önce, 15 mililitrelik konik bir tüpte beş mililitre THY 3000 ila 4.000 birim katalizör ve 200 mikrolitre gliserol stoğunu karıştırın. Raportör bakteri suşları için, plaka başına bir konik tüp kullanarak kaplama karışımına 50 mikrolitre Xcel ekleyin. Karışım bir mikrodalgada eriyen katı TSA'yı dengelerken kaplama karışımını oda sıcaklığına yerleştirin ve ardından 55 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.
Erimiş TSA 55 santigrat dereceye kadar soğuduğunda, kaplama karışımına hızlı bir şekilde üç mililitre TSA ekleyin ve beş mililitrelik bir pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Kabarcık oluşturmamaya dikkat edin, ardından kaplama karışımını doğrudan bıçaklanmış TSA plakasına yavaşça pipetleyin. Birkaç dakika sonra, plaka sertleştiğinde ve plakayı döndürmeden, üzerine bindirilmiş bıçak kültürünü, gece boyunca kültür için inkübatöre dikkatlice geri yerleştirin.
Ertesi sabah gece boyunca büyümeyi gözlemleyin. Plakalar, inhibisyon veya feromon sinyalinin meydana geldiği alanlar dışında, kaplama suşunun büyümesinden opak görünmelidir. Bu temsili deneyde bindirme tahlili için iki olası sonuç vardır.
Gece boyunca kültürden sonra, bıçaklanmış suşu çevreleyen bir boşluk bölgesi gözlendi, bu da bu kaplama suşunun üretilen bakteri sinlerine duyarlı olduğunu gösteriyor. Ayrıca, bıçaklanmış suşun kaplama karışımına girdabına da dikkat edin. Bu deneyde, kaplama suşu, bıçağı çevreleyen bir halenin olmaması ile gösterildiği gibi bakterinin salgılanmasına karşı bağışıktı.
Bıçaklanan suşun sinyal tahlili için bakterin salgılamaması da mümkündür. İki farklı sonuç mümkündür. Bu deneyde, bıçaklanmış suş, bu görüntüde xal'ın parçalanmasını gösteren mavi bölge tarafından gözlemlendiği gibi, bindirme suşunun histidin kinazı ile etkileşime giren bir feromon salgıladı.
Feromon, raportörün suşunda BLP lokusunun transkripsiyonunu aktive etmezse veya bıçaklanan suş bir feromon salgılamazsa, bu prosedürden sonra bu görüntüde gözlemlendiği gibi X ölçeğinin bozulması meydana gelmez. Mutasyon analizi veya dizileme gibi diğer yöntemler, herhangi bir kayda değer inhibitör aktivitenin BLP lokusuna atfedilip atfedilemeyeceği veya taşıyıcı gendeki bir mutasyonun bir sonucu olarak aktivite eksikliği olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Streptococcus pneumoniae aktivitesini görselleştirmek için optimize edilmiş bir bakteriyel overlay (üst katman) analizini açıklamaktadır. Analiz; bakteriyosin aktivitesinin ve immünitenin karakterizasyonuna ve quorum sensing peptidlerinin tespitine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Antimikrobiyal peptidler
- Bakteriyel rekabet
Arka Plan
- Streptococcus pneumoniae, bakteriyosinleri kullanarak rekabet eder.
- Bakteriyosinler küçük antimikrobiyal peptitlerdir.
- Bakteriyosin aktivitesinin anlaşılması, tedavi stratejilerine bilgi sağlayabilir.
- Korum algılama (quorum sensing), bakteriyel iletişimde rol oynar.
Çalışmanın Amacı
- Bir overlay deneyi kullanarak bakteriyel aktiviteyi görselleştirmek.
- Bakteriyosin aktivitesini ve inhibisyon spektrumunu değerlendirmek.
- Korum algılama (quorum sensing) peptitlerini tespit etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Üretici suşun bir TSA plağına ekilmesi.
- Üst katman suş karışımının hazırlanması ve uygulanması.
- Üst katman uygulamasının ardından bakteriyel aktivitenin değerlendirilmesi.
- Bu yöntemin doğrudan saflaştırma teknikleriyle karşılaştırılması.
Temel Sonuçlar
- Overlay analizi, bakteriyel inaktiviteyi etkili bir şekilde göstermektedir.
- Birden fazla suşun hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanır.
- Üretici suş tarafından feromon üretimini kanıtlar.
- Mevcut yöntemlere hızlı bir alternatif sunar.
Sonuçlar
- Optimize edilmiş overlay deneyi, bakteriyosinlerin incelenmesi için değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, bakteriyel etkileşimlerin anlaşılmasını geliştirir.
