Name: Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Öğrenin bakteriyosin aktivitesini ve bağışıklığını Streptococcus pneumoniae'de kaplama testi ile görselleştirmeyi. Bu yöntem, bakteriyel rekabeti ve antimikrobiyal stratejileri hızla taramak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Elizabeth E. Kennedy Araştırma Ödülü tarafından desteklenmiştir.

Yapımcı Genleme 1. Hazırlık <ol><li> Şerit, bir pnömokok kökenli soyu -80 ° C dondurucu stoktan% 5 koyun kanı triptik soya agar plakası üzerine bakteriyosin üretimi için test edilecek. Not: inhibisyonu için test edilecek olan soyun ilk büyüme kan plakaların kullanımı büyük ölçüde tahlilin tekrarlanabilirliğini arttırır. Büyüme koşulları, belirli bir organizmanın değiştirilmesi gerekebilir, ancak ek olarak, bakteriyosin üreten diğer non-pnömokok suşları kullanılabilir. Biz başarıyla yayma deneyi Streptococcus mitis ve Lactococcus lactis kullandık. </li><li> % 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de gece boyunca plaka (O / N) inkübe edin. </li><li> Üretici soyunun inkübasyondan sonra, TSA 25 ml ihtiva eden plakalar üzerine katalaz 3000 ila 4000 birimleri pipetleme triptik soya agar (TSA) plaka hazırlanması yapılmış ve steril cam boncuklar kullanılarak katalaz çözeltisi yayıldı. Yaklaşık 10 dakika altında plaka kurumasını bekleyinbiyolojik güvenlik kabini. </li><li> Bir pipet üzerine bakteri görünür bir miktar toplayın. Kurutulmuş TSA plakasına pipet bıçakla. NOT: Bir üretici suş daha fazlası tek bir TSA plakaya bıçakladı edilebilir. Oluşan haleler örtüşmeyen böylece bıçaklandığı uzayda önemlidir. <ol><li> Mümkünse, bir pozitif kontrol ve bir negatif kontrol olarak, kaplamayla kullanılacak soyu gibi bir üretici bakteriyosin bilinen maddeleri içerir. NOT: Pozitif ve negatif kontroller daha önce yayınlanmış ve istek 10 üzerine mevcuttur. </li></ol></li><li> 6 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C &#39;de birden fazla saplamanız içeren TSA plaka inkübe edin. </li></ol> Bindirme Genleme 2. Yapımı Gliserol Stokları <ol><li> Yayma deneyi bir gün önce (gliserol ilave edildikten sonra orta üslü faza kadar yetiştirilir ve daha sonra -80 ° C&#39;de saklandı kültürler), gliserol stokları hazırlayın. Pnömokok str 5-10 koloni aşılamakain% 0.5 maya ekstraktı (THY) Todd-Hewitt ortamda hassasiyet veya feromon salgılama açısından test edilmelidir. NOT: BlpC uyarılabilir gazetecilere İnşaatı daha önce 2 tarif edilmiştir ve suşları istek üzerine mevcuttur. </li><li> Çalkalamadan 37 ° C su banyosu içinde sıkıca kapalı kapak THY 5 ml cam tüpler içinde 5-10 koloniler inkübe edin. </li><li> Bunlar, bir 0.5, 0.3 OD 620 gelene kadar, 37 ° C kültürleri inkübe edin. NOT: Bu, kullanılan gerginlik bağlı olarak yaklaşık 4-5 saat sürer. <ol><li> Yavaşça tüpü OD ölçme önce bir kaç kez ters çevirin. </li></ol></li><li> Deneme aynı gün yapılamaz veya zorlanma gliserol stoğu yapmak ve daha sonraki bir tarihte deney devam, gelecekte birden çok kez kullanılabilir edilecektir. Gliserol stokları için,% 20 bir son konsantrasyona kadar kültürler gliserol ekleyin. -80 ° C&#39;de 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza içine kısım kültürleri. NOT: Örnekler s olabilir-80 ° C&#39;de ay boyunca yırtılmaktadır. Gliserol stokları yapmıyor ise, yayma deneyi doğrudan örnekleri kullanabilirsiniz. </li></ol> 3. Kaplama Testi <ol><li> Hemen önce, uygulamayı bindirme bindirme bileşenleri karıştırmak için. 15 ml konik bir tüp içinde 5 ml THY, katalaz 3,000-4,000 U ve ya hemen aynı günde ya da oda sıcaklığında eritildi, kültür, bir gliserol stokları yetiştirildi katlamalı soy çorba kültürü 200 ul ilave edin. Raportör suşu kullanılarak, kaplama karışımına, X-gal ve 50 ul (40 mg / ml) ilave edilmektedir. Plaka başına bir konik bir tüp içinde kullanın. </li><li> Önce erimiş TSA ilave edilmeden önce oda sıcaklığında katlamalı karışımı dengelenmesi. </li><li> Inkübatör bıçaklanarak zorlanma ile TSA plakasını sökün. Mikrodalga katı TSA eritin ve kullanmaya hazır olana kadar 55 ° C su banyosunda tutmak. % 1.5 agar erimiş TSA 3 ml ekleyin karışımı katlamalı 55 ° C&#39;ye kadar soğutuldu. <ol><li> Pipetlemeden önce hemen bindirme karışım hazırlayın, karışım çok katılaşmaya başlayacaktırhızlı. NOT: bindirme kaplama önce katılaşmaya başlar, sonuçlar uninterpretable olacaktır. </li></ol></li><li> Pipetleme ve 5 ml&#39;lik pipet karışımın içine kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olmak ile birkaç kez aşağı bindirme karışımı karıştırın. Yavaşça bıçaklayarak TSA plakasına doğrudan bindirme karışımı pipetle. Agar sertleşmesine izin birkaç dakika için masa üstü plaka tutun. <ol><li> Bindirme karışımı dağıtmak için plakasını döndürmek etmeyin, bu bindirmenin içine bıçakladı kültüründen büyüme çeker. </li></ol></li><li> Dikkatle% 5 CO 2 O / N (yaklaşık 16-18 saat) içeren 37 ° C inkübatör içine kalıbı ile TSA plakasını yerleştirin. </li><li> Gecede büyümeden sonra plakaları gözlemleyin. Plakalar inhibisyon veya feromon sinyal oluştu alanlar haricinde bindirme suşu büyüme opak görünmelidir. Bunlar sırasıyla, bıçaklanarak zorlanma çevresinde net ya da mavi bölgeler olarak görünecektir. NOT: Her ne kadar kuvmavi veya açıklığın çapının enlemeleri, niceliksel değerlendirilmesi için belirlenebilir çapı farklılıklar da plakasına býçaklanmýţ bakteri miktarına bağlı olarak değişebilir. Bindirme tahlil herhangi bir nicel değerlendirme dikkatle yorumlanmalıdır gereken, kalitatif bir testtir. Negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, herhangi bir görünür temizleme aktivite olarak kabul edilir. </li></ol>

