Name: Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Keşfedin yeni doğan farelerin hızlı genotipleme yöntemini ve glial besleyici katman üzerinde primer nöronal kültürlerin oluşturulmasını. Bu protokol nörolojik araştırmalar için sağlıklı hücre üretimini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Iowa Üniversitesi'ndeki araştırmacılara, Dr. Luis Tecedor, Ines Martins ve Beverly Davidson'a striatal kültürlerle ilgili talimatlar ve yardımcı yorumlar için ve Dr. Kara Gordon, Nicole Bode ve Pedro Gonzalez-Alegre'ye genotipleme yardımı ve tartışmaları için teşekkür eder. Ayrıca dövme ile ilgili yararlı yorumları için Dr. Eric Weyand'a (Hayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri) ve fare kültürüyle ilgili yararlı yorumları için Dr. Shutaro Katsurabayashi'ye (Fukuoka Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği, Savunma Bakanlığı (Hakemli Tıbbi Araştırma Programı ödülü W81XWH-14-1-0301), Distoni Tıbbi Araştırma Vakfı, Edward Mallinckrodt, Jr. Vakfı, Ulusal Bilim Vakfı ve Whitehall Vakfı (NCH).

NOT: Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Paw Pedleri dövme yapılması kullanma Fareler 1. Uzun süreli Kimlik <ol><li> Deneyci bakan pençe ped (plantar yüzeyi) ile bir pençe hareketsiz. Başparmak ve işaret parmağı ile pençe tutun. Pençe sıkmamaya özen gösterin. NOT: Kararlı immobilizasyon dövme pigmenti pençe pad dermis içine yerleştirilir sağlamak için önemlidir, ve bu nedenle 7 kalıcıdır. </li><li> Bir gazlı bez sünger veya bez üzerinde% 70 etanol ile pençe pedi çubukla. </li><li> Bir pamuk uçlu aplikatör cilt yağı uygulayın ve nazikçe pençe ped birkaç kez yüzeyine karşı ucunu basın. Cilt yağ çok az miktarda kullanmak; mevcut olduğunda büyük miktarlarda, cilde ulaşmasını dövme pigmenti önleyecektir. </li><li> Hemen önce dövme mürekkebi içine dövme iğneleri ipuçları Dipdövme için. Ağrı ve enfeksiyon olasılığını azaltmak için, ve aynı zamanda dövme verimliliğini artırmak için, temiz, aseptik ve keskin dövme iğne kullanın. </li><li> Pençe ped yüzeyi cilt yağı ile kaplı iken, pençe pad merkezinde cilde karşı dikey ve hafifçe dövme iğne ipuçları basın ve mürekkep birden çok kez enjekte edilir. Elektrik dövme sistemi hakkında bilgi almak için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. </li><li> Yavaşça, bir gazlı bez sünger üzerinde% 70 etanol Sprey cilt yüzeyinde ekstra dövme pigmenti kaldırmak için pençe karşı basın ve dövme kalitesini kontrol edin. Pençe pad orta normal deri pigmentasyonu farklı bir karanlık, yuvarlak nokta olduğunu kontrol edin. Dövme koyu veya kolay görüntüleme için yeterince büyük değilse, önce dövme adımları tekrarlayın. </li></ol> Fast PCR Genotipleme Kit kullanarak 2. Genotipleme Yenidoğan Fareler <ol><li> % 70 etanol ile bir fare kuyruk distal ucunu dezenfekte kuyruk 5 mm ya da daha az kesimipucu ve PCR için kullanılan tipte 8 boru şeridin bir tüpe aktarın. Örneklerin arasında çapraz bulaşmayı önlemek için her yavru için bir un-kullanılan jilet kullanın. Seçenek olarak ise, bir makas kullanımı, ancak bu durumda, dikkatli bir şekilde ve iyice% 70 etanol kullanılarak bıçaklar üzerinde kalan doku çıkarın. Kanama kontrol edin. Kanama oluşursa kanama durana kadar, bir gazlı bez sünger ile kuyruk kesme kısmına basınç uygulayın. </li><li> Bir örnek ihtiva eden her bir PCR tüpü DNA ekstraksiyon çözeltisinden 200 ul ekle. Kit hakkında kompozisyonu ve bilgi Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. </li><li> PCR termal döngü içine boru şeridi yerleştirin ve aşağıdaki programı kullanılarak DNA çıkarma işlemini başlatmak: 1 döngü, 55 ° C&#39;de 10 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 1 döngü için, ve 4 ° C&#39;de tutma. Not: Bu, daha sonra, PCR için kullanılan aynı PCR termal döngü cihazı olup. </li><li> DNA ekstraksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, termal döngü a gelen tüp şeridi çıkarınnd 5 kez ters çevirin. </li><li> Bir un-kullanılan bir 8-tüp şerit tüp, ve ile karıştırmak için her numunenin Transfer çözüm (DNA özü) 4 ul: 2X PCR Hazır II 10 ul, ileri ve geri primerler karışık 2 ul (tavsiye edilen 0.5 uM, her numune için nükleazsız H 2 O dizileri için Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız), ve 4 ul. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak Spin kısaca (örneğin, 3 sn). Işlerken dışında her zaman buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Termal bisiklet gerçekleştirin. Görmek Termal program Malzemeleri / Ekipman Tablosu. </li><li> Çoğaltılan DNA ürünleri algılar. Doğrudan bir agaroz jel, bir kuyu içine PCR&#39;dir (20 ul), toplam reaksiyon çözeltisinin yerleştirin. Ayrı bir kuyuya moleküler ağırlık belirteçleri yükleyin. Bir elektrik alanı uygulanır. </li><li> Ultraviyole ışık altında floresan bantları görüntülerini elde edin. </li></ol> Fare Beyin Neuron 3. İlköğretim KültürüGlial Besleyici Layer s NOT: Beyin diseksiyon ve hücre ayrışma (3.1) için prosedürler izleyen tüm prosedürler için ortaktır. Fare glial kültürlerinden prosedürleri (3.2), sıçan glial kültürleri (3.3) ve fare nöronal kültürlerinde (3.4) daha sonra ayrı ayrı açıklanmaktadır. <ol><li> Beyin Diseksiyon ve Hücresel Dissocaiation <ol><li> Hızla beyin kaldırmak ve Hanks solüsyonu içine yerleştirmek, başı kesilerek bir fare veya sıçan yavrusuna Kurban (bileşim için tablo 1 e bakınız) +% 20 (buz üzerinde tutulur), bir 35 mm çanak fetal sığır serumu (FBS). </li><li> İki hemisfer içine orta hat boyunca beyin kesin. Beynin her yarımkürede ilgi bölgeyi (örneğin, serebral korteks, striatum ve hipokampus) sökün. Yüzeyden meninksler ve büyük kan damarları çıkarın. Cerrahi bıçak kullanarak 4-10 ince dilimler halinde beyin bölgesini kesin. </li><li> Zekâ, bir kez 15 ml&#39;lik santrifüj tüp içinde beyin dilimleri durulayınh Hanks çözeltisi +% 20 FBS, Hanks ile sonra da 3 defa &#39;(serumsuz örneğin) bir (4 ° C). , Durulama 5-10 ml solüsyon ekleyin, dilim tüpün dibinde yerleşmek beyin, üst çözüm aspirat, izin ve taze bir çözüm eklemek için. Çözüm aspire durulama işlemi bitirin. </li><li> 3 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak tripsin içeren sindirim çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin dilim içeren tüp içine doğrudan filtrat ekleyin. Trypsinization oda sıcaklığında 13 dakika devam edelim. </li><li> En iyi şekilde aspire ve 7-10 mi Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C) ilave etmek suretiyle tripsin solüsyonu nötralize. </li><li> Hanks ile iki kez, beyin dilimleri yıkayın &#39;çözeltisi +% 20 FBS ve Hanks daha sonra üç kez&#39; solüsyonu (yani serumsuz) (4 ° C). Solut aspire durulama işlemi bitirmekiyonu temsil etmektedir. </li><li> 3 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak ayrışma çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin kesitleri ile doğrudan boruya filtrat ekleyin. </li><li> Mekanik görünür doku parçaları kaybolana kadar hafifçe, 10-20 kez öğütülerek hücreleri ayırmak. Bir pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanın ve triturasyonun sırasında kabarcıkları yapmaktan kaçınmak. </li><li> Küçük parçalar yerleşmek için 3 dakika bekleyin. </li><li> Çözeltisi çoğunluğu aktarın (~ 1.5 mi, altındaki bir bir solüsyon) kullanılarak, 3 mi Hanks solüsyonu +% 20 FBS çözeltisi (4 ° C) ihtiva eden bir 15 mL santrifüj tüpüne pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti. Altındaki herhangi bir tortu dahil tipik kültür bozulması ile sonuçlanır, çünkü tüm çözüm transferi yapmayın. </li><li> 4 ° C&#39;de ~ 185 g (~ 1100 rpm) 13 dakika santrifüj uygulayın. </li><li> Yavaşça süpernatant aspire,eklemek 1 ml önceden ısıtılmış pelet orta (37 ° C) kaplama ve hafifçe pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanarak birkaç kez pipetleme bunu tekrar süspansiyon. NOT: Ortamı kaplama Üç farklı farklı kültür amaçlı kullanılır: fare nöronları orta-2 kaplama, fare glial hücreler orta-1 kaplama, ve sıçan nöronlar ve glial hücreler orta-3 kaplama (kompozisyonlar için Tablo 1&#39;e bakınız) . </li><li> Hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanılarak, hücre süspansiyonu 10 ul çıkarın% 0.4 tripan mavisi çözeltisi 10 ul ile karıştırarak, ve canlı hücrelerin yoğunluğunu ölçmek. </li></ol></li><li> Fare Glial Kültürleri <ol><li> Fare hücreleri sağlıklı kültürleri kurulmasına yardım etmek lamelleri yıkayın. <ol><li> Cam bir Petri kabı içinde% 70 nitrik asit içinde cam lamelleri (yuvarlak, 12 mm çapında) daldırın. