Name: Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Öğrenin BDNF'nin retrograd aksonal taşımacılığını mikroakışkan odacıklar ve kuantum nokta etiketleme kullanarak canlı görüntüleme ile izlemeyi. Bu yöntem nöron sağlığı ve nörodejeneratif hastalıkların anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz kendi teknik yardım için Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit teşekkür etmek istiyorum. Çalışma NIH hibe (PN2 EY016525) tarafından ve Down Sendromu Araştırma ve Tedavi Vakfı ve Larry L. Hillblom Vakfı fon tarafından desteklenmektedir.

Cerrahi ve hayvan prosedürleri Bakımı NIH Kılavuzu&#39;na ve Laboratuvar Hayvanları Kullanımı göre kesinlikle yapılır. Hayvanlarının kullanıldığı bütün deneyler UCSD Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Plazmid Klonlama, mono-biyotinlenmiş BDNF sentezlenmesi ve saflaştırılması (mBtBDNF) NOT: HEK293FT hücrelerde 10 pcDNA3.1 vektörü ve birlikte açığa içine önceden proBDNFavi ve BirA cDNA Construct. MBtBDNF olgun ve biyolojik olarak aktif monobiotinylated sinir büyüme faktörü (mBtNGF) üretilmesi için 10, daha önce yayınlanmış bir metoda göre Ni-NTA boncuklar kullanılarak saflaştınlır. Mikroakışkan Odaları 2. Hazırlık Mikroakışkan nöron kültür cihazı akışkan nöron hücre gövdeleri aksonlar izole edilmesini mümkün kılar. Sağ her diseksiyon önce taze kaplı lamelleri ile odaları birleştirin. Kullanılan mikroakışkan odalarıBu protokolde ticari (malzeme ve ekipmanın tabloya bakınız) satın alınır. Handwash ve 5-6x kadar yeniden piyasadan satın odaları. <ol><li> El yıkama% 1 Alconox içinde mikroakışkan odaları. 30 dakika her biri için Milli-Q su ile üç kez durulanır. % 70 etanol içinde tekrar el yıkama odaları. </li><li> Laminer akış kaputu Parafilmlerin üzerinde kurumaya odaları dışarı yatıyordu. Yayar ve UV altında 20 dakika boyunca odacıkların her iki tarafını da sterilize edin. Mağaza oda sıcaklığında Parafilm ile mühürlenmiş steril bir 15 cm çanak odaları sterilize. </li><li> Cam bir kap içinde 24 x 40 mm 1 numaralı cam lamelleri yerleştirin. Gece boyunca, bir döndürücü üzerinde% 35 hidroklorik asit lamelleri bekletin. Ertesi gün, 30 dakika su ile her biri için lamelleri üç kez yıkayın. </li><li> % 100 etanol içine Her lamel daldırma ve bir Bunsen beki üzerinde yanan tarafından lamelleri tek tek sterilize edin. Steril bir petri tabağında muhafaza edilir ve kuru lamelleri kaplaması elde edilinceye kadar oda sıcaklığında saklayın. </li><li> Ou Lay15 cm kültür çanak lamelleri t. Kaplama% 0.01 poli-L-Lisin (PLL), 0.7 ml ile her lamel ve oda sıcaklığında kaputu inkübe edin. </li><li> 1 saat sonra, lamelleri steril su ile üç kez durulanır. 6 cm kültür kabına vakum ve yerde her lamel ile kuru lamelleri. </li><li> Mikroakışkan bölmesini monte etmek için, Mikroyivlerin temas etmemek için tedbir ile PLL kaplanmış bir örtücü camın üzerine altındaki microgroove yüzü bölmenin. Yavaşça odası sıkıca kapatılmıştır sağlamak için bir pipet ile odasını basılı. </li></ol> Chambers 3. Nöronal Kültür Diseksiyon ve Levha <ol><li> % 1 pen / strep, 10 mM HEPES, 2 ml tahlil tamponuna (HBSS, herhangi bir kalsiyum, magnezyum ihtiva eden herhangi bir 15 ml konik bir tüp içinde kesildi iki E17-E18 sıçan hipokampları (bir beyin) yerleştirin. Dokular, 5 ml ile 3 kere yıkayın diseksiyonu mümkün olduğunca diseksiyon tamponu çıkarın. her zaman tampon ve taze di 900 ulssection tamponu. </li><li> , Doku sindirmek 1x çalışma konsantrasyonunu yapmak için diseksiyon tamponuna 10x tripsin (% 2.5) 100 ul ekleyin. Bir 37 ° C su banyosu içinde konik tüp yerleştirin. Sindirim 10 dakika sonra, 1 mg / ml civarında nihai bir konsantrasyona kadar, 10 mg / ml Dnaz I, 100 ul ilave edin. </li><li> Bir yangın cilalanmış Pasteur cam pipet kullanarak, hafifçe aşağı ve yukarı pipetlenerek 5-10x dokuyu Karışım. Sağ toz haline getirildikten sonra, (% 10 FBS, 2 mM Glutamax,% 2 ile B27 Neuro temelli) ortam maddesi 2 ml tripsin söndürün. </li><li> Dibe oturmaya dokuların birikintileri girmesi için 5 dakika için başlık örnek bırakın. Dikkatlice pelet hücreleri 5 dakika 200 x g&#39;de, temiz, steril 15 ml konik bir tüp ve santrifüj içine 2ml&#39;si çıkarın. 50 ul ortam kaplama pelletini </li><li> Hemositometre ile hücreleri saymak. Yük mikroakışkan odasının bir bölmesine 15-20 ul hücre süspansiyonu (~ 40.000 hücre). Bölmenininkübatör 10 dakika hücreler lamel takmak için izin için. 10 dakika sonra, bölmenin her iki bölümü doldurmak için daha fazla kaplama ortamı eklenir. </li><li> Diseksiyon ikinci gününde, tamamen bir hücre gövdesi ve akson bölmesinin her iki (2 mM glutamax,% 2 B27 ile Neurobasal) bakım medya ile kaplama ortamı değiştirin. Hipokampal nöronların aksonları, 3. gün Mikroyivlerin çapraz ve günün 5-7 arasındaki akson bölüme ulaşmak başlar. Bu süre boyunca, Bakım ortamının her 24 ~ 48 saat ile kültür ortamının yarısı değiştirin. </li></ol> QD-BDNF 4. Akson Taşıma <ol><li> , QD-BDNF aksonal taşıma Canlı görüntülemeye mikroakışkan odasının hücre gövdesi ve akson hem bölmelerden BDNF tüketmek için önce iyice ile 2 saat boyunca, BDNF içermeyen serumsuz Neuro temelli ortam her 30 dakikada bir, her iki bölümü ile yıkayın. </li><li> BDNF tükenmesi sırasında, QD-BDNF eşleniklerini hazırlamak. Mono-biyotinile BD 50 nM karıştırınNF Neurobasal ortam içinde, 50 nM QD655 streptavidin eşlenikleri ile, dimer ve 60 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> Akson bölmesinde Ortamı çıkarın ve 37 ° C&#39;de 4 saat boyunca 0.25 nM&#39;lik nihai bir konsantrasyona sahip 300 ul QD-BDNF ekleyin. Hücre gövdesi bölmesine QD-BDNF difüzyon en aza indirmek için, her zaman akson bölmesine göre hücre gövdesi bölmesinde ortamın daha yüksek bir düzeyde tutmak için çok önemlidir. Canlı görüntüleme önce kuluçkadan sonra bağlanmamış QD-BDNF yıkayın. </li><li> Bir 100X yağ objektif lens ile donatılmış ters bir mikroskop kullanılarak QD-BDNF taşıma canlı görüntüleme yürütmek. Kapsam ve sabit bir sıcaklıkta (37 ° C), CO2 (% 5), kendisine bağlı kazanı ısıtın. QD655 sinyalini görselleştirmek için Texas kırmızı uyarma / emisyon küpler bir dizi kullanın. </li><li> Edinme ve CCD kamera kullanarak 2 dakika bir toplam 1 kare / sn hızında orta akson içindeki time-lapse görüntüleri yakalayabilir. Aksonlar ile kullanımı microgrooves That hiçbir QD ve dolayısıyla infiltrasyon için bir kontrol olarak sinyal yok. </li><li> Herhangi bir görüntü analizi yazılımı veya NIH ImageJ kullanarak BDNF taşıma analiz edin. </li></ol>