<ol><li>Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blp+bacteriocins+of+Streptococcus+pneumoniae+mediate+intraspecies+competition+both+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo.</a> Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).</li>
<li>Sawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+enterocin+W%2C+a+novel+two-peptide+lantibiotic+produced+by+Enterococcus+faecalis+NKR-4-1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).</li>
<li>Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+bacteriocins+and+activity+spectrum+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae.</a> J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).</li>
<li>Reichmann, P., Hakenbeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+variation+in+a+peptide-inducible+two-component+system+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae.</a> FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).</li>
<li>Saizieu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+identification+of+a+novel+Streptococcus+pneumoniae+regulon+controlled+by+an+autoinduced+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide.</a> J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).</li>
<li>Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production%2C+purification%2C+characterization+and+mechanism+of+action+of+salivaricin+9+lantibiotic+produced+by+Streptococcus+salivarius+NU10%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10.</a> PLoS One. 8 (10), 77751(2013).</li>
<li>Wladyka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+biochemical+characterization%2C+and+cloning+of+a+bacteriocin+from+the+poultry-associated+Staphylococcus+aureus+strain+CH-91%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).</li>
<li>Shea, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bactofencin+a%2C+a+new+type+of+cationic+bacteriocin+with+unusual+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity.</a> 4 (6), 00498-00413 (2013).</li>
<li>Son, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+mutations+in+the+pneumococcal+bacteriocin+transporter+gene%2C+blpA%2C+result+in+a+complex+population+consisting+of+producers+and+cheaters%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li>
<li>Kochan, T. J., Dawid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HtrA+protease+of+Streptococcus+pneumoniae+controls+density-dependent+stimulation+of+the+bacteriocin+blp+locus+via+disruption+of+pheromone+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion.</a> J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).</li>
<li>Widdick, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+engineering+of+the+cinnamycin+biosynthetic+gene+cluster+from+Streptomyces+cinnamoneus+cinnamoneus+DSM+40005%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).</li>
<li>Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+two-peptide+lantibiotic%2C+lichenicidin%2C+following+rational+genome+mining+for+LanM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu bindirme tahlil bakteriyosin üreticileri için faaliyet alanını belirlemek ve pnömokok suşları arasında oluşabilecek rekabet etkileşimleri göstermek için hızlı bir yoldur. Bindirme deney, tek bir plaka üzerinde birden fazla bakteriyosin üretimi suşları taranması için kullanmak üzere adapte edilebilir. Başarıyla, 96 oyuklu bir plakanın yarısını SBA plakalarının aşılanması için bir 48 pimli çoğaltıcı kullanarak, bu deneyde büyük gerilme koleksiyon gösterildi. Gece boyunca inkübasyondan sonra, büyüme replikatörü kullanıl...