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun ve bir yörünge çalkalayıcı O / N üzerine yerleştirin. </li><li> Cam coversli durulayındamıtılmış su ile Petri kabındaki PS en az üç kez. Distile su onları bırakın. Bir yörünge çalkalayıcı O / N çanak yerleştirin. </li><li> Biyolojik güvenlik kabininde bir Whatman 150 mm filtre kağıdı üzerinde lamelleri kurulayın. </li><li> Lamelleri otoklavlayın. </li><li> 24-çukurlu kültür kabına lamelleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Adım 1 ve 2&#39;ye göre etiket ve genotip doğan farenin. </li><li> Adım 3.1 göre fare yavrular beyin hücreleri elde. Not: serebral kortekste fare glial besleyici tabakanın hazırlanması için tipiktir. Bununla birlikte, bu hipokampus ve striatum gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi için hücre yoğunluğu, uygun ayarlamadan sonra çalışır. </li><li> Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 1: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi). Ön ısınma kültür ortamı için, kültür inkübatör çözümü (% 5 CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, yerleştirmeksıcaklık ve pH değerleri, stabilize olmasına izin verin. </li><li> Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, bir kaplanmamış T25 kültür şişesine hücre süspansiyonu aktarın. Kültür inkübatör içine yerleştirilir. </li><li> Nitro (DIV), 1 gün içinde iki defa kaplama ile T25 şişesi içinde kültürlenmiş hücrelerin durulama orta 1 (4 ° C). Geri kuvöz içine balon yerleştirin. Bir girdap hareket birkaç kez taze ortamın ~ 5 ml ekleyerek, tamamen Pasteur pipeti şişeye içinde orta aspire ve yavaşça şişeyi eğerek durulama yapınız. </li><li> 6-9 DIV anda, (yani, bir trypsinization gün önce ve 3.2.8-3.2.13 adımda, lamelleri kaplama), (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplama malzemesinin 100 ul yer hakkında yorumlar için Malzemeleri / Ekipman bkz: İçindekiler Kaplama bir kültür kabı içinde cam lameller üzerine bir malzeme) ve kültürü inkübatöründe kültür kaplarına yerleştirin. </li><li> 7-10 DIV, at hücreleri 20-4 olduğunda0% konfluent (mekansal sürekli), onları trypsinize. <ol><li> Bir şişe içinde tüm solüsyonu aspirasyon ve ~ Hanks solüsyonu (4 ° C) 13 ml ilave etmek suretiyle, bir kez balon yıkayın, yumuşak bir dönme hareketi bir şişe içinde bir kaç kez tilt ve tamamen çözelti aspire. </li><li> 4 mi tripsin-EDTA çözeltisi DNaz çözeltisi (nihai konsantrasyon, 750 birim / ml) 40 ul ekle 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir çözeltisinin, ve şişe hücreler doğrudan filtrat ekleyin. </li><li> Tripsinizasyon kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 13 dakika sürmesine izin verin. </li><li> Şişeye 100% FBS (4 ° C) 2 ml ekleyerek tripsin solüsyonu nötralize. </li><li> Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C), santrifüj ~ 4 ml, bir 5- ila 10-mi bir pipet kullanarak 15 ml santrifüj tüpüne tripsinize hücreleri transfer ~ 185 g ve 13 dakika süre ile 4 ° C ve süpernatant aspire. </li></ol></li><li> Ön Warme 1 ml pelletinid kaplama orta-1. </li><li> Aşama 3.1.13 göre hücre yoğunluğu ölçülür. </li><li> Lamelleri ~ yeniden süspanse glial hücreler 50 ul kaplama cam lamelleri tamamen malzeme, ve plaka aspire. NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak. </li><li> Inkübatör lamelleri kültür çanak yerleştirin. </li><li> 20-60 dakika sonra, önceden ısıtılmış her kuyuya orta-1 kaplama 1 ml ekleyin ve inkübatör geri çanak yerleştirin. Not: kaplama ortam ilave edilirken, lamel ortamda yüzer olmayacak şekilde, (hayır kaplama hücreler vardır) lamel çevresini aşağı basın başka bir pipet kullanmak yararlı olacaktır. </li><li> (Cam lamel üzerinde, yani,), glial besleyici tabakanın 1 DIV içinde 1 ml orta yerine önceden ısıtılmış kaplama orta 1, bir kuyu içinde çözelti her aspirasyon ve daha sonra taze aracı ile doldurarak. </li><li> Glial besleyici tabakasının 2-3 DIV at zaman celher bir oyuğa, bundan dolayı DNA replikasyonu ve inhibe etmek için, Ls mitotik durdurucu (81,2 ve 204,8 uM nihai konsantrasyonlar, sırasıyla 5-floro-2&#39;-deoksiüridin + üridin karışımı 10 ul) ekleyin,% 80-100 konfluent Glial hücre çoğalmasını bastırmak. </li><li> Hücreler% 90-100 sıklıkta (glial besleyici tabaka nöronlar kaplama önce 1-2 saat) zaman 7-9 DIV de, kültür ortamı yerine önceden ısıtılmış kaplama, orta-2 (37 ° C). Not: Nöronlar adım 3.4 kullanarak, aynı gün kaplama olacaktır. </li></ol></li><li> Sıçan Glial Kültürleri <ol><li> Kaplama aynı kaplama malzemesi ile T25 kültür şişesi. NOT: Bu adımda 3.3.5 içinde yapışkan olmayan hücreler daha sonra çıkarılması için gereklidir. <ol><li> Şişeye kaplama malzemesinin 2.0 ml ilave edilir, ve kültürü inkübatöründe balon yerleştirin. </li><li> 2-3 saat sonra, şişenin taban kurur, böylece, tam olarak kaplama malzemesini aspire. </li></ol></li><li> Hücreler elde edilirsıçan yavrularından, 3.1 adım göre yöntem. NOT: hipokampus CA3-CA1 bölgesi sıçan glial besleyici tabaka hazırlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu tür beyin bölgelerinden gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi hücre yoğunluğunda farklılıklar için ayarlama yapıldıktan sonra çalışacaktır. </li><li> Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 3: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi). </li><li> Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, kaplamalı T25 kültür balona hücre süspansiyonu aktarın. Kültürü inkübatöründe (% 5 CO2 -95% O 2, 37 ° C) tutulur. </li><li> 2-3 DIV hücreler% 20-40 konfluent olduğunda, kapağı sıkıca kapama balonu çalkalamak, yapışkan olmayan ya da zayıf biçimde yapışmayan hücreler giderilmiş kuvvetli bir şekilde ~ 10 kat çözeltisi, aspirasyon ile kaplama 4-5 mi ekleme Orta-3 (4 ° C&#39;de). Bir kez bu işlemi tekrarlayın. (Örn tüm şişe zemin üzerinde kültür hücreleri incelemek,tamamen kaldırılır) hücre vücudun dış kenar faz parlak görünen o ki için, yani nöronal (görünür olanlar onaylamak için faz-kontrast mikroskobu) kullanılarak. Bu hücreleri kaldırmak ve daha sonra inkübatör şişeyi geri dönmek için gerektiği kadar işlemi tekrarlayın. NOT: gücü ve bireysel deneyci arasında farklılık olabilir gerekli &#39;sallar&#39; toplam sayısı. Önemli olan bir dizi sayıya sallar toplam sayısını tutmak, ancak nöron benzeri hücreler ortadan kalkar onaylamak değildir. </li><li> 6-8 DIV hücreler% 90-100 sıklıkta olduğu, geçiş adımı 3.2.8 olduğu gibi bunları trypsinizing glial hücreler olduğunda. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, bir kaplanmamış T75 şişeye tripsinize hücreleri transferi, orta-3 (4 ° C), kaplama 10 mi ekleyin ve kültür onları orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelletini inkübatör. NOT: Sıçan glial hücreler iki kez geçişli olacak; Buna fare glial hücreler arbirden çok pasajlar sonra sağlıksız hale çünkü e sadece bir kez pasajlanır. Sıçan, glial hücreler, herhangi bir kaplama malzemesi ile kaplanmıştır değildir T75 şişeleri içinde pasajlanmağa devam edilecektir. Kaplama sıçan glial hücreler çok hızlı büyür ve daha sonra nöronal kültür durumunu bozulacaktır birçok kirpikli hücreler (varsayılan ependimal hücreler), verim sağlar. </li><li> Bir şişe içinde, glial kültür 17-19 DIV de (örneğin, 11 gün pasaj ve tripsinleme bir gün önce ve 3.3.9-3.3.14 adımlarla lamelleri üzerine kaplama sonrası), (yıkanmamış cam lameller üzerine kaplama malzemesinin 100 ul koyun yuvarlak, 12 mm çapında) bir kültür çanak ve kültür inkübatör kültür çanak yerleştirin. NOT: sıçan glial kültürler için, bir fark ile veya lamelleri yıkama olmadan kültür sonuçlarında fark edildi. </li><li> Bir şişede glial kültür 18-20 DIV anda (yani, Pasajlanması sonra 12 gün), st göre, kültür hücreleri trypsinizing glial besleyici tabaka hazırlamakep 3.2.8. </li><li> Santrifüj sırasında, cam lamelleri tamamen kaplama malzemesi aspire. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, adım 3.1.13 göre, orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelet tekrar süspansiyon ve hücre yoğunluğunun ölçülmesi. </li><li> 10 4 canlı hücre / ml glial yoğunluğunu ayarlayın ve kaplamalı cam lamelleri glial hücre süspansiyonu 100 ul plaka. NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak. </li><li> 20-60 dakika süreyle kuvöz içine lamelleri ile kültür çanak yerleştirin. </li><li> Her bir orta-3 (4 ° C) kaplama için 1 ml ilave edilir, ve inkübatör çanak yerleştirin. </li><li> Lamel hücreleri% 40-80 konfluent olduğunda, glial besleyici tabaka 3-4 DIV, içinde önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı, 1 ml ilave (sitosin β-D-arabinofuranosid içeren (bileşim için tablo 1 e bakınız) Araç, 4 uM nihai konsantrasyon), glial hücre çoğalmasını durdurmak için. Plaka nöronGlial besleyici tabakasının 7-9 DIV s at hücreleri adım 3.4 kullanarak,% 60-80 konfluent olduğunda. </li></ol></li><li> Fare nöronal kültürlerinde <ol><li> Adım 1 ve 2&#39;ye göre etiket ve genotip doğan farenin. </li><li> Adım 3.1 için fare yavrular kullanın. </li><li> Canlı hücre süspansiyonu yoğunluğunu ayarlamak için ~ kullanılarak, 2.0 x 10 5 hücre / ml önceden ısıtılmış orta 2 fare, glial hücreler üzerinde kaplama ya da kullanımı için kaplama kaplama orta 3 sıçan glial hücreler üzerine kaplama için. </li><li> Yavaşça her kültür ortamı hücre süspansiyonuna eklenmeden tarafından iyi glial besleyici tabaka, hücreler plaka. Not: eklenecek hücre süspansiyonu hacmi de bir kültürde hücrelerin hedef numarası ile belirlenecektir. Örneğin, plakasının hücre süspansiyonu 60 ul / kuyucuk 12,000 hücre elde etmek için. </li><li> Nöronlar kaplama sonra hiçbir çözüm değişiklikler gerekli olduğunu unutmayın. Kültür boyunca, iç o nemlendirerek kuyulardan çözümün buharlaşmasını önlemek için dikkatli olunkültürü inkübatöründe f. </li></ol></li></ol>