- Antimikrobiyal stratejilere yönelik daha ileri araştırmaları kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygunluk Özeti
Overlay deneyi, bakteriyel suşların bakteriyosin üretimi ve duyarlılığı açısından hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanıyarak antimikrobiyal keşiflerde erken evre hedef doğrulamasını destekler. Rekabetçi etkileşimleri ve quorum sensing sinyallerini görselleştirerek bu yöntem, öncü bileşiklerin belirlenmesi ve antimikrobiyal adayların risklerinin azaltılmasına ışık tutabilecek bakteriyel rekabete dair mekanistik içgörüler sağlar. Bu yaklaşım, kaynak yoğun saflaştırma veya karakterizasyon çalışmalarına yatırım yapmadan önce, terapötik potansiyele sahip suşların veya yolakların önceliklendirilmesine yardımcı olur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bakteriyosin üretimini polimikrobiyal ortamlardaki kompetitif uygunlukla ilişkilendirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Peptit saflaştırmasına gerek kalmadan, blp lokusunun bakteriyel antagonizmanın bir belirleyicisi olarak fonksiyonel validasyonunu sağlar.
- Öngörücü Değer: Daha ileri mekanistik risk azaltma çalışmaları için aktif bakteriyosin sekresyonu yapan suşları belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bakteriyosin aktivitesini ve immünite profillerini doğrulayarak, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki antimikrobiyal tarama aşamaları için hazırlar.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir karşılaştırmalı analizler için birden fazla suşta kalitatif okumaları (inhibisyon zonları, feromonla indüklenen reporter sinyalleri) standartlaştırır.
- Ölçeklenebilirlik Değeri: Suş kütüphanelerinin yüksek kapasiteli değerlendirmesini kolaylaştırarak, assay optimizasyonu için üreticilerin ve hassas indikatörlerin hızla tanımlanmasını sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: Suşa özgü inhibisyon spektrumlarını ve bağışıklık sisteminden kaçış mekanizmalarını karakterize ederek, keşif aşamasındaki bakteriyosin aktivitesini preklinik uygunlukla ilişkilendirir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Gözlemlenen inhibisyonun blp lokusundan kaynaklanıp kaynaklanmadığını netleştirerek, antimikrobiyal hit doğrulamadaki yanlış pozitifleri azaltır.
- Biyobelirteç Uyumu: Doğal ortamlarda yolak aktivasyonu için translasyonel biyobelirteçler olarak hizmet edebilecek salgılanmış quorum sensing peptidlerini tespit eder.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Overlay deneyi, hedef doğrulama aşamasındaki hipotez testlerini destekleyerek ve antimikrobiyal peptitlere odaklanan öncü bileşik belirleme iş akışları için analiz hazırlığını sağlayarak, erken keşif sürecine entegre olmaktadır.
- Keşif Biyolojisi: Bakteriyosin aracılı inhibisyonu ve suşa özgü duyarlılık kalıplarını görselleştirerek bakteriyel rekabet mekanizmaları hakkındaki hipotezleri test eder.
- Tarama: Bakteriyosin üreticilerini hedefleyen tarama kampanyaları için analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirliği hakkında bilgi veren kalitatif aktivite çıktıları oluşturur.
- Analitik: Koşulları karşılaştırmak ve yolak modülasyonunu izlemek için inhibisyon zonu oluşumu ve raporcu gen aktivasyonu (örneğin, lacZ parçalanması) gibi ölçülebilir çıktılar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Klinik veya çevresel izolatlarda blp lokusunun işlevselliğini değerlendirerek, bakteriyosin sekresyonuna dair laboratuvar gözlemlerini potansiyel in vivo geçerlilikle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı suş panellerinde bakteriyosin aktivitesini değerlendirmek için yeniden kullanılabilir bir tarama platformu kurarak tekrarlayan yöntem geliştirme süreçlerini azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bakteriyosin aracılı rekabetle ilgili mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar arası kalitatif antimikrobiyal aktivite değerlendirmelerinin tekrarlanabilirliğini ve standardizasyonunu geliştirir.
- Stratejik Değer: Yalancı-negatif üreticileri veya bağışıklık kazanmış suşları hızla tanımlayarak, erken evre antimikrobiyal programlardaki devam/durdurma kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Kanıtlanmış bakteriyosin fonksiyonelliği ve duyarlılık profillerine dayalı olarak suşların veya lokusların riskten arındırılmış önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Kontaminasyonu önlemek ve zon yorumlamasının doğruluğunu sağlamak için anaerobik bakteri işlemleri ve steril üst katman (overlay) teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- TSA plaklarına, THY besiyerine, lacZ-reporter suşlarına ve kontrollü inkübasyon ortamlarına (37°C, %5 CO2) erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar arasında tekrarlanabilir inhibisyon veya sinyal okumaları sağlamak için batırma derinliğinin, üst katman hacminin ve inkübasyon sürelerinin standartlaştırılması gerekir.
- Analiz yeni genetik arka planlara veya türlere uyarlanırken, suş büyüme kinetiğindeki ve feromon salgılanma zamanlamasındaki değişkenlikler dikkate alınmalıdır.
- Kalitatif veya yarı-kantitatif çıktılarla sınırlıdır; blp lokus bağımlılığını veya taşıyıcı fonksiyonelliğini doğrulamak için tamamlayıcı yöntemlere (örneğin, mutajenez, sekanslama) ihtiyaç duyulur.
