Lüminesans Rezonans Enerji memeli hücrelerinde ifade Membran Proteinleri Konformasyonel Değişiklikleri Eğitim transfer

Biz burada bir verici ve alıcı florofor siteleri arasında bir proteaz bölünme mevkisinin katılması, geliştirilmiş bir lüminesans Rezonans Enerji Transferi (LRET) yöntemini tarif etmektedir. Bu tadilat ile proteinlerin arıtılmadan zar proteinlerinin çalışmaya izin ilgi zar proteinleri, ortaya çıkan spesifik LRET sinyalleri elde edilmesine olanak sağlamaktadır.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fizyolojik durumlarındaki zar proteinlerindeki doğrulayıcı değişiklikleri ölçmektir. Bu, LRE ömürlerini ve dolayısıyla iki bölge arasındaki mesafeyi ölçmek için zar proteinlerinin bölgeye özgü etiketlenmesiyle elde edilir. İkinci adım olarak, ölçülebilen doğrulayıcı bir değişikliğe neden olan bir ligand eklenir.

Daha sonra, dörtlü katlardan birini parçalamak ve arka plan sinyalini elde etmek için uygun proteaz eklenir. Sonuç olarak, elde edilen sakinlerin enerji transferinden kaynaklanan floresan ömründeki değişiklik, protein yapısında meydana gelen doğrulayıcı değişiklikleri ölçmek için ölçülebilir. Bu tekniğin X ekstra kristalografi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu yöntemle proteinlerin fizyolojik durumlarındaki dinamik değişiklikleri ölçebilmemizdir.

Bu yöntem, inotropik lid reseptörleri veya tahlil algılama iyon kanalları hakkında bilgi sağlayabilse de, NICO reseptörleri gibi diğer protein türlerine de uygulanabilir. Özellikle memeli hücrelerinde zar proteinlerinin doğrulayıcı değişikliklerini incelemek bağlamında, lümines ve stres ve enerji transferi tekniğini göstereceğiz. Öğrencilerim Dino ve Swara Swami, deneye başlamadan önce prosedürü gösterecekler.

Protein içindeki olası konformasyonel değişiklikleri yansıtabilen etiketleme bölgelerini seçmek önemlidir. Mümkünse, bu belirlemeyi yapmaya yardımcı olmak için proteinin veya homolog bir proteinin kristal yapısını kullanın. Kalıntıları, seçilen kalıntıların yan zincirleri yüzeye maruz kalacak ve proteinin etiketlenebilmesi için Fluor dörtlüsü tarafından erişilebilir olacak şekilde seçin.

Protein dizisi izin veriyorsa, sistinlerden birini proteinden spesifik olarak ayırabilen bir proteaz bölünme bölgesi ekleyin. Proteini, eklenen sistinin yakınında ve proteaz bölünmesi için erişilebilir bir dizi olan bir trombin veya faktör 10'a sahip olacak şekilde konservatif olarak mutasyona uğratarak bir bölge tanıtın. Bölünme üzerine sokulan sistinlerden biri proteinin geri kalanından ayrılacak şekilde bir yer seçin.

Bazı durumlarda, bu, mutasyona uğramış bir sistinin yanında iki bölünme bölgesi gerektirebilir. Ölçülen beklenen mesafe aralığına göre, aralık 0.5 ile kat dört çiftinin R sıfırının bir katı arasında olacak şekilde zemin dörtlüsünü seçin. Bu, tipik olarak yaklaşık 35 angstrom aralığı için çok daha uzun bir ömre sahip olan arka planın daha kolay çıkarılmasına izin verir ve uygun dördüncü kat çifti, verici olarak tur şelat ve 53 angstrom sıfır R ile alıcı olarak Alexa 5 94 olacaktır.

İlgilenilen protein seçildikten sonra, tabağın dibine tampon pipetleyerek HEK hücrelerini ayırın. Daha sonra hücreleri döndürün ve peleti üç mililitre hücre dışı tampon içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra, donördeki hücreleri inkübe edin ve zeminlerini kabul edin.

Eşmolar miktarlardaki dörtlüler, oda sıcaklığında bir saat boyunca bir döndürücü üzerinde 100 ila 300 nanomolar nihai konsantrasyona kadar olan miktarlardır. Etiketlemeden sonra, bağlanmamış floru çıkarmak için hücreleri hücre dışı tamponla üç ila dört kez yıkayın ve peleti iki mililitre taze hücre dışı tampon içinde yeniden süspanse edin. Hücrelerin lre'sini ölçmek için, hücre süspansiyonunu minimum bir mililitre hacimli bir kuvars vete aktarın ve fotolüminesan spektrometrenin uyarma dalga boyunu donör floro dördünün absorbans aralığına ayarlayın.