Yazar (Zhengmin Huang), bu makalede açıklanan reaktifleri üreten EZ BioResearch LLC'nin başkanıdır.

Burada sunulan protokol kuyruk ipuçları fareler genotiplemeye, / etiket fareler tanımlamak için dövme prosedürlerini içerir ve düşük yoğunlukta kültür fare beyin nöronları için. 6-8 yavrular kullanıldığı deneylerde bir turunda, bu işlemler genellikle 6-7 saat toplam sırasıyla ~ 0.5 saat, ~ 4 saat ve ~ 2 saat, gerektirir. (Glial besleyici katmanlar önceden hazırlık hariç) tek bir çalışma günden kısa bir sürede - Bu nöronal kültürlerin kaplama için pups &#39;doğum sırasında gerekli tüm prosedürleri tamamlamak için bir tek...

Genetik hastalıkların kemirgen modelleri, normal protein ve nükleik asit, aynı zamanda, bu kusurların patofizyolojik fizyolojik işlevleri açısından yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Örnekler önemli hücresel fonksiyonlara yer alan proteinleri eksikliği olan fareler, aynı zamanda, Alzheimer hastalığı gibi hastalıkların fare modelleri yer alır. Ancak, bazı genetik manipülasyonlar kısa bir süre yenidoğan öldürücülüğü veya doğumdan sonra birkaç gün yol açabilir. Bu gibi durumlarda, birincil hücre kültürleri, canlı hücrelerin ölümünden önce embriyonik veya neonatal yavrular elde edilebilir, çünkü önemli bir araç olup, bu in vitro en az birkaç hafta muhafaza edilebilir, ve bu süre içinde, erken nöronal gelişimi ile takip edilebilir , biyokimyasal, fonksiyonel ve morfolojik deneyler. Birincil kültürler için, bu düşük yoğunluklu nöronlar plaka için yararlı olabilir; Bu bireysel somata, dendrit, akson milleri ve sinir TERMI görselleştirmek mümkün kılaryüksek uzaysal çözünürlükte rken,. Bununla birlikte, düşük yoğunlukta nöron sağkalım ve farklılaşma, tipik olarak bir glial besleyici tabaka kaplama gerektirir, ko-kültür glia 1 şartlandırılmış fiziksel bunlarla temas üzerine ya da ortam içinde kültürlenen yokluğunda glial hücreler. Glial besleyici katmanlar üzerinde düşük-yoğunluklu nöronal kültürlerin kurulması önceden hızlı ve güvenilir genotipleme bağlı olabilir - bir kaç gün aksine bir kaç saat içinde. Nöronal genotip daha önceden hazırlanmış bir glial besleyici tabakanın edilene uyumlu olması gerekir, hız özellikle önemlidir. Daha pratik bir örnek olarak, genotip arasında yavrular bir deney etkinliğini optimize etmek için, oluşturma kültürlerinde kullanmadan karar vermek için gerekli olabilir. Burada önceki yayınlarda 2-6 hızlı, basitleştirilmiş ve güvenilir bir fare genotip için kullanılır olmuştur çalışma protokolü göstermektedir. Fare kuyrukları veBir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. Bu protokol, doku nükleik asitlerin tek aşamalı ekstraksiyon ve (&#39;durdurma çözeltisi&#39;), bir nükleik asit saflaştırma adımı veya bir sonlandırma tamponu kullanılmasını gerektirmez. Bu genotipleme yönteminin güvenilirliği farkları örneklerin başlangıç ​​miktarı, hayvanların yaş ve PCR amplikonlarının uzunluğuna göre sokulduğunda bir dizi test sonuçlarını gösteren açıklanmaktadır. Bu kit otomatik çıkarma ve güvenilirlik avantajlar sunuyor. Kapsamlı olma uğruna, genotip farelerin uzun vadeli belirlenmesi için dövme kullanımı da gösterilmiştir. Dövme (epidermisin altında) derinin dermiş için dövme mürekkep uygulanarak elde edilir 7. Bir prosedür dövmeler gibi kuyrukları ve ayak gibi vücudun diğer bölgelerine uygulanabilir olmasına rağmen, yeni doğan ya da 1 gün eski farelerin pençe yastıkları dövme için tarif edilir ve Anim içinHer yaştan als. Buna ek olarak, yöntemler, glial besleyici tabakalarının 2,8 farklı optimize hazırlanması göre, bir düşük yoğunlukta fare nöronlar kaplama ve kültür olması gerekmektedir. (; P.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 gen TOR1A bir mutasyon nedeniyle otozomal dominant hareket bozukluğu - Biz miras nörolojik bozukluk DYT1 distoni bir genetik fare modeli kullanın. Protein açılımı, protein kompleksi demontaj, membran kaçakçılığı ve vezikül füzyon: kodlanan protein, Torsina, üyeleri genellikle, hastabakıcı gibi işlevleri yerine yardımcı (AAA +) proteinlerin ailesi, &quot;çeşitli hücresel faaliyetler ile ilgili ATPazların&quot; aittir 10-13. Mutasyon glutamik asit için bir kodonun bir çerçeve içi silme ile sonuçlanır, ve erken başlangıçlı genel izole distoni &#39;14,15 ortaya konulmasına neden olur. Bununla birlikte, yolBu bozukluk sorumlu ophysiological mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Bir knock-fare modelinde, mutant alel Tor1a AE olarak, burada bahsedilen Tor1a tm2Wtd vardır. Heterozigot AE-Torsina knock-farelerin DYT1 distoni ile canlı ve genetik taklit insan hastalar, oysa homozigot knock-fareler genetik kökenli 18 etkilenen doğum sonrası ölüm gecikme ile, doğumdan 16,17 sonra ölürler. homozigot knock-farelerin erken ölüm hayvanların genotipleme ve nöronal kültürlerin kurulması hem hızla tamamlanmasını gerektirmektedir. Genotipleme başka örnek olarak, Tfap2a (transkripsiyon faktörü, AP-2α, arttırıcı protein 2α bağlanma geçirmek için) kullanılır. Bu gen tarafından kodlanan bir protein, proliferasyon, diferansiyasyon, hayatta kalma ve apoptoz 19 gibi çok sayıda hücresel işlemleri düzenleyen önemlidir.

