Name: Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Keşfedin fare fetal karaciğer kültür sistemi ile terminal eritropoezisin erken ve geç dönemlerinde hedef gen işlevlerini. Bu yöntem akış sitometrisi ile hücre farklılaşmasını ve enükleasyon kinetiğini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH R00HL102154 tarafından desteklenen ve P Ji Hematoloji bilim adamı ödülü bir Amerikan Derneği oldu.

Bu protokol açıklanan deneyler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Kültür ortamına hazırlanması 1. <ol><li> Fibronektin çözeltisi hazırlayın. , Insan fibronestini (1 mg) ile bir şişe su 1 ml ilave edilir. Çalkalama olmaksızın 30 dakika boyunca doku kültürü kaputu çözeltisi bırakın. 20 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona yapmak için PBS, 50 ml toplam sıvı transferi ve yavaşça karıştırın. Plakası (aşağıya bakınız) kaplamadan önce fibronektin çözelti taze olun. </li><li> Epo serbest ortamda (SCF orta) 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığı zaman Tablo 1&#39;de listelenen katkı maddelerinin bir araya getirin. Ortamı 1 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> EPO ihtiva eden bir ortamda 50 ml hazırlayın. Taze yapıldığı zaman Tablo 2&#39;de sıralanan terkip maddelerinin bir araya getirin. Ortamı 1 ay boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li></ol&gt; 2. Fibronektin Kaplı Plaka <ol><li> 6 çukurlu bir levha (ya da 12 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna 0.5 ml) her bir oyuğuna, 1 mi fibronektin solüsyonu ekleyin. 1 saat boyunca doku kültürü kaputu plaka bırakın. </li><li> Iki kez steril su ile kuyu durulayın ve hava plaka kurulayın. </li><li> Plaka sarın ve 4 ° C&#39;de soğuk odada kaydedin. </li></ol> Fetal karaciğer eritroblast 3. saflaştırılması NOT: E15 E13 dan Kullanım fetal ciğeri hamile fareler (C57BL / 6) zaman aşımına. E 13.5 karaciğerler CFU-E progenitörlerin verimini en üst düzeye çıkarmak için tercih edilmektedir. Gebe fareler zamanlı elde edilmesi için, 6-8 haftalık erkek ve dişi fareler bir kafes (bir ya da iki kadın genellikle bir erkek) yerleştirilmiştir. Kadın vajinal fişler çiftleşme başarılı olup olmadığını belirlemek için ertesi sabah kontrol edildi. Fiş bulunduktan sonra gebeliğin ilk günü gündü. <ol><li> Toplam Fetal karaciğer hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Mou KurbanCO 2 inhalasyon ve servikal dislokasyon ile se. Dezenfeksiyonu için% 70 etanol ile karın püskürtün. Rahim kaldırmak için diseksiyon makas ile karın açın. 1x PBS rahim yıkayın. </li><li> Bir doku kültürü kaputu ve otoklavlanmıştır araçlarını kullanarak steril koşullar altında fetusa incelemek ve 1x PBS içinde yıkayın. </li><li> Fetusundan fetal karaciğerleri teşrih. Yavaşça başka bir forseps ile vücuttan uzak fetal karaciğer (renkli pembe) çekin, bir forseps ile fetusun gövdesini tutun. Ilişkili fibrotik dokuların kaldırmak için forseps ile fetal karaciğer temizleyin. % 10 fetal sığır serumu içeren taze 1x PBS içine tüm cenin karaciğerleri yerleştirin. </li><li> Mekanik yukarı ve aşağı pipetleme fetal karaciğerleri bozabilir. </li><li> 50 ml konik tüp içine 40 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu filtre. 