Emisyon dalga boyunu uygun şekilde ayarlayın. Ardından, uzun ömürlü bir bileşenin kaçırılmamasını sağlamak için emisyon algılama uzunluğunu beklenen LRE ömrünün en az üç katı olacak şekilde ayarlayın ve tutarlı sonuçlar elde etmek için 99 taramadan en az üç tarama gerçekleştirin. Sonuçları bir metin dosyası olarak kaydedin ve ardından bir ligandın eklenmesine yanıt olarak bir proteinin onaylayıcı değişikliklerini ölçmek için.

Ligandı ekleyin ve bu yeni koşul altında aynı numune üzerinde her biri 99 taramadan oluşan en az üç tarama gerçekleştirin. Ardından beş birime kadar uygun proteaz ekleyin. Bölünme tamamlanana kadar sürekli tarama ve LRE verilerini analiz etmek için yaklaşık iki ila üç saat olmak üzere art arda üç tarama için kullanım ömrü boyunca başka bir değişiklik görülmez.

Alıcının hassaslaştırılmış emisyonunun ömrünü temsil eden bir eğri oluşturmak için ortalama değerleri Y ekseninde floresan yoğunluğu ve x ekseninde mikrosaniye cinsinden kullanım ömrü ile bir çizgi grafiği olarak ayarlayarak başlayın. Grafiğin Y eksenini günlük ölçeğine değiştirin. Ardından çizim menüsü altında, katman kontrolü iletişim kutusunu açın ve arka plan ortalamasını içeren verileri katman içeriği listesine aktarın.

Ardından, matematik menüsü altında, arka planın kuyruk ucu ham verinin kuyruk ucuyla çakışana kadar arka plan verilerini gerektiği gibi çarpmak veya bölmek için basit matematik işlevini kullanın ve arka plan sinyalini protein bölünmesinden önce ve sonra mevcut bırakın. Ardından, hizalanmış arka plan sinyalini ilk ham LRE sinyalinden çıkarmak ve verileri üstel bir bozunmaya sığdırmak için basit matematik işlevini tekrar kullanın. Lazer darbesinin bitiminden sonra başlayacak şekilde montaj için başlangıç sınırını ayarlayın.

Ardından, uydurma işlevi seç iletişim kutusunda, tek bir üstel azalma için ömür boyu denkleme sığdırmak üzere üstel azalmayı seçin. Y, floresan yoğunluğunu temsil ederken, Y sıfır, sistemden kaynaklanan gürültüden kaynaklanan arka plan yoğunluğunu temsil eder. Biri sinyal yoğunluğudur, T floresan ömrüdür, X zamandır ve X sıfır zaman ofsetidir.

Son olarak, X'i sıfıra sıfıra sabitleyin. Uydurma işlevini başlatın ve verilerden elde edilen kullanım ömürlerini kullanarak verileri sığdırın. Dört kat arasındaki mesafeyi hesaplamak için ormancılık denklemini kullanın.

Bir lahane donörü ile başarılı bir LRE ölçümü, milisaniye zaman aralığında yalnızca bir donör ömrüne sahip olmalıdır. Onay değişikliklerini ölçerken, spesifik LRE sinyali, ölçüm hatasının dışında kullanım ömründe bir değişiklik göstermelidir, bu daha sonra kullanım ömürlerinin uyumu ile ilişkili hataların yayılmasıyla hesaplanabilir. Hem verici hem de alıcı ile etiketlenmiş protein için hassaslaştırılmış LRE emisyonunun ömrü, milisaniye aralığında bir kullanım ömrü ile önemli ölçüde daha kısa olacaktır.

Arka plan, çıkarma, proteaz bölünmesinden sonra, zaman içinde stabil hale gelmesi gereken kullanım ömründe bir artışa neden olur ve bu da proteaz bölünmesinin tamamlandığını gösterir. LRE sinyali yalnızca bir site kümesinden geliyorsa, arka planın çıkarılmasından sonra ortaya çıkan emisyon ömrü tek bir üstel ömür vermelidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa dört ila beş saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, geliştirildikten sonra parametreleri, dalga boylarını ve steroid hızını izlemek önemlidir. Bu teknik, nörofizyolojik durumlarında zar proteinlerindeki konformasyonel değişikliklerin incelenmesinin yolunu açmıştır.