<table><tbody><tr><td>REAKTİFLER</td><td></td><td></td><td></td>- dövme</tr><tr><td>Makinesi Temizleyici</td><td>Hayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.</td><td>NMCR3</td><td>Bu, dövmeden sonra iğneleri ve tutucuyu temizlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Makine Kurutma Maddesi</td><td>Hayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.</td><td>NDAR4</td><td>Bu, temizlikten sonra iğneleri ve tutucuyu kurutmak için kullanılır.</td></tr><tr><td>Yenidoğan Dövme Siyah Pigment</td><td>Hayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Deri Hazırlama Aplikatörü</td><td>Hayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.</td><td>NSPA1</td><td>Q ucu.</td></tr><tr><td>Deri Hazırlama Çözümü</td><td>Hayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.</td><td>NSP01</td><td>Bu reaktif, dövmenin verimliliğini artıran ve dövmenin solmasını önleyen ince bir yağ tabakası sağlar (satıcıdan bilgi): 1) dövme yapılmamış cildin geçici olarak lekelenmesini önler, böylece bir pençe pedi dövmesinin kalitesinin, yavru ev kafesine geri dönmeden önce kolayca değerlendirilmesini sağlar &ndash; Lekeli cilt yüzeyi dövmeli cilt ile karıştırılabilir, 2) dövme sırasında cilt hasarını azaltır &ndash; Cildi yumuşatmak ve iğneyi yağlamak, iğnenin cilde zarar vermeden cilde nüfuz etmesine yardımcı olur ve 3) moleküler oksijenin cilde girmesini önler, böylece üretilebilecek reaktif oksijen türlerine karşı enflamatuar tepkileri azaltır.</td></tr><tr><td>REAKTİFLER - genotipleme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Hızlı Doku/Kuyruk PCR Genotipleme Kiti (Şerit Tüp Formatı)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>2X PCR Ready Mix solüsyonuna elektroforez için kırmızı, yükleme boyası dahildir.</td></tr><tr><td>Doku Lizis Çözeltisi A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>20 ve mikroyu karıştırarak DNA Ekstraksiyon Çözeltisi hazırlayın; l Doku Lizis Çözeltisi A ve 180 &mikro; l örnek başına Doku Lizis Çözeltisi B.</td></tr><tr><td>Doku Lizis Çözeltisi B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>20 ve mikroyu karıştırarak DNA Ekstraksiyon Çözeltisini hazırlayın; l Doku Lizis Çözeltisi A ve 180 &mikro; l örnek başına Doku Lizis Çözeltisi B.</td></tr><tr><td>Asetik asit, buzul</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz optimize edilmiş sınıf, moleküler biyoloji sınıfı</td><td>rpi</td><td>A20090-500&nbsp;</td><td>SYBR Safe DNA jel boyası (10.000 kat seyreltilmiş) veya etidyum bromür (0.5 & mikro; g/ml jel hacmi).</td></tr><tr><td>Etidyum bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamin tetraasetik asit, disodyum tuzu dihidrat (EDTA)</td> <td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtreli Pipet Uçları, Aerosol İçermeyen, 0.1-10 ve mikro; l</td><td>Nokta Bilimsel A.Ş</td><td>. UG104-96RS&nbsp;</td><td>Steril ve DNA, RNase ve DNaz içermeyen pipet uçları kullanın. DNA ile ilgili tüm adımlarda, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtrelenmiş pipet uçları kullanın.</td></tr><tr><td>Filtreli Pipet Uçları, Premium Fit Filtre Uçları, 0,5-20 & l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Steril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen pipet uçları kullanın. DNA ile ilgili tüm adımlarda, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtrelenmiş pipet uçları kullanın.</td></tr><tr><td>Filtreli Pipet Uçları, Premium Fit Filtre Uçları, 1-200 & l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Steril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen pipet uçları kullanın. DNA ile ilgili tüm adımlarda, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtrelenmiş pipet uçları kullanın.</td></tr><tr><td>Moleküler ağırlık belirteci, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>Bu üç moleküler ağırlık belirtecinden birini kullanıyoruz.</td></tr><tr><td>Moleküler ağırlık işaretleyicisi, EZ DNA Eşit Merdivenler 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler ağırlık işaretleyicisi, TrackIt, 100 bp DNA Merdiveni</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>PCR tüpleri, ayrı ayrı takılmış kubbe üst kapaklı 8 tüplü şeritler, doğal, 0,2 ml&nbsp;</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1402-2900</td><td>Steril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen tüpler kullanın. 8 tüplü bir şeridin kullanımı ve numuneleri gruplandırması, tek tek tüplere göre daha kolaydır.</td></tr><tr><td>PCR tüpleri, Ultraflux Bireysel&nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Steril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen tüpler kullanın.</td></tr><tr><td>Seal-Rite 0.5 ml mikrosantrifüj tüpü, doğal</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Steril ve DNA, RNaz ve DNaz içermeyen tüpler kullanın.</td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA jel boyası * DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris baz</td><td>rpi</td><td>T60040-1000'de 10.000x</td><td></td></tr> konsantrasyon <tr><td>&Delta'da Tor1a genini amplifiye etmek için primerler; E-torsinA knock-in fareler</td><td></td><td></td>: <td>5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CTC, CC-3' (ileri) ve 5'-CCT, CAG, GCT, GCT, CAC, AAC, CAC-3' (geri) (referans 18). Bu primerler, 1.0 ng/&mikro'luk bir nihai konsantrasyonda kullanıldı; l (~0.16 &mikro; M) (referans 2).</td></tr><tr><td>Yabani tip farelerde Tfap2a genini amplifiye etmek için primerler</td> 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3' (ileri), 5'-CGT GTG GCT GTT GTT GTT GCT GAG GTA-3' (geri) 498-bp amplikon için, 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (ileri), 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3' (ters) 983-bp amplikon için,<td></td><td></td><td> ve 1990-BP Amplikon için 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3' (ileri), 5'-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3' (geri). Bu astarlar 0.5 &mikro;M'de kullanılır.</td></tr><tr><td>REAKTİFLER - hücre kültürü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Floro-2&prim;-deoksiüridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Daha fazla bilgi için üridinin yorumlar bölümüne bakın.</td></tr><tr><td>B-27 takviyesi</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Kapları 35 x 10 mm Tabaklar, Doku Kültürü ile muamele edilmiş</td><td>BD şahin</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Şişeleri, T25, Doku Kültürü ile işlenmiş, Eğimli boyunlu, tapalı kapak, 25 cm2 Büyüme Alanı, 70 ml</td><td>BD şahin</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü Şişeleri, T75, Doku Kültürü ile işlenmiş, Eğimli boyunlu, havalandırmalı kapak, 75 cm2 Büyüme Alanı, 250 ml</td><td>BD şahin</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Konik Tüp, polipropilen, 15 ml</td><td>BD şahin</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Kontes (hücre numarası sayacı) oda slaytları</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Sitozin ve beta;-D-Arabinofuranosid hidroklorür (Ara-C hidroklorür)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz (Dekstroz) susuz, SigmaUltra, %99,5 (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Tabak, Petri camı 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Damıtılmış su</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNase Tip II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>Stok çözeltisi 1.500 birim / 20 &mu'da hazırlanır; l = 75.000 birim/ml damıtılmış suda.</td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM), yüksek glikoz, GlutaMAX, piruvat</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı PES Filtre Ünitesi, 250 ml, 50 mm çapında membran, 0.2 & m Gözenek Boyutu</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı PES Filtre Ünitesi, 500 ml, 90 mm çapında membran, 0,2 & m Gözenek Boyutu</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Cam lamel, 12 mm Yuvarlak, kalınlık 0.09&ndash; 0.12 mm, No. 