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de Pelet hücreleri. </li><li> FBS, süpernatan aspire edin ve% 10 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri (yaklaşık 8 E 13.5 cenin karaciğeri) ml başına. </li></ol></li><li> Negatif Ter119 eritroblast saflaştırılması <ol><li> 15 dakika boyunca buz üzerinde sıçan IgG&#39;si ile hücreleri (0.2 mg / ml) bloke eder. </li><li> , Yıkama ya da santrifüj olmadan hücre süspansiyonu (1 ug / ml) biyotinile anti-Ter119 antikor ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de 10% FBS (1:10) ve santrifüj ile 1x PBS içinde yıkayın. % 10 FCS içeren 1 ml PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 75 ul ekle manyetik parçacıklar ile konjüge edilmiş ve buz üzerinde 10 dakika inkübe streptavidin. </li><li> PBS% 10 FBS içeren 2.5 ml hacim ekleyin. Alt tüp yuvarlak 5 ml&#39;lik polipropilen içine hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> Manyetik hücre sınıflandırma düzeneğinin içine takın ve tüp, 10 dakika için inkübe edilir. Ter119 pozitif hücreler, tüp yan ekleme. Serbest Ter119 negatif Eritroblastlar süspansiyon halinde kalır. </li><li> Alt tüp yuvarlak yeni bir 5 ml&#39;lik polipropilen içine hücre süspansiyonu dökün. </li><li><html> Tekrar kalan Ter119 pozitif hücrelerini kaldırmak için 3.2.6 ve 3.2.7 adımları. </li><li> 5 dakika boyunca 800 x g&#39;de Pelet hücreleri. Süpernatant aspire. % 10 FBS içeren 1 ml PBS içerisinde yeniden süspanse edin ve hücreleri, tripan mavi ile canlı hücreleri sayın. </li></ol></li></ol> Virüsler kodlayan cDNA ya da shRNA 4. İletimi <ol><li> 3-5 de saflaştırılmış Ter119 negatif cenin karaciğer hücreleri levhası X 10 5/12-gözlü plaka kaplanmış bir fibronektin (farklı plaka kullanılması durumunda, hücre sayısını ayarlamak) olarak. </li><li> Viral iletimini kolaylaştırmak için 10 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar polibren ekleyin. Sıkma 37 ° C 1-1.5 saat boyunca 800 x g hızında, lentivirüsleri ya da retrovirüsler, kodlayan cDNA ya da shRNA ile hücreleri enfekte etmektedir. </li></ol> Kalıt aktarımlı Ter119 Negatif Fare fetal karaciğer eritroblast 5. Kültür <ol><li> (Şekil 1 kesik çizgiler) terminali eritropoezin erken evrede gen fonksiyonlarını test etmek için.&quot;&gt; </ol.><ol><li><ol. li=""> Kültür 12 saat boyunca EPO barındırmayan ortam (SCF ortam) olarak transduse edilmiş hücrelerin transduse genler ve progenitör bir durumun muhafazası ekspresyonunu sağlamak için. </ol.></li><li> 5 dakika boyunca 800 xg&#39;de hücreleri santrifüj. Süpernatant aspire. 12-çukurlu bir levhanın her çukuruna ortam içeren 1 ml Epo süspansiyon hücreleri. </li><li> 24 veya 48 saat kültürden sonra, başka analizler için hücreler hasat edilir. </li></ol></li><li> Terminal eritropoezde (Şekil 1 katı çizgiler) geç evrede Test gen fonksiyonları. <ol><li> Kültür EPO ihtiva eden bir ortam içinde hemen transduse hücreleri. </li><li> 24 veya 48 saat kültürden sonra, başka analizler için hücreler hasat edilir. </li></ol></li></ol> Akış Sitometrik Analizi Kültür Fetal Karaciğer Hücreleri 6. Boyama <ol><li> Yıkayın ve 1x PBS içinde hücreleri tekrar süspansiyon. Hasat akım sitometri analizi için 2 x 10 5 kültür hücreleri. </li><li> Inkübekaranlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca florofor konjuge antikor ile hücreler. Farklılaşmasını test etmek için APC konjuge anti-CD71 ve PE konjüge anti-Ter119 kullanın. Enükleasyonu test etmek için, diğer antikorlar yanı sıra, Hoechst 33342 boyası kullanın. </li><li> 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Hücreler ölü hücreleri boyamak ve analiz dışında tutmak için% 1 FBS ve propidyum iyodür (PI) (1 ug / ml) ihtiva eden 0.5 ml PBS içerisinde süspansiyon hücreleri. </li><li> Davranış akış cytrometric analizi. Sitometresinin akışının ayarlanması ve tazminat için ilk tek renk lekeli ve lekesiz kontrolü hücreleri analiz. </li></ol>

