Süreksiz Sukroz Degrade'yi kullanma Sinaptik Plazma Membran ve postsinaptik Yoğunluk Proteinlerin Hazırlanması
September 3rd, 2014
Bu makalede, bir sükroz gradyanı üzerinde süreksiz bir ultra-santrifüj ile sinaptik plazma membranı ile bağlantılı proteinlerin zenginleştirme göstermektedir. Post-sinaptik yoğunluk proteinlerin takip eden hazırlama de tarif edilmektedir. Protein preparatları western blotting ya da 2 boyutlu DIGE analiz için uygundur.
Bu prosedürün genel amacı, sinaptik membranlardan ve post sinaptik yoğunluklardan gelen proteinleri zenginleştirmek için süreksiz bir sükroz gradyanı kullanarak beyin dokusunun hücre altı fraksiyonunu göstermektir. Bu, önce beyin dokusunun motorlu bir homojenizatör ile homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, ham membran protein ekstraktlarını hazırlamak için bir dizi santrifüjleme adımı vardır.
Membran ekstraktları daha sonra ultrasantrifüjleme için süreksiz bir sükroz gradyanı üzerine katmanlanır. Son adım, proteinleri gradyandan toplamaktır. Sonuç olarak, sonuçlar Western blot analizi yoluyla sinaptik protein seviyelerindeki değişiklikleri gösterebilir.
Bu, sinirbilimciler tarafından 40 yılı aşkın bir süredir kullanılan köklü bir tekniktir. Farklı Nörotransmitter sistemlerini bozduğumuzda sinapsın protein bileşiminin nasıl değiştiğini anlamak için laboratuvarımızda kullanıyoruz. Bu tekniğin, çağrı başına gradyanlar veya sürekli sükroz gradyanları gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, süreksiz sükroz gradyanlarının elle oluşturulmasının daha kolay olmasıdır.
Bu protokol, motor tahrikli bir cam Teflon Homojenizatör kullanır, her zaman numuneler arasındaki tokmağı değiştirin ve durulayın ve kurulayın. Homojenizatör önce diseke edilen dokuyu dört mililitre 0.32 molar HEPA tamponlu sükroz çözeltisi ile 13 mililitrelik bir tüpe yükleyin. Daha sonra dokuyu temiz bir cam homojenizatöre aktarın.
Motoru 900 RPM'ye ayarlayın ve dört gramdan daha az doku kullanarak numuneyi 30 saniye boyunca 12 vuruşla homojenize edin, iyi bir fraksiyonasyon sağlayın, numuneyi tekrar tüpe aktarın ve protein analizi için eksi 80 santigrat derecede 100 mikrolitrelik bir alikot saklayın. Daha sonra, homojenatı 900 G'de 10 dakika döndürerek nükleer malzemeyi ayırın. Dört santigrat derecede, süpernatanı 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın.
Süpernatant, ham zar fraksiyonunu içerir. Şimdi ham sinaptozom santrifüjünü zenginleştirmek için, dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 10.000 G'deki süpernatanı çıkarın. Pelet, ham sinaptozom fraksiyonu Resus'u içerir.
Bir mililitre 0.32 molar sükroz çözeltisi içinde süspanse edin. Daha sonra, süspansiyona üç mililitre daha çözelti ile ham fraksiyonu 15 dakika santrifüjleyin Dört santigrat derecede 10.000 G'de, süpernatanı çıkarın. Şimdi peleti hızlı bir şekilde bitleyin, peleti bir mililitre saf suda tekrar süspanse edin.
Sonra hızlıca üç mililitre daha su ekleyin. Bunu homojenizatöre aktarın. Elle üç vuruş uygulayın ve 13 mililitrelik tüpe geri aktarın.
Numuneyi, 16 mikrolitre bir molar HEA ilavesiyle hızlı bir şekilde dört milimolar HEA'ya geri ayarlayın ve ters çevirerek karıştırın. Şimdi numuneyi yarım saat boyunca dört santigrat derecede bir döndürücüye koyun. Numune lizizini sağlamak için, Lysed P iki asal fraksiyonu peletleyerek fraksiyonlamayı bitirin.
Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 25.000 G'de döndürün, süpernatanı çıkarın, peleti bir mililitre sükroz çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Bu, zenginleştirilmiş sinap epizomal zarları içerir. İlk olarak, süreksiz bir sükroz gradyanı yapmak için tamponları önceden ölçün.
Biri tam olarak 3,5 mililitre 1,2 molar yığın tamponlu sükroz çözeltisi içeren üç tüpü aşağıdaki gibi yükleyin. Bir diğeri tam olarak üç mililitre 1.0 molar çözelti ve üçüncüsü üç mililitre 0.8 molar çözelti ile. Daha sonra, bir cam pester pipeti ile 1.2 molar sükroz çözeltisini 12 mililitrelik bir polimer ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
Yeni bir pipetle, 1.0 molar solüsyonu dikkatlice 1.2 molar solüsyonun üzerine yerleştirin. 1.2 molar solüsyonu rahatsız etmeyin veya pipetle kabarcıklar oluşturmayın. 0.8 molar solüsyonu üstüne katlamak için aynı tekniği kullanın.
Dikkatli ol. Bir tezgah girdabından veya mikro santrifüjden gelen küçük titreşimler, gradyanın bütünlüğünü bozmak için yeterlidir. Degradeleri dikkatli ve verimli bir şekilde oluşturmak önemlidir.
Çok uzun sürerse veya gradyan titreşime maruz kalırsa, sonraki adımlarda sinaptik zarları kurtaramazsınız. Şimdi başka bir papaz pipeti ile zenginleştirilmiş sinap epizomal membran fraksiyonunu hazırlanan gradyanın üzerine katmanlayın. Sallanan bir kova rotorundaki bir ultrasantrifüjdeki gradyanı hassas bir şekilde dengeleyin.
Daha sonra dört santigrat derecede iki saat boyunca 150.000 G'de döndürün. Santrifüjlemeden sonra gradyanı kovadan çıkarırken çok dikkatli olun, berrak sakaroz çözeltisi bantları olmalıdır. Her arayüzde protein fraksiyonları ve bir pelet ile, fraksiyonlar dağınık olmamalıdır.
18 gauge iğne ve bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, 1.2 molar arayüzün en alt kısmını delin ve sinaptik plazma zarlarını içeren beyaz protein bandını geri çekin. Bu katmanın hacmini kaydedin. Katmanı 3,5 mililitre kalınlığında duvarlı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
Tam olarak 2.5 hacim dört milimolar HEA ekleyin. Daha sonra, sabit açılı bir rotorda 0.32 molar HEA tamponlu sükroz çözeltisi içeren bir dengeleyici tüp hazırlayın, numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 200.000 G'de ultrasantrifüjleyin. Ardından Senna'yı atın ve sinaptik plazma zarı peletini yeniden süspanse edin.
300 mikrolitre 50 milimolar HEA'da iki milimolar EDTA çözeltisi. Sinaptik sonrası yoğunluk fraksiyonu veya PSD fraksiyonu artık aynı tekniklerin daha fazla kullanılmasıyla toplanabilir. Adımlar metin protokolünde açıkça belirtilmiştir.
Bir toplam protein, sinaptik plazma zarı ve ilk sinaptik sonrası yoğunluk protein fraksiyonları ile bir western blot çalıştırıldı. PSD fraksiyonuna sadece bir deterjan tedavisi uygulandı ve doku fare striatumundan alındı. Dopamin taşıyıcı gibi presinaptik proteinler, SPM fraksiyonunda zenginleştirilir, ancak PSD zenginleştirmesi için sonraki deterjan adımında elimine edilir.
Bu prosedürü denerken, tüm numuneleri buz üzerinde tutmayı ve bu prosedürü takiben proteaz ve fosfataz inhibitörlerini dahil etmeyi unutmamak önemlidir. Western kan analizi veya iki boyutlu jel elektroforezi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Daha sonra ilaç tedavisinin sinapstaki reseptör seviyelerini nasıl etkilediği gibi soruları cevaplayabilirsiniz.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, sinaptik plazma membranıyla ilişkili proteinlerin, aralıksız sakaroz gradyanında ultrasantrifüjleme kullanılarak zenginleştirilmesini açıklamaktadır. Prosedür, beyin dokusunun subsellüler fraksiyonlanmasını ve sinaptik membranlar ve postsinaptik yoğunluklardan proteinlerin zenginleştirilmesini göstermektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Protein Analizi
Arka Plan
- Sinaptik protein seviyelerini anlamak, sinirbilim araştırması için çok önemlidir.