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuzları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, & ge; %99,5 (titrasyon)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit, %37, ACS reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat, MgSO4&bull;( 7H<alt>2</alt>O), BioUltra, & ge; %99,5 (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Bodrum Membran Matris çözeltisi, Fenol Kırmızısı İçermeyen</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>Bu, lameller ve şişeler için kaplama malzemesidir. 1) Hazırlamak için, Matrigel Basement Membrane Matrix çözeltisini buz üzerinde çözdürün, bu genellikle ~ 1 gün sürer. Önceden soğutulmuş bir pipet kullanarak, çözülmüş çözeltiyi buz üzerinde önceden soğutulmuş T25 şişelerine ayırın ve şişeleri -20 ° C'de saklayın. Çalışan Matrigel çözeltisini hazırlamak için, alikotlanmış Matrigel'i buz üzerinde bir şişede çözdürün, önceden soğutulmuş MEM çözeltisi ekleyerek 50 kat seyreltin ve seyreltilmiş çözeltiyi 4 ° C'de tutun. Lamellerin kaplanması sırasında ve sonrasında dışında, Matrigel ile temas eden tüm kültür eşyalarını ve ortamlarını, erken bir jel oluşturmasını önlemek için önceden soğutmak önemlidir. 2) Cam lamellerin veya kültür şişelerinin Matrigel ile kaplanması için Matrigel solüsyonunu yüzeye uygulayın. Hücreleri kaplamadan önce, yüzeyin tamamen kurutulması önemlidir. Bu amaçla, hücreleri kaplamadan hemen önce hücresel santrifüjleme sırasında Matrigel'i aspire etmek ve kurutma için yeterli zaman tanımak faydalı olabilir.</td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Orta (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>MITO + Serum Genişletici, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Çok Kuyulu Plakalar, Doku Kültürü ile tedavi edilmiş 24 oyuklu plaka</td><td>BD şahin</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Çok Kuyulu Plakalar, Doku Kültürü ile tedavi edilmiş 6 oyuklu plaka</td><td>BD şahin</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal-A Ortamı (1X), sıvı</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Nitrik Asit</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (Nöronal Takviye) 21&nbsp;</td><td>Laboratuvarda</td><td></td> hazırlanmıştır <td>Kaynak: referans 69</td></tr><tr><td>Pasteur pipetleri, 5 & frac34; &rdquo; &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Bu pamuk tıkalı 5 &frac34'ü kullanın; &rdquo; Hücresel öğütme için pasteur pipeti. Kesilen yüzeyi düzleştirmek ve iç çapı orijinalin %50-80'ine düşürmek için ucu önceden ateşle parlatın. Çok küçük bir uç hücreleri bozar ve hücre canlılığını azaltır, ancak çok büyük bir uç öğütme verimliliğini azaltır.</td></tr><tr><td>Pastör pipetleri, 9" &nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl), SigmaUltra, & ge; %99,0</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 2 ml</td><td>BD şahin</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 5 ml&nbsp;</td><td>BD şahin</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 10 ml</td><td>BD şahin</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 25 ml</td><td>BD şahin</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet, 50 ml&nbsp;</td><td>BD şahin</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (NaHCO3, Sodyum hidrojen karbonat), SigmaUltra, > % 99,5</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür (NaCl), SigmaUltra, vb; % 99,5</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH), peletler,% 99,998 eser metal bazlı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik heptahidrat (Na2HPO4&bull;( 7H<alt>2</alt>O)), &ge; %99,99, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz, SigmaUltra, & ge; % 99,5 (GC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi, steril, 0.2 ve mikro; m</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 3 ml</td><td>BD şahin</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin, Holo, sığır plazması</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi boya, %0.4</td> <td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Bu, canlı / ölü hücreleri saymak için kullanılır. Eski bir tripan mavisi çözeltisini birçok kez yeniden kullanılırsa (örneğin birkaç hafta boyunca haftada birkaç kez) yenileyin, çünkü çökeltiler oluşturacak ve hücresel yoğunluğun hatalı okumalarına neden olacaktır.</td></tr><tr><td>Tripsin, tip XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA çözeltisi, %0.25&nbsp;</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>Stok çözeltisi, 25 ml DMEM'de (sırasıyla 8.12 ve 20.48 mM) 50 mg 5-floro-2'-deoksiüridin ve 125 mg üridin olarak hazırlanır.</td></tr><tr><td>REAKTİFLER - immünositokimya</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antikor, tavşan poliklonal anti-MAP2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Antikor, fare monoklonal anti-GFAP kokteyli</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>EKİPMAN - dövme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Hayvan Tanımlama ve İşaretleme Sistemleri A.Ş.</td><td>NEO&#8211; 9</td><td>Bu Yenidoğan Kemirgen Dövme Sistemi, 1 veya 3 noktalı dövme iğnelerini cilde dikey olarak hızla hareket ettirerek çalışan bir elektrik sistemidir. Dövme iğne uçları cilt yüzeyine dik tutulurken dövme makinesini yaklaşık 0,5 saniye boyunca bir kez etkinleştirin. Dövme yapılan bölgeyi en üst düzeye çıkarmak için üç iğneli dövmeyi tercih ediyoruz, ancak tek iğneli dövme daha dar alanlarda, örneğin ayak parmaklarında em veya ince mekanik kontrol gerekiyorsa, örneğin sayılar dövme yapıldığında etkilidir. En düşük hızda iki tur dövme (3 adımdan "1" ayarı) tipik olarak pençe yastıklarının görünür ve uzun süreli bir dövmesini oluşturmak için yeterlidir.</td></tr><tr><td>EKİPMAN - genotipleme</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektroforez sistemi, yatay, Geniş Mini&#8211; Alt Hücre GT</td><td>BIO&#8211; RAD</td><td>170&#8211; 4405</td><td>Tipik elektroforez parametreleri, 10 cm'lik bir jel için 6 V/cm'de elektrik alan kuvveti ve 25 dakika süredir.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Termal Döngüleyici</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>&#916'daki Tor1a geni için PCR reaksiyonlarımız; E-torsinA knock-in fareler aşağıdaki gibidir: 94 & # 176'da 1 döngü denatürasyon; 3 dakika boyunca C, 94 & # 176'da 35 döngü denatürasyon; 30 saniye boyunca C, 58 & # 176'da tavlama; 30 saniye boyunca C, 72 & # 176'da uzatma; 2 dakika boyunca C. Bunu 72 & # 176'da son uzatma takip ediyor; 10 dakika C ve 4 &# 176;C'de tutun.</td></tr><tr><td>Güç kaynağı, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>EKİPMAN - hücre kültürü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otomatik hücre sayacı, Kontes</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>Bu otomatik hücre sayacı, canlı ve ölü hücrelerin yoğunluklarını ayrı ayrı ölçer (sırasıyla lekelenmemiş ve tripan mavisi ile lekelenmiş). Optimum yoğunluk ölçüm aralığını bilmek önemlidir: kullandığımız sayaç, 1 x 105 ile 4 x 106 hücre / ml aralığında en yüksek doğruluğa sahiptir. Ölçülen hücre yoğunluğu değerleri önerilen aralığın dışına çıkarsa, yeniden süspansiyon hacmini uygun şekilde ayarlayın.</td></tr><tr><td>Biyolojik Güvenlik Kabini, Sınıf II, Tip A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>Bu başlık, beyin diseksiyonu hariç tüm hücre kültürü prosedürleri için kullanılır.</td></tr><tr><td>CO2 İnkübatör, AutoFlow, Nem Kontrollü Su Ceketi</td><td>NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Yatay Temiz Tezgah</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>Bu temiz tezgah beyin diseksiyonu için kullanılır ("Beyin Diseksiyonu ve Hücresel Dissosiyasyon" 3.1.1 ve 3.1.2 adımları).</td></tr><tr><td>Orbit LS Düşük Hızlı Çalkalayıcı</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Süper Hızlı Santrifüj</td><td>Fisher</td><td>46910 (santrifüj)/46922 (rotor)</td><td></td></tr></tbody></table>