Streptococcus pneumoniae, nazofarenks polimikrobiyaldir eden ortak bir şekilde koloni, bakteriyel olarak üretilmiş antimikrobiyal peptitler (bakteriosinler) üretimi aracılığıyla diğer pneumococci ve yakından ilişkili türleri ile rekabet edebilmektedir. Bugüne kadar incelenen her tam sıralandı pnömokok suşu b acteriocin- l ike p peptit odağı blp bir sürümünü içerir. Pnömokok bakteriyosin üretimi, hem in vitro ve in vivo sonuç 1-4 rekabet önemli olduğu gösterilmiştir. Rekabetçi dinamikleri, spesifik peptit feromon tepki olarak aynı kökenli bağışıklık proteinlerle birlikte çeşitli bakteriyosinlerin ekspresyonu ile etkilenmektedir. Blp lokusunun indüksiyonu bir peptit feromon, BlpC, sensör kinaz BlpH bağlanan olan bir çekirdek algılama sistemi ile kontrol ve sonuçlanan bir sinyal akışını başlatır edilirblp lokus 5,6 transkripsiyonu. BlpC dört alelik varyasyonlar vardır ki, kendi doğasındaki BlpH 6 her bağlanmaktadır. Hücre, kendi bakteriyosin etkilerini hayatta kalabilmesi için ortak kökenli bağışıklık proteinleri kodlayan genler bakteriyosin genlerin her biri ile aynı operonunun transkribe edilmektedir. Soy korunması için gerekli olan özel gen bağışıklık yetersiz kalması durumunda, bir rakip soyu dışsal feromon tepki olarak blp lokusu yukarı doğru düzenleme mümkün olup olmadığını ya Öldürme oluşur. Taşıyıcı kompleksi, BlpAB salgısı ile işleme peptit feromon ve bakteriyosin peptidler 2,4 için gereklidir. Son zamanlarda, bu pnömokok suşları önemli bir bölümünün de bir durumdur bu feromonu ve bakteriyosin 1,2 salgılamasına hale blpA geninde bir mutasyon korunmuş olması, yani &quot;dolandırıcı&quot; olduğu gösterilmiştir. Bu suşlar kişnemek tarafından salgılanan eksojen BlpC 2 yanıt edebiliyoruzbağışıklık proteinlerin üretimi için izin sıkıcı suşları. Süpernatanlarından bakteriyosinlerin, ham preparatlar saflık elde etmek için biyokimyasal yöntemler kullanılarak adımları Üretici türlerde hazırlanabilir, ancak, bu yaklaşım, büyük izolat koleksiyonlarının taranmasında yararlı değildir ve bakteriyosin ekspresyon seviyesinin suyu büyüyen kültürlerden düşükse 2,7- 9. Bindirme deney in vitro olarak mevcut olabilir suşları arasındaki rekabet dinamiğini incelemek için hızlı bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bunu yapmak için, bir pnömokok soyu önceden aşılanmış agar plaka üzerine ve blp lokusunun uyarılması için yeterli lokal konsantrasyonları elde etmek için bakteriyel büyümeye izin verilir. Ikinci bir soy daha sonra hassasiyeti test etmek için önceden aşılanmış soyu üzerine uygulandığında, erimiş bir yumuşak agar çözeltisi içine aşılanır. (Inhibe edici aktivitesi bağımsız olarak) blp lokusunun değerlendirmek aktivitesi için, suşlar th bir dizi ile kaplanabilirDaha önce tarif BlpC haberci soylarını ree. Bu suşlar, pnömokok tarafından salgılanan en yaygın üç BlpC feromonlar yanıt üç farklı blpH allellerinden biri içeren yapılmıştır. Haberci soylarının bir BlpH bağımlı promotörün kontrolü altındadır ve kendini uyarma 10,11 engeller blpC geninde bir delesyon yerine entegre bir lacZ genini sahiptir.

