Tek Hücreleri ve 3D Sınırlaması Tek Embriyolar Sipariş: Yüksek İçerik Tarama için Yeni Bir Cihaz

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fizyolojik koşullarda karşılaşılan 3B ortamı taklit eden bir dizi mikro boşluk üzerinde hücresel organellerin morfolojisini ve dinamiklerini gözlemlemektir. Fisyon mayası gibi sert duvarlı hücreler için boşluklar hücresel yapıları düzenleyebilir ve yönlendirebilir. Bu, ilk olarak, replika kalıplama yoluyla yumurta kapları olarak adlandırılan bir dizi PDMS mikro boşluğu elde etmek için bir ustadan bir dizi PDMS sütunu imal edilerek elde edilir.

İkinci bir adım olarak, yumurta kapları, hücre dışı matrisin proteinleri ile işlevselleştirilir ve mikro boşluk örneğini destekleyen ve mikro boşlukların her birine ayrı memeli hücrelerinin sokulmasına izin veren silindirik özel yapım bir plastik parça içeren bir tüpe sokulur. Daha sonra, hücrelerle doldurulmuş yumurta kapları çıkarılır ve hücrelerin fenotipini ve dinamik süreçlerini 3 boyutlu bir hapsetmede incelemek için ilgilenilen ilaç veya bileşik ile inkübe edilir. Hücrelerin oryantasyonuna bağlı olarak standart 2D in vitro deneylerle karşılaştırıldığında gözlenen hücre fenotipinde ve yeni dinamik yapılarda farklılıklar gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu tekniğin standart 2D hücre kültürü tahlilleri gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, yumurta kaplarındaki memeli hücrelerinin mantıksal mikro ortamlara benzer bir 3D ortamı deneyimlemesi, ancak düzenli ve standartlaştırılmış bir sınıfta düzenlenmesidir. Düzen ve oryantasyon da fisyon mayası durumunda önemli gelişmelerdir. Bu yöntem, yüksek içerikli taramaya sahip yeni ve anti-kanser ilacının tanımlanması gibi hücre iskeleti ve ilaç keşfi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu tekniğin etkileri, kanser gibi çok faktörlü hastalıkların teşhisine kadar uzanır, çünkü ilaç tarama testleri yumurta kapları aracılığıyla kolayca yapılabilir ve analiz edilebilir, bu da bu yöntemi kişiselleştirilmiş tıp için özellikle ilginç hale getirir. Bu yöntem, bireysel memeli hücrelerinde ve fisyon maya hücrelerinde organize yapılar ve dinamikler için iç anahtar sağlayabilir ve ayrıca C.elegans ve ri-so-flu-a gibi embriyoların geliştirilmesi için çalışma organize etmek için de uygulanabilir. Bu protokolde, bir dizi mikro boşluk veya yumurta kabı, replika kalıplama ile bir kapak kızağı üzerine yapıştırılan bir polidimetilsiloksan veya PDMS tabakası üzerine desenlenir.

İlk adım, gösterilmeyecek, ancak metin protokolünde açıklanan master'ın imalatıdır. Ana kopya yapıldıktan sonra, bir sonraki adım PDMS kopyasını üretmektir. 50 mililitrelik bir tüpte, çapraz bağlayıcıyı ve prepolimeri bir ila 10 ağırlık / ağırlık veya hacim / hacim oranında toplam 30 gram olacak şekilde iyice karıştırın.

Hava kabarcıklarını gidermek için tüpü beş dakika boyunca 1.800 kez g'de santrifüjleyin. PDMS'yi yavaşça master'ın üzerine bırakın. Kabarcıklar belirirse, karışımın gazını alın.

Numuneyi dört saat boyunca 65 santigrat derecede bir fırına koyun. PDMS sertleştikten sonra, yaklaşık 10 ila beşinci mikro boşlukları veya yumurta kaplarını içeren yaklaşık bir santimetre karelik ilgi alanını nazikçe kesmek için bir neşter kullanın. PDMS damgasını nazikçe soyun.

Replika kalıplama prosedürüne başlamak için, PDMS damgasını 30 saniye boyunca oksijen plazma tedavisi ile etkinleştirin. Toz birikmesini önlemek için etkinleştirilmiş damgayı geçici olarak kapalı bir petri kabında saklayın. Çeker ocakta çalışarak, etkinleştirilmiş PDMS damgasını, 15 mililitrelik bir kapağın yanındaki bir petri kabına, yapılar yukarı veya baş yukarı bakacak şekilde yerleştirin.