hayvanlar rapid genotipleme beyin nöronlar İlköğretim kültürler kurulması izledi

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Memeli nöronların yapısının ve fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü analizi genellikle nöronlarının birincil kültürleri analizi ve ardından tek tek hayvanların genotipleme gerektirir. Genotyped için yenidoğan fareler, hızlı genotiplendirmesi etiketleme, ve bu farelerin beyin nöronları düşük yoğunluklu kültürleri kurulması: Biz prosedürlerin bir dizi tarif. Bireysel fareler yetişkinlikte süren uzun süreli kimlik sağlar dövme, tarafından etiketlenir. Açıklanan protokol tarafından Genotipleme hızlı ve verimli ve iyi güvenilirlik ile nükleik asitin otomatik çıkarılması için izin verir. Bu yenidoğan letalitesinin muzdarip farelerde, örneğin geleneksel genotiplemede için yeterli zaman mevcut değildir şartlar altında yararlıdır. Primer nöronal kültürlerin yüksek uzaysal çözünürlükte görüntüleme deneyleri sağlayan düşük yoğunlukta, oluşturulur. Bu kültür yöntemi öncesinde nöronal kaplama için glial besleyici katmanlar hazırlanmasını gerektirir. protocol hareket bozukluğu DYT1 distoni (AE-Torsina knock-in fareleri) bir fare modelinde bütünüyle uygulanır ve nöronal kültürler, bu farelerin hipokampus, serebral korteks ve striatum hazırlanır. Bu protokol, diğer türlere ait hayvanlar için, hem de diğer genetik mutasyonlar olan farelere de uygulanabilir. Ayrıca, protokol bireysel bileşenleri izole alt projeler için kullanılabilir. Böylece bu protokol nörobilim hem de biyolojik ve tıbbi bilimlerin diğer alanlarında değil, sadece geniş bir uygulama, sahip olacaktır.