- Sinaptik membranlar ve postsinaptik yoğunluklar, nöronal iletişimde kilit roller oynar.
- Ultrasantrifüjleme, protein zenginleştirme için standart bir tekniktir.
- Western blotting ve 2D DIGE, protein analizi için yaygın kullanılan yöntemlerdir.
Çalışmanın Amacı
- Sinaptik membranlar ve postsinaptik yoğunluklardan proteinleri zenginleştirmek.
- Daha ileri analizler için uygun protein ekstrelerini hazırlamak.
- Protein zenginleştirmedeki aralıksız sakaroz gradyanının etkinliğini göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Bir elektrikli homojenizatör kullanılarak beyin dokusunun homojenize edilmesi.
- Ham membran protein ekstrelerini hazırlamak için bir dizi santrifüjlemeyi içeren adımlarla.
- Membrana ekstrelerini aralıksız sakaroz gradyanı üzerine katmanlaştırma.
- Proteinleri gradyandan toplamak için ultrasantrifüjleme.
Ana Sonuçlar
- Sinaptik plazma membran proteinlerinin başarılı bir şekilde zenginleştirilmesi.
- Analiz için postsinaptik yoğunluk proteinlerinin hazırlanması.
- Sonuçlar sinaptik protein seviyelerindeki değişiklikleri gösterebilir.
- Western blot analizi ve 2D DIGE için uygundur.
Sonuçlar
- Yöntem, sinaptik membranlardan proteinleri etkili bir şekilde zenginleştirir.
- Sinaptik protein dinamiklerini incelemek için bir temel sağlar.
- Çeşitli sinirbilim araştırma sorularına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Synaptic protein quantification enables mechanistic de-risking in CNS target validation by linking molecular changes to functional phenotypes. This subcellular fractionation method supports predictive confidence in early discovery by isolating disease-relevant synaptic compartments. It provides a disease-relevant system for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of synaptic plasma membrane and postsynaptic density protein trafficking.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate synaptic compartments for target de-risking.
- Predictive Value: Supports biomarker alignment by measuring changes in presynaptic and postsynaptic protein levels following pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated synaptic protein fractions for use in phenotypic screening assays to evaluate compound effects on synaptic integrity.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative protein outputs suitable for assay standardization and high-content analysis.
- Scalability: The discontinuous sucrose gradient method allows batch processing of samples for consistent screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by isolating synaptic proteins from specific brain regions, such as striatum, to study neuropsychiatric targets.
- Operational Value: Supports translational biomarker development by providing quantifiable synaptic protein readouts correlated with functional outcomes.
- Risk Mitigation: Facilitates preclinical continuity by linking target modulation to measurable changes in synaptic protein composition.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative synaptic protein data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating synaptic compartments affected by neurotransmitter system perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through production of enriched synaptic plasma membrane and PSD fractions suitable for Western blot or 2D DIGE analysis.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (protein band intensity) that allow comparison of synaptic protein levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling assessment of synaptic protein changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for synaptic protein isolation across multiple CNS projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of synaptic protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via a well-established discontinuous sucrose gradient protocol with defined centrifugation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative synaptic protein data that de-risks CNS target progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on measurable effects on synaptic protein composition and synaptic function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation, ultracentrifugation, and synaptic biology to ensure proper gradient formation and fraction collection.
- Dependent on access to ultracentrifuge with swinging bucket and fixed angle rotors, and capability to maintain samples at 4°C throughout processing.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, tissue homogenization, and protease/phosphatase inhibitor use to ensure reproducibility across sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different brain regions or disease models due to variations in synaptic protein expression and tissue yield.
- Practical limitations include the need for fresh or properly stored tissue and careful handling to prevent gradient disruption from vibration or delays during setup.
