Süreksiz Sukroz Degrade'yi kullanma Sinaptik Plazma Membran ve postsinaptik Yoğunluk Proteinlerin Hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, sinaptik membranlardan ve post sinaptik yoğunluklardan gelen proteinleri zenginleştirmek için süreksiz bir sükroz gradyanı kullanarak beyin dokusunun hücre altı fraksiyonunu göstermektir. Bu, önce beyin dokusunun motorlu bir homojenizatör ile homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, ham membran protein ekstraktlarını hazırlamak için bir dizi santrifüjleme adımı vardır.

Membran ekstraktları daha sonra ultrasantrifüjleme için süreksiz bir sükroz gradyanı üzerine katmanlanır. Son adım, proteinleri gradyandan toplamaktır. Sonuç olarak, sonuçlar Western blot analizi yoluyla sinaptik protein seviyelerindeki değişiklikleri gösterebilir.

Bu, sinirbilimciler tarafından 40 yılı aşkın bir süredir kullanılan köklü bir tekniktir. Farklı Nörotransmitter sistemlerini bozduğumuzda sinapsın protein bileşiminin nasıl değiştiğini anlamak için laboratuvarımızda kullanıyoruz. Bu tekniğin, çağrı başına gradyanlar veya sürekli sükroz gradyanları gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, süreksiz sükroz gradyanlarının elle oluşturulmasının daha kolay olmasıdır.

Bu protokol, motor tahrikli bir cam Teflon Homojenizatör kullanır, her zaman numuneler arasındaki tokmağı değiştirin ve durulayın ve kurulayın. Homojenizatör önce diseke edilen dokuyu dört mililitre 0.32 molar HEPA tamponlu sükroz çözeltisi ile 13 mililitrelik bir tüpe yükleyin. Daha sonra dokuyu temiz bir cam homojenizatöre aktarın.

Motoru 900 RPM'ye ayarlayın ve dört gramdan daha az doku kullanarak numuneyi 30 saniye boyunca 12 vuruşla homojenize edin, iyi bir fraksiyonasyon sağlayın, numuneyi tekrar tüpe aktarın ve protein analizi için eksi 80 santigrat derecede 100 mikrolitrelik bir alikot saklayın. Daha sonra, homojenatı 900 G'de 10 dakika döndürerek nükleer malzemeyi ayırın. Dört santigrat derecede, süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.

Süpernatant, ham zar fraksiyonunu içerir. Şimdi ham sinaptozom santrifüjünü zenginleştirmek için, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 10.000 G'deki süpernatanı çıkarın. Pelet, ham sinaptozom fraksiyonu Resus'u içerir.

Bir mililitre 0.32 molar sükroz çözeltisi içinde süspanse edin. Daha sonra, süspansiyona üç mililitre daha çözelti ile ham fraksiyonu 15 dakika santrifüjleyin Dört santigrat derecede 10.000 G'de, süpernatanı çıkarın. Şimdi peleti hızlı bir şekilde bitleyin, peleti bir mililitre saf suda tekrar süspanse edin.

Sonra hızlıca üç mililitre daha su ekleyin. Bunu homojenizatöre aktarın. Elle üç vuruş uygulayın ve 13 mililitrelik tüpe geri aktarın.

Numuneyi, 16 mikrolitre bir molar HEA ilavesiyle hızlı bir şekilde dört milimolar HEA'ya geri ayarlayın ve ters çevirerek karıştırın. Şimdi numuneyi yarım saat boyunca dört santigrat derecede bir döndürücüye koyun. Numune lizizini sağlamak için, Lysed P iki asal fraksiyonu peletleyerek fraksiyonlamayı bitirin.

Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 25.000 G'de döndürün, süpernatanı çıkarın, peleti bir mililitre sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Bu, zenginleştirilmiş sinap epizomal zarları içerir. İlk olarak, süreksiz bir sükroz gradyanı yapmak için tamponları önceden ölçün.

Biri tam olarak 3,5 mililitre 1,2 molar yığın tamponlu sükroz çözeltisi içeren üç tüpü aşağıdaki gibi yükleyin. Bir diğeri tam olarak üç mililitre 1.0 molar çözelti ve üçüncüsü üç mililitre 0.8 molar çözelti ile. Daha sonra, bir cam pester pipeti ile 1.2 molar sükroz çözeltisini 12 mililitrelik bir polimer ultrasantrifüj tüpüne aktarın.

Yeni bir pipetle, 1.0 molar solüsyonu dikkatlice 1.2 molar solüsyonun üzerine yerleştirin. 1.2 molar solüsyonu rahatsız etmeyin veya pipetle kabarcıklar oluşturmayın. 0.8 molar solüsyonu üstüne katlamak için aynı tekniği kullanın.

Dikkatli ol. Bir tezgah girdabından veya mikro santrifüjden gelen küçük titreşimler, gradyanın bütünlüğünü bozmak için yeterlidir. Degradeleri dikkatli ve verimli bir şekilde oluşturmak önemlidir.

Çok uzun sürerse veya gradyan titreşime maruz kalırsa, sonraki adımlarda sinaptik zarları kurtaramazsınız. Şimdi başka bir papaz pipeti ile zenginleştirilmiş sinap epizomal membran fraksiyonunu hazırlanan gradyanın üzerine katmanlayın. Sallanan bir kova rotorundaki bir ultrasantrifüjdeki gradyanı hassas bir şekilde dengeleyin.

Daha sonra dört santigrat derecede iki saat boyunca 150.000 G'de döndürün. Santrifüjlemeden sonra gradyanı kovadan çıkarırken çok dikkatli olun, berrak sakaroz çözeltisi bantları olmalıdır. Her arayüzde protein fraksiyonları ve bir pelet ile, fraksiyonlar dağınık olmamalıdır.

18 gauge iğne ve bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, 1.2 molar arayüzün en alt kısmını delin ve sinaptik plazma zarlarını içeren beyaz protein bandını geri çekin. Bu katmanın hacmini kaydedin. Katmanı 3,5 mililitre kalınlığında duvarlı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.

Tam olarak 2.5 hacim dört milimolar HEA ekleyin. Daha sonra, sabit açılı bir rotorda 0.32 molar HEA tamponlu sükroz çözeltisi içeren bir dengeleyici tüp hazırlayın, numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 200.000 G'de ultrasantrifüjleyin. Ardından Senna'yı atın ve sinaptik plazma zarı peletini yeniden süspanse edin.

300 mikrolitre 50 milimolar HEA'da iki milimolar EDTA çözeltisi. Sinaptik sonrası yoğunluk fraksiyonu veya PSD fraksiyonu artık aynı tekniklerin daha fazla kullanılmasıyla toplanabilir. Adımlar metin protokolünde açıkça belirtilmiştir.

Bir toplam protein, sinaptik plazma zarı ve ilk sinaptik sonrası yoğunluk protein fraksiyonları ile bir western blot çalıştırıldı. PSD fraksiyonuna sadece bir deterjan tedavisi uygulandı ve doku fare striatumundan alındı. Dopamin taşıyıcı gibi presinaptik proteinler, SPM fraksiyonunda zenginleştirilir, ancak PSD zenginleştirmesi için sonraki deterjan adımında elimine edilir.

Bu prosedürü denerken, tüm numuneleri buz üzerinde tutmayı ve bu prosedürü takiben proteaz ve fosfataz inhibitörlerini dahil etmeyi unutmamak önemlidir. Western kan analizi veya iki boyutlu jel elektroforezi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Daha sonra ilaç tedavisinin sinapstaki reseptör seviyelerini nasıl etkilediği gibi soruları cevaplayabilirsiniz.