<table><tbody><tr><td>% 5 Koyun Kanı ile Triptikaz Soya Agar</td><td>Fisher</td><td>B21261X</td><td>Dondurucu kültürlerinden büyüme için</td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma</td><td>C100-500mg</td><td>Plaka başına 4.741 Birim</td></tr><tr><td>Todd Hewitt Et Suyu + Maya Özü (THY)</td> <td>Fisher</td><td>DF0492-17-6&nbsp;</td><td>30 g THB, 5 g maya özütü, 1 L ddH2O otoklav</td></tr><tr><td>Triptikaz Soya Suyu + Agar plakaları (TSA)</td> <td>Fisher</td><td>B11768 & nbsp;</td><td>30 g TS, 15 g agar, 1 L ddH2O otoklav</td></tr><tr><td>5-bromo-4-kloro-3-indolil ve beta;-D-galaktopiranosid (X-gal)</td><td>Sigma</td><td>B4252-50MG</td><td>Dimetilformamid</td></tr><tr><td>Petri kaplarında</td> çözün <td>Fisher</td><td>FB0875712</td> Spectrophometer 37 &> <td></td></tr><tr><td></td><td>kültürlerin OD<sub620 değerini ölçer</td>;<td></td><td></td></tr><tr><td> C su banyosu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 & derece; % 5 CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml konik tüplü</td><td></td><td></td><td></td></tr> C inkübatör</tbody></table>

kaplama testi kullanarak niteliksel pnömokok bakteriyosinlerin bakteriyel Üretim ve hassasiyet tedbir

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae, yerleşik organizmalarla rekabet etmesi gereken nazofarenksin çok çeşitli polimikrobiyal topluluğunu kolonize eder. Bakteriyel olarak üretilen antimikrobiyal peptitlerin (bakteriyosinler) bu rekabetçi etkileşimlerin sonucunu belirlediğini gösterdik. Tüm tam dizili pnömokok suşları a bakteriosin-l ike peptid (blp) lokusu barındırır. Blp lokusu, bir dizi farklı bakteriyosin ve bunların düzenlenmesi, işlenmesi ve salgılanması için gereken yüksek oranda korunmuş bileşenlerin tümünü kodlar. Lokusun bakteriyosin bağışıklık bölgesinde (BIR) bulunan bakteriyosinlerin çeşitliliği, pnömokok rekabetinin önemli bir katkısıdır. Bakteriyosinlerle birlikte, bağışıklık genleri BIR'de bulunur ve üretici hücreyi kendi bakteriyosininin etkilerinden korumak için gereklidir. Bindirme testi, bakteriyosinlerin aracılık ettiği rekabetçi etkileşimler için çok sayıda suşu incelemek için hızlı bir yöntemdir. Bindirme testi ayrıca bakteriyosin spesifik bağışıklığın karakterizasyonuna ve salgılanan çekirdek algılama peptitlerinin saptanmasına izin verir. Test, bakteriyosin üretimi için test edilecek bir suş ile bir agar plakasının önceden aşılanması ve ardından bakteriyosin duyarlılığı için test edilecek bir suş içeren yumuşak bir agar kaplamasının uygulanmasıyla gerçekleştirilir. Bıçağı çevreleyen bir boşluk bölgesi, kaplama suşunun önceden aşılanmış suş tarafından üretilen bakteriyosinlere duyarlı olduğunu gösterir. Herhangi bir boşluk bölgesi gözlenmezse, ya kaplama suşu üretilen bakteriyosinlere karşı bağışıktır ya da önceden aşılanmış suş bakteriyosin üretmez. Blp lokusunun belirli bir suşta işlevsel olup olmadığını belirlemek için, bindirme testi, önceden aşılanmış suş tarafından peptit feromon sekresyonunu değerlendirmek için uyarlanabilir. Bu durumda, kaplamada farklı feromon özgüllüğüne sahip bir dizi dört lacZ-raportör suşu kullanılır.