Bu protokolün uygulanmasında bir örnek olarak, temsili sonuçlar çeşitli deneysel koşullar altında dövme, güvenilir genotiplemede tarafından fareler etiketleme, ve glial besleyici katmanlar birincil nöronal kültürlerin kurulması için gösterilmiştir. Dövme Yenidoğan yavrular (Şekil 1 'Yenidoğan') bir dövme sistemi kullanılarak pençe yastıkları etiketli bulundu. etiketler 3 haftada açıkça görünür kalmıştır ('3 haftalık') ve yaş 32 h...

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Bu prosedürün genel amacı, yenidoğan fareleri genotiplemek ve bir glial besleyici tabaka üzerinde düşük yoğunluklu nöronal kültürler oluşturmaktır. Bu, ilk olarak ikinci adımda kuyruk uçlarını kullanarak yeni doğan farelerin hızlı bir şekilde genotiplendirilmesiyle gerçekleştirilir. Aynı gün, beyinler parçalara ayrılır ve glial besleyici tabakalar olarak kültürlenir.Daha sonra birkaç hafta sonra, başka bir yeni doğan fare grubu hızla genotiplenir ve önceki glial besleyici katmanlarında kültür için hayvanın beyinlerinden nöronal hücreler üretilir. Sonuç olarak, bu yöntem hızlı ve güvenilir genotiplemenin yanı sıra sağlıklı nöronların ve glial hücrelerin üretilmesi için de kullanılabilir. Bu protokolün iki ana avantajı vardır.Birincisi, sağlıklı nöronları görüntüleme deneyleri için çok düşük bir yoğunlukta, onları glial bir fetal tabaka üzerine yerleştirerek kültürleyebilmemizdir. İkinci avantaj, yenidoğan farelerin birkaç saat içinde genotiplenebilmesi ve nöronların genotiplerinin ve glial fetal tabakanın eşleşmesine izin vermesidir. Harta laboratuvarında araştırma görevlisiyim.Genotipleme ve kültürler için prosedürleri göstereceğim. Bir örnek içeren her bir PCR tüpüne 200 mikrolitre DNA ekstraksiyon solüsyonu ekleyerek başlayın. Tüp şeridini bir PCR termal döngüleyiciye yerleştirin ve ardından ekstraksiyon bittiğinde DNA ekstraksiyonunu başlatın.Tüp şeridini termal döngüleyiciden çıkarın ve tüpleri beş kez ters çevirin. Daha sonra, her örnekten dört mikrolitre DNA ekstraktını sekiz tüplü bir şerit üzerinde kullanılmayan bir tüpe aktarın ve numuneyi 10 mikrolitre iki XPCR ile karıştırın. İki, iki mikrolitre karışık ileri ve geri astar ve dört mikrolitre nükleaz içermeyen su karıştırın.Her numune için numuneleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve termal döngü programını başlatın. Program bittiğinde, her bir amplifiye edilmiş numuneden veya moleküler ağırlık işaretleyicisinden 20 mikrolitreyi doğrudan bir aros jelinin uygun kuyucuğuna yükleyin. Ardından jeli çalıştırın ve ultraviyole ışık altında bantların floresan görüntülerini elde edin.Amplifiye edilmiş DNA ürünlerini tespit etmek için, beynin her yarım küresinden ilgilenilen bölgeleri çıkararak başlayın ve ardından beyin dokularını 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dokunun tüpün dibine yerleşmesine izin verin ve ardından çözeltiyi dilimlerin üstünden beş ila 10 mililitre buz gibi soğuk ile değiştirin. Daha önce belirtildiği gibi fetal sığır serumu olsun veya olmasın Hank solüsyonu, tüm solüsyonu tamamen aspire eder.Dördüncü yıkamadan sonra, iki mililitre taze hazırlanmış sindirim solüsyonunu 0.2 mikrometrelik bir şırıngadan süzmek için üç mililitrelik bir şırınga kullanın. Doğrudan beyin dokularını içeren tüpe süzün ve tripsin izasyonunun oda sıcaklığında ilerlemesine izin verin. 13 dakika sonra, önce tripsin çözeltisinin çoğunu aspire ederek ve ardından fetal sığır serumu ile yedi ila 10 mililitre buz gibi çile çözeltisi ekleyerek reaksiyonu nötralize edin.Daha sonra dokuları, gösterildiği gibi fetal sığır serumu ile veya fetal sığır serumu olmadan Hank solüsyonunda durulayın. Daha sonra, iki mililitre ayrışma solüsyonunu beyin dokularına süzün. Ardından, pipetinizi pamuk tıkalı, ateşle parlatılmış bir PE kullanarak hücreleri 10 ila 20 kez nazik trier ile mekanik olarak ayırın.Görünür doku parçaları kaybolana kadar denemeye devam edin. Küçük parçaların çökelmesi için üç dakika bekleyin ve ardından yaklaşık 1.5 mililitre çözeltiyi üç mililitre buz gibi soğuk Hank çözeltisi içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için PE pipetini kullanın, fetal sığır serumu ile tüpleri 13 dakika boyunca 185 Gs ve dört santigrat derecede döndürün. Daha sonra aynı pastör pipetini kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin.Peletleri bir mililitre ön ısıtma kaplama ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Ardından yaklaşık dört mililitre ön ısıtma kaplama ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu kaplanmamış bir T 25 kültür şişesine aktarın ve şişeyi bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Bir günde in vitro olarak, hücreleri beş mililitre buz gibi soğuk kaplama ortamı ile iki kez durulayın, biri şişeyi altı ila dokuz günde dönen bir hareketle birkaç kez hafifçe eğerek in vitro olarak 100 mikrolitre hücre dışı matris proteinleri içeren kaplama malzemesini bir hücre kültürü kabındaki cam kapak fişlerine yerleştirin ve tabağı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Ertesi gün, şişenin içindeki tüm solüsyonu aspire ederek ve yaklaşık 13 mililitre buz gibi çile solüsyonu ekleyerek şişeyi durulayın. Ardından çözeltiyi tamamen aspire edin.Daha sonra, dört mililitre bir tripsin EDTA artı DNA çözeltisini doğrudan hücrelere süzün ve hücrelerin 37 santigrat derecelik bir inkübatörde hücre kültürü şişesinden ayrılmasına izin verin. 13 dakika sonra, reaksiyonu iki mililitre buz gibi,% 100 fetal sığır serumu ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için beş ila 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, fetal sığır serum santrifüjlemesi ile yaklaşık dört mililitre buz gibi çile çözeltisi ekleyerek hücreleri yıkayın ve ardından peleti bir mililitre ön ısıtma kaplama ortamında tekrar süspanse edin. Bir.Şimdi kaplama malzemesini kapaktan tamamen aspire edin, fişler ve yeniden süspanse edilmiş glial hücrelerin yaklaşık 50 mikrolitresini kapak fişlerinin üzerine yerleştirin. Glial besleyici tabakasını oluşturmak için, glial hücreleri 37 santigrat derecede 20 ila 60 dakika inkübe edin ve ardından kaplama ortamı eklenirken her bir kapak kızağına bir mililitre ön ısıtma kaplama ortamı ekleyin. Kapak fişinin ortamda yüzmemesi için lamele çevresine bastırmak için başka bir pipet kullanmak yararlıdır.Gece kültürden sonra. Ortamı, iki ila üç günde bir olmak üzere bir mililitre taze ön ısıtma kaplama ortamı ile değiştirin. İn vitro, yedi ila dokuz günde DNA replikasyonunu ve glial hücre proliferasyonunu inhibe etmek için her besleyici katman kültürüne 10 mikrolitre mitotik inhibitör ekleyin.İn vitro, kültür ortamını ön ısıtma kaplama ortamı iki ile değiştirin. Daha sonra, yaklaşık 50 ila 100 mikrolitre fare nöronal hücresini, her bir glial besleyici katmanın üzerine iki tane olmak üzere önceden ısıtılmış kaplama ortamında nazikçe kaplayın. Bu görüntüde, birinci tur bir gen, knockin DYT one distoni modelinin vahşi tip heterozigot ve homozigot yavrularının yenidoğanın kuyruk klipslerinden izole edilen genomik DNA'dan amplifiye edildi.Yabani tip ve mutasyona uğramış aleller için ayrı bantlar açıkça görülebilir. Bu şekilde, bir fare hipokampal nöronal kültüründen iki temsili alan gösterilmiştir. Yabani tip farelerin CA üç, CA bir hipokampal bölgesinden üretildiler.Diferansiyel girişim kontrast görüntülerinde vahşi tip farelerin önceden belirlenmiş bir ca üç, ca bir hipokampal glial besleyici tabakası üzerine kaplamadan 14 gün sonra, nöronal hücre gövdesinin açık bir marjı gibi iyi sağlık belirtileri genişletilmiş nöronal süreçler ve nispeten düzgün bir glial hücre tabakası gözlemlenebilir. Nöronal belirteç haritası için daha fazla immünosito kimyasal boyama. İkincisi, nöronların ve her alandaki süreçlerinin tanımlanması da gözlemlenebilir.Bu protokolü kullanarak, bir kültür turunda bir genotipleme 67 saat içinde tamamlanabilir. Bu protokol, doğumdan birkaç gün sonra ölebilen genetik olarak tasarlanmış farelerin nöronlarını kültürlemek için özellikle yararlıdır.

