Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

Bu prosedürün genel amacı, beyin kaynaklı nörotrofik faktörün veya BDNF'nin retrograd aksonal taşınmasını canlı görüntüleme ile izlemektir. Bu, ilk olarak polilisin kaplı örtü kızakları üzerine mikroakışkan odaların monte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci aşamada, ayrışmış sıçan E 18 hipokampal nöronları diseke edilir ve mikroakışkan odanın hücre gövdesi bölmesinde kaplanır.

Daha sonra, nöronlar, aksonların mikro oluklar boyunca odanın aksonal bölmesine uzatılmasına izin vermek için kültürlenir. Son adımda, akson bölmesine BDNF etiketli kuantum noktası eklenir. Sonuç olarak, hipokampal nöronun aksonları içindeki BDNF hareketini değerlendirmek için floresan mikroskobu kullanılabilir.

Bu tekniğin B-D-F-E-G-I-P veya BDFM kiraz etiketleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, BDF'nin kuantum nokta ile etiketlenmesinin, prosedürün olacağını gösteren aksonlar içindeki tek bir BDF dimerinin ışıkla görüntülenmesine izin vermesidir. Sol üçümden bir direk noktası çizin, Mikroakışkan odaları% 1 aox'ta elde yıkayarak başlayın, ardından mili Q suyunda 30 dakikalık üç durulama yapın. Daha sonra hazneleri %70 etanolde elde yıkadıktan sonra, laminer akışlı bir davlumbazda param üzerinde kurumaya bırakın, haznelerin her iki tarafını UV ışığı altında 20 dakika sterilize edin ve ardından yayılan hazneleri oda sıcaklığında param ile kapatılmış 15 santimetrelik steril bir tabakta saklayın.

Sonra, 24 x 40 milimetre ıslatın. Bir numaralı cam kapak, bir döndürücü üzerinde gece boyunca %10 hidroklorik asit içinde kayar ve ardından son yıkamadan sonra 30 dakikalık üç kez su ile yıkanır. Her bir kapak fişini %100 etanole batırarak sterilize edin, ardından bir bunsen brülörü üzerinde alevlendirin ve oda sıcaklığında steril bir Petri kabında kuru olarak saklayın.

Kapak fişlerini kaplamak için, bunları 15 santimetrelik bir kültür kabına koyun ve ardından her birini 0,7 mililitre% 0,01 poli L lizin ile kaplayın. Doku kültürü başlığında bir saatlik bir inkübasyondan sonra, kapak fişlerini tekrar steril su ile üç kez durulayın ve ardından bir vakumla kurulayın ve altı santimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Ardından, sterilize edilmiş odalardan birini, mikro oluk tarafı aşağı bakacak şekilde poli L lizin kaplı bir kapak kızağı üzerine yerleştirin.

Mikro oluklara dokunmamaya dikkat edin ve hazneye hafifçe bastırmak için bir mikro pipet ucu kullanın ve monte edilmiş mikroakışkan hazneyi sıkıca kapatın. Şimdi iki E 17 ila E 18 sıçan Hippo Campi'yi iki mililitre diseksiyon tamponu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve dokuları her seferinde beş mililitre diseksiyon tamponu ile üç kez durulayın. Daha sonra mümkün olduğu kadar çok yıkamayı çıkarın ve dokuyu sindirmek için 900 mikrolitre taze diseksiyon tamponu ekleyin.

Daha sonra, dokulara 100 mikrolitre% 2.5 tripsin ekleyin ve tüpü 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin. 10 dakikalık sindirimden sonra, 100 mikrolitre DNA ekleyin ve karıştırmadan hemen sonra dokuları beş ila 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı hareket ettirmek için ateşle parlatılmış bir PE cam pipet kullanın. Denemeyi iki mililitre kaplama ortamı ile söndürün ve döküntülerin doku kültürü başlığında beş dakika boyunca tüpün dibine çökmesine izin verin.

Daha sonra, iki mililitre süpernatanı dikkatlice temiz steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri resüs şeklinde döndürün. Peleti 50 mikrolitre kaplama ortamında askıya alın ve ardından saydıktan sonra, 15 ila 20 mikrolitre hücre süspansiyonunu mikroakışkan odanın bir bölmesine yükleyin. Hücrelerin kapak kızağına yapışmasına izin vermek için hazneyi 10 dakika inkübe edin ve ardından haznenin her iki bölmesini de doldurmak için daha fazla kaplama ortamı ekleyin.

Bir günlük inkübasyondan sonra, kaplama ortamını hem hücre gövdesinde hem de akson bölmelerinde bakım ortamıyla değiştirin. Üçüncü günde, hipokampal nöronlardan gelen aksonlar, beşinci ve yedinci günler arasında akson bölmesine ulaşan mikro olukları geçmeye başlar. Bu süre zarfında, kuantum etiketli BDNF Aksonal Taşımanın canlı görüntülenmesinden önce her 24 ila 48 saatte bir kültür ortamının yarısını yeni bakım ortamıyla değiştirin.