Yayma deneyi iki olası sonuç vardır. Gece boyunca inkübasyondan sonra bıçakladı suşunun büyümesini görmek mümkün olmalıdır. Şekil 1A, üst tabaka gerilme Bakteriyosinler üretilen duyarlıdır. Atılımının bir bölge bıçakladı gerginlik çevredeki görülebilir. Buna ek olarak, kaplama karışımı içine bıçakladı soyun dönen mümkündür ve Şekil 1A 'da görülebilir. Şekil 1B, üst tabaka gerilme bıçak çevreleyen bir halo olmaması ile belirtildiği gibi salgılanan bakteriyosinlerin için ...

Streptococcus pneumoniae'deki rekabete, pnömokok ve diğer ilgili türlere karşı inhibe edici aktiviteye sahip bakteriyosinler, küçük antimikrobiyal peptitler aracılık eder. Burada, bakteriyosin aktivitesinin ve inhibitör spektrumun karakterizasyonuna, bakteriyosine özgü bağışıklığa ve salgılanan çekirdek algılama peptitlerinin saptanmasına izin veren optimize edilmiş bir bakteri kaplama testini açıklıyoruz.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Bu prosedürün genel amacı, bindirme tahlili kullanılarak streptococcus pnömonisinin bakteri ve aktivitesini görselleştirmektir. Bu, önce üretici suşunun bir TSA plakasına bıçaklanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, kaplama gerinim karışımı hazırlanır ve daha sonra kademeli üretici gerinimini içeren TSA plakasına yavaşça pipetlenir.Son adımda, bakteri aktivitesi değerlendirilir. Sonuç olarak, bindirme testi, bıçaklanmış ilgilenilen suş tarafından bakteri inaktivitesini, inaksiyonunu veya feromon üretimini göstermek için kullanılabilir. Bu tekniğin, Bacterin'in doğrudan saflaştırılması gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin bir dizi bakteri, hareketsizlik ve üretimdeki bakteriler için birden fazla suş taramanın hızlı bir yolu olmasıdır.Prosedürü göstermek, laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Natalie Marchek olacak: Üreticideki bakterileri hazırlamak için, ilgilenilen pnömokok suşunu %5 koyun kanı TSA plakasına çizerek başlayın ve plakayı gece boyunca %5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, 25 mililitre TSA içeren plakalara 3000 ila 4.000 birim katalizör pipetleyin ve katalizörleri plakalara yaymak için steril cam boncuklar kullanın. Plakaları biyolojik bir güvenlik kabini altında yaklaşık 10 dakika kurumaya bıraktıktan sonra, bir pipet ucuna görünür miktarda bakteri toplayın ve pipet ucunu kurutulmuş TSA plakasına saplayın.Mümkünse, pozitif kontrol olarak bilinen bir bakteri günah üreticisini ve negatif kontrol olarak kaplamada kullanılacak suşu dahil edin, böylece büyüme halelerinin üst üste gelmemesi için bıçaklar arasında yeterli boşluk sağlayın. Daha sonra, bıçak kültürlerini% 5 karbondioksit ile% 37 santigrat derecede, kaplama testinden bir gün önce altı saat boyunca inkübe edin,% 0.5 maya özütü içeren beş mililitre THY ortamı içeren cam tüplerde test edilmek üzere pnömokok suşunun beş ila 10 kolonisini aşılayın. Daha sonra bu gliserol suş kültürlerinin kapaklarını kapatın ve çalkalamadan 37 derecelik bir su banyosunda inkübe edin.Dört ila beş saat sonra, tüpleri birkaç kez hafifçe ters çevirin ve ardından od'yi ölçün. Kültürler 0.3 ila 0.5'lik bir OD iki 