<ol><li>Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+stem+cell+to+red+cell%3A+regulation+of+erythropoiesis+at+multiple+levels+by+multiple+proteins%2C+RNAs%2C+and+chromatin+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications.</a> Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).</li>
<li>Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+cells+red%3A+signal+transduction+mediated+by+erythropoietin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin.</a> Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).</li>
<li>Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha4beta1+integrin+and+erythropoietin+mediate+temporally+distinct+steps+in+erythropoiesis%3A+integrins+in+red+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development.</a> The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).</li>
<li>Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+by+erythropoietin+of+viability+and+maturation+of+murine+erythroid+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells.</a> Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).</li>
<li>Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+2+is+required+for+chromatin+condensation+and+subsequent+enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts.</a> Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).</li>
<li>Dumitriu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox6+cell-autonomously+stimulates+erythroid+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+terminal+maturation+and+is+thereby+an+important+enhancer+of+definitive+erythropoiesis+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development.</a> Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).</li>
<li>Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+hematopoietic+stem+cell+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods.</a> Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).</li>
<li>Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+characterization+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell characterization and isolation.</a> Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).</li>
<li>Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+control+of+terminal+erythropoiesis+via+physical+interactions+among+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+research%22%5BJournal%5D)">Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells.</a> Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).</li>
<li>Bhatia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acid-mediated+effects+on+erythropoiesis+in+primary+definitive+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells.</a> Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Ras+signaling+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+cells%3A+functional+analysis+by+a+flow+cytometry-based+novel+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system.</a> Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).</li>
<li>Socolovsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a%28-%2F-%295b%28-%2F-%29+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).</li>
<li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).</li>
<li>Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokine+signaling+molecules+in+erythroid+differentiation+of+mouse+fetal+liver+hematopoietic+cells%3A+functional+analysis+of+signaling+molecules+by+retrovirus-mediated+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression.</a> Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).</li>
<li>Patel, V. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibronectin+matrix+is+required+for+differentiation+of+murine+erythroleukemia+cells+into+reticulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes.</a> The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).</li>
<li>Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-induced+suppression+of+erythropoiesis%3A+the+role+of+erythropoietin+and+a+heme+synthesis+stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor.</a> Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).</li>
<li>Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+hematology%22%5BJournal%5D)">New insights into erythropoiesis.</a> Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Burada kronolojik fare fetal karaciğer terminali eritropoezi analiz etmek için eşsiz bir sistem sunuyoruz. Farklı kültür koşulları uygulama sayesinde, başarıyla erken ve geç evrelerinde terminal eritropoezi disseke. Bu çok işlevli genlerin mekanizmaların belirlenmesi özellikle önemlidir. Örneğin, Rac GTPazlar terminali eritropoezin farklı aşamalarında önemli rol oynar. Terminal eritropoezis etkiler, hücre farklılaşması ve çoğalması erken evrede Rac GTPases engellenmesi. Diğer yandan, hücre farklılaşmasını, proliferasyon...