rapid-genotyping-animals-followed-establishing-primary-cultures-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Utero elektroporasyon nöronal progenitör hücrelerinin in vivo transfecting için değerli bir yöntemdir. Elektrotlar ve elektroporasyon gelişimsel timepoint yerleştirme bağlı kortikal hücrelerin bazı altkümelerini hedeflenebilir. Hedeflenen hücreler daha sonra in vivo veya in vitro genetik değişiminin etkileri analiz edilebilir.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

Protokol herpes virüs tip 1 (HSV-1) gecikme ve reaktivasyonu simpleks incelemek için etkin ve tekrarlanabilir model sistemi anlatılmaktadır. Assay homojen sempatik sinir kültürler kullanmaktadır ve RNA etkileşimi ve rekombinant proteinlerin ifadesi de dahil olmak üzere çeşitli araçlar kullanılarak virüs nöron etkileşimlerin moleküler Diseksiyon için olanak sağlar.

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Synaptically bağlı nöronların izleme için bir yöntem tarif edilmektedir. Biz bir ilgi hücre popülasyonu tanımlı genetik hücre tiplerinden sinaptik girdi alıp almadığını soruşturma yönündeki bir hücrenin TVA özgüllüğü kullanın.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Video, sıçan korteksinden birincil astrositleri kültürlemek için bir tekniği göstermektedir. Korteks, homojen bir glial hücre süspansiyonu elde etmek için mekanik olarak ayrışır, bu daha sonra astrositlerin seçici proliferasyonunu teşvik etmek için polipeptit kaplı plakalar üzerine kaplanır. Daha sonra, astrositler enzimatik olarak plakalardan ayrılır ve saf astrositlerin kültürüne izin vererek taze ortama aktarılır.

Bir Sıçan Yavrusu Beyninden Birincil Astrosit Kültürü Oluşturma

İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler), birincil kortikal nöronlardan ve astrositlerden türetilen nöronlardan oluşan bir ko-kültür sistemi oluşturmak için bir protokol tanımlanmıştır. Bu ko-kültür sistemi, yeni, iPSC'den türetilmiş nöronlar ve channelrhodopsin-2'yi eksprese eden önceden var olan kortikal nöronlar arasında sinaptik kontakların ve devrelerin oluşumunun tespit edilmesini sağlar.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Parkinson hastalığı sırasında orta beyin dopaminerjik nöronlarının dejenerasyonunun nedenleri tam olarak anlaşılamamıştır. Hücresel kültür sistemleri, bu nöronların nörofizyolojik özelliklerinin incelenmesi için önemli bir araç sağlar. Burada, nörodejenerasyonun in vitro modellemesi için kullanılabilecek optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Biz değiştirmek ve uyarıcı kortikal nöronların 12 içine insan kaynaklı pluripotent Kök Hücre (hiPSCs) arasında hızlı, tekrarlanabilir ve verimli farklılaşma anlatan bir önceden yayınlanmış protokolü uygulamak. Özellikle, modifikasyon ağ düzeyinde elektrofizyolojik özelliklerini ölçmek için, mikro-elektrot dizileri üzerinde nöronal hücre yoğunluğu ve kullanım kontrol edilmesini sağlar.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Burada sunulan nörosferlerin spontan nesil yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan nöral progenitor hücrelerinde zenginleştirilmiş bir protokoldür. Aynı deney sırasında, nöronlar daha düşük yoğunlukta kaplandığında, protokol aynı zamanda uzun süreli birincil sıçan nöron kültürleri ile sonuçlanır.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Bu protokol, nöro (immüno) loji araştırması için embriyonik gün 17 fare beyinlerinden merkezi sinir sistemi hücre kültürleri üretmenin benzersiz bir yolunu sunar. Bu model, RT-qPCR, mikroskopi, ELISA ve akış sitometrisi dahil olmak üzere çeşitli deneysel teknikler kullanılarak analiz edilebilir.

Embriyonik Fare Beyinlerinden Enfeksiyonu ve Doğuştan Gelen Bağışıklığı İncelemek için Karışık Nöronal ve Glial Hücre Kültürleri Oluşturmak

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Murin Primer Mikroglia ve Kortikal Nöronların Üretilmesi ve Birlikte Kültürlenmesi

Keşfedin yeni doğan farelerin hızlı genotipleme yöntemini ve glial besleyici katman üzerinde primer nöronal kültürlerin oluşturulmasını. Bu protokol nörolojik araştırmalar için sağlıklı hücre üretimini kolaylaştırır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

Daha fazla video keşfet