60'a ulaştığında,% 20'lik bir nihai konsantrasyona gliserol ekleyin, ardından kültürleri 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine ayırın ve tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Ertesi sabah, oda sıcaklığında bir gliserol stoğu alikotunu çözün.Daha sonra kaplama uygulamasından hemen önce, 15 mililitrelik konik bir tüpte beş mililitre THY 3000 ila 4.000 birim katalizör ve 200 mikrolitre gliserol stoğunu karıştırın. Raportör bakteri suşları için, plaka başına bir konik tüp kullanarak kaplama karışımına 50 mikrolitre Xcel ekleyin. Karışım bir mikrodalgada eriyen katı TSA'yı dengelerken kaplama karışımını oda sıcaklığına yerleştirin ve ardından 55 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.Erimiş TSA 55 santigrat dereceye kadar soğuduğunda, kaplama karışımına hızlı bir şekilde üç mililitre TSA ekleyin ve beş mililitrelik bir pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Kabarcık oluşturmamaya dikkat edin, ardından kaplama karışımını doğrudan bıçaklanmış TSA plakasına yavaşça pipetleyin. Birkaç dakika sonra, plaka sertleştiğinde ve plakayı döndürmeden, üzerine bindirilmiş bıçak kültürünü, gece boyunca kültür için inkübatöre dikkatlice geri yerleştirin.Ertesi sabah gece boyunca büyümeyi gözlemleyin. Plakalar, inhibisyon veya feromon sinyalinin meydana geldiği alanlar dışında, kaplama suşunun büyümesinden opak görünmelidir. Bu temsili deneyde bindirme tahlili için iki olası sonuç vardır.Gece boyunca kültürden sonra, bıçaklanmış suşu çevreleyen bir boşluk bölgesi gözlendi, bu da bu kaplama suşunun üretilen bakteri sinlerine duyarlı olduğunu gösteriyor. Ayrıca, bıçaklanmış suşun kaplama karışımına girdabına da dikkat edin. Bu deneyde, kaplama suşu, bıçağı çevreleyen bir halenin olmaması ile gösterildiği gibi bakterinin salgılanmasına karşı bağışıktı.Bıçaklanan suşun sinyal tahlili için bakterin salgılamaması da mümkündür. İki farklı sonuç mümkündür. Bu deneyde, bıçaklanmış suş, bu görüntüde xal'ın parçalanmasını gösteren mavi bölge tarafından gözlemlendiği gibi, bindirme suşunun histidin kinazı ile etkileşime giren bir feromon salgıladı.Feromon, raportörün suşunda BLP lokusunun transkripsiyonunu aktive etmezse veya bıçaklanan suş bir feromon salgılamazsa, bu prosedürden sonra bu görüntüde gözlemlendiği gibi X ölçeğinin bozulması meydana gelmez. Mutasyon analizi veya dizileme gibi diğer yöntemler, herhangi bir kayda değer inhibitör aktivitenin BLP lokusuna atfedilip atfedilemeyeceği veya taşıyıcı gendeki bir mutasyonun bir sonucu olarak aktivite eksikliği olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

using-overlay-assay-to-qualitatively-measure-bacterial-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Hockett, K. L. ve Baltrus, D. A. Bakteriyel üretilen inhibitör bileşikleri taramak için yumuşak agar kaplama tekniğinin kullanımı. J. Vis. Exp. (2017)Bu video, antibiyotikle indüklenen donör suşundan süpernatantın test sürünü içeren yumuşak agar kaplamasına yerleştirilerek bakteriyosin kaynaklı öldürme yöntemini göstermektedir. Kuluçka sonrası oluşan net bölgeler bakteriyel inhibisyonu gösterir.