Eritrosit oluşumu, eritrositler olgunlaşması için multipotent hematopoetik kök hücrelerin farklılaşması işlemidir. Bu kademeli işlem, ilgili eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es), hızla bölünen eritroid koloni oluşturan birimler (CFU-Es) ve morfolojik olarak algılanabilen birçok eritroblast 1,2 oluşumunu kapsamaktadır. CFU-E projenitör hücrelerin Terminal eritropoezis sıralı eritropoietin bağımlı ve bağımsız aşamaları 2,3 içerir. Terminal eritropoezi erken aşamasında, eritropoetin (EPO), hücre yüzeyi üzerinde kendi reseptörüne bağlanan ve hücre apoptozu önlemez ve hızlı hücre bölünmesi ve gen ekspresyonunu teşvik 1,4 aşağı doğru sinyal yollarının bir dizi yol açar. Terminal eritropoezin geç evrede, Eritroblastlar derece yoğun çekirdeklerin 5 terminali hücre döngüsü çıkmak, kromatin ve çekirdek yoğunlaşmayı ve ekstrüzyon tabi. Terminalin anlayışımızeritropoezis sayesinde büyük ölçüde in vitro birkaç başarılı kullanımı ve in vivo fare modellerinde 6-9 büyük ölçüde son birkaç on yıl içinde artmıştır. Bu modeller arasında, fare, fetal karaciğer eritroblast vitro kültür içinde hücre arıtma için hızlı çoğalma ve farklılaşma dahil olmak üzere birçok avantaj kolaylığı sağlar ve insan erythropoiesis 10,11 yakından taklit eder. Bu sistemde, fare fetal dokulardan eritroid progenitör hücrelerin çok sayıda kolay Ter119 tek aşamada arıtıldıktan (olgun eritroid hücreler için bir işaret) negatif eritroblast izole edilebilir. Eritroblast iki günlük kültür boyunca, bu, hücrelerin farklılaşması Transferin reseptörüne (CD71) ve Ter119 antijenin 12 yüzey ifadesine dayalı akış sitometrik analizi ile izlenebilir. Buna ek olarak, terminal farklılaşma eritroblast enükleasyonu 1 bir DNA makinesi (Hoechst 33342) tarafından tespit edilebilir3. Bundan başka, arıtılmış ataları genetik olarak cDNA veya erythropoiesis 11,13,14 gen ekspresyonunun fonksiyonlarının mekanistik çalışmalar kolaylaştırır ve ilgilenilen genler için, küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile modifiye edilebilir. Bu terminali eritropoezin farklı aşamalarında gen işlevleri tanımlamak zor olduğundan, diğer taraftan, hızlı hücre büyüme oranı iki ucu keskin kılıç olabilir. Çoğu durumda, bu cDNA&#39;lar veya shRNAs ifade zaman terminalinde eritropoezi erken aşamasında belirli bir gen fonksiyonları, hücreler daha önce ilk aşamayı belirlemek zordur. Bu sorunu çözmek için, biz terminali eritropoezin erken ve geç evreleri incelemek için eşsiz bir sistem geliştirdi. Terminal eritropoezi erken bir aşaması için, genetik olarak tadil edilmiş Ter119 negatif Eritroblastlar EPO içermeyen ortam içeren ama kök hücre faktörü (SCF), IL-6 ve FLT3 kültürlendiligand kendi progenitör statüsünü korumak ve ifade 13 transdüse cDNA&#39;lan veya shRNA izin vermek. Hücreler, hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ihtiva eden ortam ile değiştirildi. Hücrelerin ayırt başladı Bu şekilde, transduse ya da cDNA&#39;lar shRNAs daha önce ifade edildi. Terminal eritropoezi geç aşaması için, negatif Ter119 Eritroblastlar EPO transdüksiyon sonra hemen sıvı ihtiva eden kültürlenmiştir. Bu nedenle, bir terminal eritropoezi geç evrede, ilgi konusu genlerin fonksiyonlarının analiz edebilir. Özetle, bu sistemin geniş bir uygulama terminali eritropoezin farklı aşamalarında teşrih gen fonksiyonlarını yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun MediumIMDM (IMDM)</td><td>Gibco</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>GEMINI Biyo-ürün</td><td>700-102P</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin çözeltisi</td><td>Hiklon</td><td>SV30010</td><td>100x</td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Hiklon</td><td>SH30034.01</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>Fare FIT3 Ligand (Flt-3L)</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>14-8001-80</td><td></td></tr><tr><td>Fare Rekombinant İnterlökin-6 (IL-6)&nbsp;</td><td>GEMINI Biyo-ürün</td><td>300-327P</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td></td><td></td>354008</tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td><td>STEMCELL TECH</td><td>9300</td><td>IMDM'de %10 stok</td></tr><tr><td>Eritropoietin (Epo)</td> <td>PROCRIT</td><td>NOC 59676-303-00</td><td>3.000 U / ml stok</td></tr><tr><td>Streptavidin parçacıkları Artı</td><td>BD Pharmingen</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mıknatıs</td><td>STEMCELL TECH</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Yuvarlak Tabanlı Tüp, 5 ml</td><td>FALCON</td><td></td><td></td>352063</tr></tbody></table>

fare fetal karaciğer kültür sistemi terminali eritropoiesis erken ve geç dönemlerinde hedef gene İşlevleri teşrih etmek

Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis

Eritropoez hızla birimleri oluşturan eritroid koloni (CFU-Es) bölünmesiyle ardından taahhüt eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es) ile başlayan dinamik bir süreç gerektirir. CFU-Es sonra hücreler morfolojik olarak algılanabilen ve genelde bağlantı eritroblastlarda olarak adlandırılır. Terminal eritropoezin çalışma için zorluklardan biri kronolojik bir şekilde gen fonksiyonlarını incelemek için deneysel yaklaşımların olmaması. Bu protokol, biz terminali eritropoezin erken ve geç evrelerinde gen fonksiyonlarını belirlemek için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Bu sistemde, bir fare fetal karaciğer Ter119 (olgun eritroid hücre işaretleme maddesi) negatif Eritroblastlar saflaştırılmış ve cDNA veya ilgi duyulan genler için küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile transduse. Hücreler, bundan sonra, eksojen cDNA veya shRNAs izin verirken 12 saat boyunca da projenitör sahne korumak Eritropoietin (EPO) dışındaki ortam ihtiva eden büyüme faktörleri kültürlendiifade etmek. Hücreler, egzojenez genetik malzeme, daha ifade edildi, hücre farklılaşmasını ve çoğalmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ortamına değiştirildi. Bu protokol, terminal eritropoezin erken evre gen fonksiyonlarının analizini kolaylaştırır. Geç aşama terminali eritrosit oluşumunu çalışmak için, hücreler hemen transdüksiyon sonra EPO ortamı içinde kültürlenmiştir. Transduse genetik malzeme olarak ifade edilmiştir, bu durumda, hücreler daha önce, terminal eritropoezi geç dönem için farklılaştırılmıştır. Biz terminali eritropoezin farklı aşamalarında detaylı gen fonksiyonlarını anlamak yardımcı olacak bu stratejinin genel bir uygulama önerilir.

Şekil 1, deneysel stratejileri açıklamaktadır. Bu protokol, terminal eritropoezi erken ve geç aşamalarında sinyal molekülleri Hedef alma fonksiyonları için iki bağımsız koşulları oluşur. Ter119 negatif Fetal karaciğer Eritroblastlar E 13.5 fare fetüs saflaştırılmıştır. Fetal karaciğer eritrosit önce ve saflaştırma işleminden sonra, akış sitometrik analizi ile arıtma (Şekil 2A ve 2B) etkili olduğunu gösterdi. Terminal erythropoiesis (Şekil 1, kesik çizgi...

Biz terminali eritropoezin erken ve geç aşamaları masaya bir in vitro fare fetal karaciğer erythroblast kültür sistemi sunuyoruz. Bu sistem, farklı gelişim aşamasındaki özel genlerin işlevsel analiz kolaylaştırır.

Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek

Erythropoiesis involves a dynamic process that begins with committed erythroid burst forming units (BFU-Es) followed by rapidly dividing erythroid colony ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bir in vitro fare fetal karaciğer kültürü sistemi kullanarak terminal eritropoezin farklı aşamalarında gen fonksiyonunu incelemektir. Bu, ilk olarak embriyonik gün 13.5 hamile farelerden TER bir 19 negatif fare fetal karaciğer eritroblastının saflaştırılmasıyla elde edilir: İkinci adım olarak, saflaştırılmış eritroblastlar, genin fonksiyon kazancını veya kaybını incelemek için sırasıyla ilgilenilen genin CD NA veya S-H-R-N-A virüs kodlaması ile dönüştürülür. Son olarak, transdüksiyona uğrayan TER bir 19 negatif hücre, terminal eritropoezin erken ve geç evrelerinde genin işlevini incelemek için iki farklı koşuldan biri altında kültürlenir.Sonuç olarak, transdüksiyonlu hücrelerin farklılaşmasının ve enükleasyonunun farklı kinetiği, akış sitometrik analizi ile değerlendirilebilir. Dolayısıyla bu yöntem, fare atriyal ozu hakkında bilgi sağlayabilir. Lenfo, osis ve myosis gibi diğer HESI'lerin hepo sistemlerine de uygulanabilir.Fetal karaciğeri saflaştırmak için eritropblastlar, ötenazi yapılmış bir E 13 ila E 15 zamanlı hamile farenin karnını% 70 etanol ile dezenfekte ederek başlar. Daha sonra uterusu çıkarmak için karnı diseksiyon makasıyla açın ve uteru

mouse-fetal-liver-culture-system-to-dissect-target-gene-functions-at

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Doğrudan taze hasat fare kemik iliği, dalak veya fetal karaciğer farklılaşma aşamalı özel fare eritroid atalarıdır ve öncüleri, belirlenmesi ve moleküler analiz için bir akış sitometri yöntemi. Tahlil hücre yüzey belirteçleri CD71, Ter119 ve hücre boyutu dayanır.