Mikroakışkan odanın her iki bölmesini BDNF tükenmesi sırasında iki saat boyunca her 30 dakikada bir BDNF içermeyen serum içermeyen nöro bazal medya ile iyice durulayın, 50 nano molar mono biyotinillenmiş BDNF dimerini 50 nano molar kuantum ile inkübe edin. Nöro bazal ortamda 6 dakika boyunca buz üzerinde 6 5 5 strippin konjugatları yapın. Ardından, BDNF etiketli kuantum noktasının hücre gövdesi bölmesine yayılmasını en aza indirmek için akson bölmesindeki ortamı, 37 santigrat derecede dört saat boyunca BDNF etiketli 300 mikrolitre kuantum nokta ile değiştirin.

Hücre gövdesi bölmesinde, inkübasyon, ısınma ve ters mikroskop sonunda, 100 x yağ objektifi ve ekipman ısınırken 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit sabit bir sıcaklığa kadar bir çevre odası ile donatılmış akson bölmesinden her zaman daha yüksek bir ortam seviyesinin korunması çok önemlidir. Mikroakışkan odadan BDNF etiketli bağlanmamış kuantum noktasını yıkayın ve ardından kuantum noktası 6 5 5 sinyalini görselleştirmek için bir dizi Texas kırmızı uyarma ve emisyon küpü kullanın. Son olarak, orta aksonlar içinde saniyede bir kare hızında toplam iki dakika boyunca hızlandırılmış görüntüler yakalamak için bir CCD kamera kullanın.

Sızma kontrolü olarak QD'si olmayan aksonsuz mikro oluklar kullanın ve kuantum nokta etiketli BDNF sinyal aktarımının hızlandırılmış görüntülemesinde uygun görüntü analiz yazılımını kullanarak BDNF taşınmasını analiz edin Aksonlu mikro olukların çoğunda kuantum nokta sinyalleri gözlenirken, aksonların olmadığı mikro oluklarda kuantum sinyali görülmez, bu da akson bölmesinden kuantum nokta sinyalinin çok az yayıldığını veya hiç yayılmadığını gösterir Buradaki hücre gövdesi bölmesine. Bir hipokampal nöron aksonunun 80 mikrometre uzunluğundaki bir segmenti, 100 saniye boyunca floresan olarak kaydedildi. Toplam altı.

Kuantum BDNF sinyalleri, görüntüleme sırasında açıkça kaydedildi ve üçünün hücre gövdesine doğru tek yönlü olarak hareket ettiği gözlemlendi. Bir sinyalin hücre gövdesine düzgün bir şekilde hareket ettiği ve tüm alanı yaklaşık 70 saniyede geçtiği gözlemlendi. Bir diğerinin ilk 20 saniye boyunca retrograd yönde hareket ettiği, 10 ila 20 saniye boyunca antrover harekete geçtiği ve daha sonra son 20 saniye boyunca hücre gövdesine doğru tekrar yön değiştirdiği gözlendi.

Üçüncü olayın da retrograd bir yönde hareket ettiği, ancak daha sonra hareketin ortasında yaklaşık 20 saniye durakladığı kaydedildi. BDNF taşıması olarak etiketlenen kuantum noktasının bu ilk temsili çan grafiğinde, BDNF etiketli kuantum noktası, 80 mikrometre alanını yaklaşık 60 saniyede geçerek hücre gövdesine doğru hızlı ve sorunsuz bir şekilde hareket etti. Bu ikinci kronografta çok kısa duraklamalarla, kuantum BDNF, en az üç segment daha uzun duraklamalarla geriye doğru bir yönde 120 saniyede yaklaşık 50 mikrometre hareket etti.

Son olarak, dağılım grafikleri, BDNF etiketli her bir kuantum noktasının hareket hızını, ortalama hızını ve duraklama süresini ölçer. BDNF etiketli kuantum noktasının hareket hızları, saniyede 0.47 ila 1.97 mikrometre arasında değişen, saniyede ortalama 1.06 artı veya eksi 0.05 mikrometre arasında değişen nispeten hızlıydı. BDNF'nin taşıma sırasında duraklaması nedeniyle, ortalama hız, saniyede ortalama 0.48 artı veya eksi 0.03 mikrometre ile hareket eden hızdan çok daha düşüktü ve ortalama duraklama süresi 15.88 artı veya eksi 1.30 saniye Geliştirmeden sonra.

Bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların sağlıklı ve hastalık nöronlarında nörotrofin ve reseptör kaçakçılığını keşfetmelerine olanak tanır.