Kapağı 200 mikrolitre trimetilklorosilan ile doldurun. Petri kabını kapatın ve damganın yedi dakika tuzlanmasına izin verin. PDMS stamp'i, yapılar baş yukarı bakacak şekilde spin kaplayıcıya yerleştirin.

Yapıların üzerine küçük bir damla sıvı PDMS koyun. Yapıların üzerine ince bir PDMS tabakası bırakmak için kaplamayı 1500 RPM'de 30 saniye döndürün. Biriken spin kaplı PDMS tabakasını sertleştirmek için damgayı dört saat boyunca 65 santigrat derecede fırına yerleştirin.

Ardından, PDMS damgasını bir cam kapak kayışı ile birlikte 30 saniye boyunca bir oksijen plazma temizleyicisine baş yukarı yerleştirerek ince PDMS katmanını etkinleştirin. Damgayı hemen cam kapak sürgüsü ile temas edecek şekilde yerleştirin ve yapıştırma için damganın yüzeyinin her yerine cımbızla hafifçe bastırın. Bundan sonra, damganın üzerine yaklaşık 10 saniye boyunca sabit bir baskı uygulayın.

30 dakika sonra, yumurta kaplarını serbest bırakmak için kapak fişindeki damgayı nazikçe soyun. Numuneyi kırmamaya çok dikkat edin. Yumurta kaplarını etanol ile iyice durulayın ve kurulayın.

Sabitleme işlemi sırasında PDMS yumurta kapları cam kapak kızağı üzerinde değilse ve ayrılmıyorsa, plazma temizleyicinin ayarlarını değiştirmeyi düşünün ve replika kalıplama prosedürünü yeniden başlatın. Numunenin daha sonra manipüle edilmesini kolaylaştırmak için, kapak kaymasının kenarına küçük bir kürlenmiş PDMS parçasının yapıştırılması önerilir. Bu videoda sunulan memeli hücreleri söz konusu olduğunda, PDMS yüzeyi, hücre dışı matrisin adezyon proteinleri ile işlevselleştirilmelidir.

Yumurta kaplarını oksijen plazma temizleyicide 30 saniye hidrofinize edin. Bundan sonra, yumurta kaplarını ultraviyole ışıkla beş dakika sterilize edin. Tüm yumurta kabı alanını kaplamak için küçük bir damla fibronektin çözeltisi bırakın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Numuneyi kurumaya karşı koruyun. Yumurta kaplarını plastik bir dağıtım pipeti kullanarak yaklaşık bir mililitre PBS ile nazikçe durulayın. Toplam üç kez tekrarlayın.

Ardından, özel yapım silindirik plastik bir parçayı 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Tüpe 13 mililitre hücre kültürü ortamı ekleyin. Numunenin tamamen daldırılmasını sağlamak için ortam, silindirik parçanın en az iki santimetre üzerine ulaşmalıdır.

Numuneyi PDMS sapından tutmak için keskin ve düz cımbız kullanarak, yumurta kaplarını dikkatlice tüpün içine yerleştirin, kapak fişini plastik parçanın üst tarafının üzerine gelene ve tamamen daldırılana kadar hafifçe bastırın. Yumurta kaplarına verilecek hücreler,% 80 ila 100 birleşime kadar kültürlenmeli ve beş mililitre kültür ortamında yeniden süspanse edilmelidir. Yumurta kaplarının üzerine 200 mikrolitre hücre pipetleyin, hücreleri yumurta kaplarının üzerine mümkün olduğunca ortalanmış olarak bırakın, ancak fiziksel temastan kaçının.

Bu, numunenin kırılmasını ve/veya hasar görmesini önleyecektir. 50 mililitrelik tüpü iki dakika boyunca 1.800 kez g'de santrifüjleyin. Yumurta kaplarının üzerine 200 mikrolitre hücre daha pipetleyin ve iki dakika boyunca 1.800 kez g'de tekrar santrifüjleyin.

Doldurma yüzdesini optimize etmek için toplam üç kez tekrarlayın. Son santrifüjlemeden sonra, yumurta kaplarının dolum yüzdesini mikroskopla kontrol edin. PDMS tutamağını tutmak için cımbızı kullanarak, yumurta kaplarındaki hücreleri rahatsız etmeden numuneyi tüpten dikkatlice çıkarın ve numuneyi orta dereceli bir petri kabına yerleştirin.

Yumurta kaplarında olmayan fazla hücreleri çıkarmak için, mikro yapı dizisinin her iki tarafının yanında üç kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek durulayın. Son olarak, bağlı olmayan hücreleri çıkarmak için ortamı yeni ortamla değiştirin. Sabit hücresel organelleri gözlemlemek için, sabit bir numune içeren yumurta kaplarını epifloresan ters çevrilmiş bir mikroskop s'a yerleştirin ve 60x yağ objektifini seçin.