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder.

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Embriyonik kök hücrelerin (ESC'ler) farklılaşmasında zamansal gen ekspresyonunun manipüle edilmesi, indüklenebilir gen sistemleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu hücre hatlarının oluşturulması maliyetli ve zaman alıcıdır. Bu protokol, ES'den türetilmiş hücrelerin ayırt edilmesinde bir transgenin hızlı ekspresyonunu ve ardından aşağı akış hematopoietik farklılaşmasının analizini sağlar.

Kemirgen Embriyonik retroviral Enfeksiyon Hematopoetik Farklılaşma Analizi için Hücre Türetilmiş embriyoidlerin Vücut Kök Hücreler

Burada açıklanan protokol, minimal bir transkripsiyon faktörü setinin aşırı ekspresyonu yoluyla fare embriyonik fibroblastlarında bir hemojenik programın indüksiyonunu detaylandırır. Bu teknoloji, hematopoez, hematolojik hastalık ve hematopoietik kök hücre nakli ile ilgili gelecekteki çalışmalar için platformlar sağlamak üzere insan sistemine çevrilebilir.

Transkripsiyon Faktörleri ile fare embriyonik fibroblastlar yeniden programlama bir Hemogenic Programı tetikleyebilecek

Süzülen makrofajlar dolaşımdaki öncüllerden yetişkin dokulara sürekli olarak işlenirken, yerleşik makrofajlar, gelişme sırasında dokularını tohumlamakta ve burada progenitörlerden başka girdiler almadan korunmaktadırlar. Yerleşik makrofajların öncüleri yakın zamanda tanımlandı. Burada, yerleşik makrofaj öncüllerinin genetik kader haritalaması için yöntemleri sunuyoruz.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Üreten indüklenen için burada bizim iletişim kuralı mevcut erythroid ataları (iEPs) üzerinden fare yetişkin fibroblastlar transkripsiyon faktörü odaklı kullanarak doğrudan lineage (DLR) yeniden şekillendirmek için.

Lineage yetişkin fare Fibroblast Erythroid ataları için yeniden programlama doğrudan

Ribozom afinite saflaştırmanın (TRAP) çevirisi hücre tipine özgü translating mRNA'nın hızlı ve etkin bir şekilde izole edilmesini sağlar. Burada, karaciğer repopülasyonu ve TRAP bir fare modelinde hidrodinamik kuyruk-ven enjeksiyonu birleştiren bir yöntem göstermek hepatositlerin ifade profilini incelemek için.

Fare Karaciğerinde Hücre Tipine Özgü Gen Ekspresyonu Profiloluşturma

Burada, erken patlama oluşturan birim eritroid (BFU-e) ve koloni oluşturan birim eritroid (CFU-e) progenitörlerinin doğrudan taze fare kemik iliği ve dalağından prospektif izolasyonu için yeni bir akış sitometrik yöntemi tanımladık. Tek hücreli transkriptomik verilere dayanarak geliştirilen bu protokol, dokunun tüm eritroid progenitörlerini yüksek saflıkta izole eden ilk protokoldür.

Patlama Oluşturan Birim ve Koloni Oluşturan Birim Eritroid Progenitörlerinin Fare Dokusundan Akım Sitometrisi ile Tanımlanması ve İzolasyonu

Eritropoezin modellenmesi, bu süreçteki aktörlerin biyolojik önemini kavramak ve farklılaşma kusurlarını hafifletebilecek yeni terapötik yaklaşımları değerlendirmek için değerli bir şans sağlar. Burada, CD34+ hematopoietik kök ve progenitör hücreleri ex vivo olarak etkili bir şekilde ayırt etmek için basit ve güvenilir bir yöntem tanımlanmıştır.

İnsan Eritropoezinin Etkinliğini Değerlendirmek için Kapsamlı Bir Boru Hattı İn Vitro ve Ex Vivo

Keşfedin fare fetal karaciğer kültür sistemi ile terminal eritropoezisin erken ve geç dönemlerinde hedef gen işlevlerini. Bu yöntem akış sitometrisi ile hücre farklılaşmasını ve enükleasyon kinetiğini değerlendirir.

Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek

Daha fazla video keşfet