Pseudomonas şıringaelerinde bakteriyosin aracılı öldürmeyi tespit etmek için yumuşak agar örtü testi

Bu video, fare dışkı maddesinden türetilen bakteriyosin üreten laktik asit bakterilerinin tespitini göstermektedir. Tahlil, bakteriyosinin belirli bakteri suşları üzerindeki antimikrobiyal aktivitesini belirler.

Bakteriyosin Üreten Murin Fekal Bakteri İzolatlarının Antimikrobiyal Potansiyelinin Değerlendirilmesi

Biz endomembran kopma izleme için bir yöntem açıklanmaktadır, hücre içi bakteri tarafından ortaya...

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Bu teknik, önceki memeli hücrelerinin protozoal enfeksiyonlara karşı doğal ev sahibi hücrelerin önceden yetiştirilir bakteriyel patojenlerin hücre içi büyüme, hasat normalleştirmek ve ölçmek için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, sahne emiş hem de hedef hücre tipleri için konukçu hücrelerin geniş bir çeşitliliği için modifiye edilebilir.

Protozoa astarlanmış Bakteriler ile uysal Memeli Hücre Enfeksiyonlar

Ökaryotlar için görülenden farklı olarak, esas olarak, küçük boyutu olarak bakterilerde ayrıntılı membran depolarizasyon ve iyon konsantrasyonu değişiklikleri, ölçüm zor geleneksel yöntemler yapan çok az çalışma vardır. Burada, biz floresan teknikleri kullanılarak anlamlı Gram-pozitif bir patojen Streptococcus pneumoniae tür olayları izlemek için detay protokolleri.

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

In vitro yapışma deneyleri, hücre mono tabakaları epitel ve bu pnömokokkal kolonizasyonu inhibe etmek için probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler araştırmak için Streptococcus pneumoniae eki incelemek için kullanılabilir.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Plak tahlilleri, viral titreleri belirlemek için konakçı hücresel tek tabakalar üzerinde tuzak kaplamaları kullanan viral miktar tayini için altın standarttır. Geleneksel olarak çeşitli yarı katı kaplamalar kullanılmış olsa da, burada yarı katı kaplamaları çeşitli virüs aileleri arasında yeni bir sıvı mikrokristalin selülozla karşılaştıran plak tekniklerini gösteriyoruz.

Kullanımı Geleneksel Hikaye ve Roman Yerleşimi Sistemleri: Plak Tahliller sayesinde viral Konsantrasyon Tayini

Ertelenmiş büyüme inhibisyonu testi, bir bakteri izolatının diğeri üzerindeki rekabet etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. İnhibisyon, inhibitör üreten izolatın etrafındaki temizleme bölgesinin ölçülmesiyle ölçülür veya inhibisyonun görünür derecesinin belirlenmesiyle kalitatif olarak değerlendirilir.

Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

Diğer bakterilere karşı inhibe edici bileşiklerin üretimi için bakteri kültürlerini taramak için basit bir yöntem açıklıyoruz.

Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için

Bu opsonophagocytic öldürme tahlil yeteneği yanıt ve farklı tedaviler ve/veya koşullar üzerinde temel bakterileri öldürmek için fagositik bağışıklık hücrelerinin karşılaştırmak için kullanılınır. Klasik, bu tahlil bir bakteri bağlar olarak karşı kaldırdı antikorlar efektör fonksiyonları değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

Bu protokolde sunulan ortak kültür etkileşimi tahlilleri ucuz, yüksek iş ortası ve basittir. Bu tahliller, ortak kültürdeki mikrobiyal etkileşimleri gözlemlemek, etkileşim kalıplarını belirlemek ve insan ve çevresel patojenlere karşı mikrobiyal bir ilgi nin önleyici potansiyelini karakterize etmek için kullanılabilir.

Mikrobiyal Etkileşimlerin İncelemi için Yüksek İş-İş Ortağı Tahlilleri

Öğrenin bakteriyosin aktivitesini ve bağışıklığını Streptococcus pneumoniae'de kaplama testi ile görselleştirmeyi. Bu yöntem, bakteriyel rekabeti ve antimikrobiyal stratejileri hızla taramak için değerlidir.

Kaplama Testi kullanarak niteliksel Pnömokok Bakteriyosinlerin Bakteriyel Üretim ve Hassasiyet Tedbir

Daha fazla video keşfet