Bu örnekte numune, Golgi aygıtı, çekirdek ve aktin liflerinin boyandığı NIH 3T3 fibroblastlarıdır. Yumurta kapları ve hücreler gözlem düzlemine gelene kadar parlak alan ışığı kullanarak dikkatlice odaklanın. İlgilendiğiniz bölgeyi seçin ve odaklayın ve görüntü yakalamaya başlayın.

Bu prosedüre, yumurta kaplarını bir mikroskop tutucusuna yerleştirerek ve bir mililitre %10 FCS L15 hücre kültürü ortamı ile doldurarak başlayın. Tutucuyu mikroskobun tablasına takın. Buharlaşmayı önlemek için, tutucunun üzerine bir cam kapak yerleştirin.

Hücreleri, 60x yağ objektifi ile donatılmış epifloresan ters çevrilmiş bir mikroskopla gözlemleyin. Bu örnek, mitoz sırasında sitokinetik halka kapanmasında yer alan iki anahtar molekül olan floresan etiketli miyozin ve aktini eksprese eden HeLa hücrelerini kullanır. İlgilendiğiniz bölgeyi seçin ve GFP veya Texas Red kanalını kullanarak bir sitokinetik halka arayın.

Doğru odaklanın. Halka tamamen kapanana kadar otomatik alımı her iki kanalda da çalıştırın. Yumurta kaplarının taramalı elektron mikroskobu görüntüleri, şekillerinin ve boyutlarının çok düzenli olduğunu göstermektedir.

Fisyon mayası gibi sert duvarlara sahip hücreler için, yumurta kapları sitokinetik halkayı yönlendirebilir. Memeli hücreleri için, 3 boyutlu yumurta kapları ve 2 boyutlu düz yüzeyler üzerindeki hücreler arasında yapılan bir karşılaştırma, birincisinin homojen küresel benzeri fenotipe sahip düzenli bir dizi oluşturduğunu, ikincisinin ise düzensiz ve heterojen bir morfoloji gösterdiğini ortaya koymaktadır. Yumurta kaplarındaki hücreler ayrıca, Blebbistatin ile tedavinin mütevazı etkisinin sayısı ile gösterildiği gibi, stres liflerinin sayısında bir azalma gösterir.

2D kültürler üzerindeki Golgi aygıtı tipik olarak genişletilmiş bir fenotip gösterirken, yumurta kaplarında daha sıkıştırılmış bir fenotip gösterir. Bu, Golgi fenotiplerinin nicelleştirilmesiyle doğrulandı. Son olarak, 2D yüzeylerde, hücre çekirdeği rastgele yönlendirilirken, yumurta kaplarında, hem vahşi tip hem de Blebbistatin ile tedavi edilen hücrelerde xy düzlemine ortogonal olarak yönlendirilir.

Çekirdek küresellik değerlerinin belirlenmesi, yumurta kaplarının hücre çekirdeğinin normal küreselliğini etkilemediğini ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, yumurta kaplarındaki vahşi tip ve Blebbistatin ile tedavi edilen hücreler arasındaki fark, yumurta kaplarının 2D olarak maskelenen ilacın gerçek bir etkisini ortaya çıkardığını göstermektedir. Yumurta kapları kullanılarak yapılan canlı hücre çalışmaları, standart kültürlerde görülemeyen yeni aktif süreçlerin tanımlanmasını sağlar.

Örneğin, mitoz sırasında sitokinetik halka kapanırken radyal olarak hareket eden periyodik miyozin birikimleri HeLa hücrelerinde gözlenmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, yumurta kapları altı saatten daha kısa bir sürede bir kopyadan hazırlanabilir ve hücrelerin doldurulması yaklaşık 15 dakika içinde yapılabilir. Bu işlemi denerken, incelenen hücrelere yumurta kaplarının boyutuna sahip olmak önemlidir.

Bu prosedür, ilaç şirketlerinde kitlesel tarama faaliyetleri için yüksek içerikli tarama platformlarına ve ayrıca bireysel spesifik tedavilerin değerlendirilmesinde hastaların kişiselleştirilmiş tanı tahlillerine daha fazla uyarlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, yumurta kapları mikro boşluklarının nasıl üretileceğini ve kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Yumurta kapları, memeli hücreleri gibi duvarsız tek tek hücrelerden maya ve embriyo gibi duvarlı sistemlere kadar çeşitli benzer sistemleri standartlaştırır ve düzen oluşturur.