<ol><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1%2FMAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li>
<li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERK+Cascade%3A+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+cancer%22%5BJournal%5D)">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).</li>
<li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trk+receptors%3A+roles+in+neuronal+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Trk receptors: roles in neuronal signal transduction.</a> Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).</li>
<li>Nonomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+and+survival+effects+of+BDNF+and+NT-3+on+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+research.+Developmental+brain+research%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells.</a> Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).</li>
<li>Weissmiller, A. M., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+using+neurotrophic+factors+to+treat+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders.</a> Translational neurodegeneration. 1, 14(2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport+of+Rab7+GTPase+results+in+dysregulated+trophic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature methods. 2, 599-605 (2005).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+at+a+time%2C+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li>
<li>Xie, W., Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+axonal+transport+of+quantum+dot+labeled+BDNF%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).</li>
<li>Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated%2C+biologically+active+neurotrophic+factors%3A+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li>
<li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon%3A+a+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li>
<li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor%3A+a+slow+route+to+the+signaling+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li>
<li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li>
<li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li>
<li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington%27s+disease+phenotypes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li>
<li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li>
<li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li>
<li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu çalışmada, biyolojik olarak aktif bir üretmek için yeni tekniğin gelişimleri, BDNF aksonal taşınması takip etmek için kullanılabilir BDNF (mBtBDNF) monobiotinylated. Kuantum dot streptavidin konjüge proteini ve bir mikroakışkan odacığı kullanılarak, yöntem, bir gerçek zamanlı olarak ve uzamsal ve zamansal çözünürlüğe kadar tek molekül hassasiyet ile primer nöronlarda aksonal taşınması BDNF algılamasını sağlar. Burada kullanılan aletler sağlık ve hastalık nöronlar BDNF / TrkB sinyalizasyon endosomlarda aksonal transpo...

Nöronlar yüksek olan uzun ve genellikle son derece özenli süreçleri kurmak ve nöral devrelerin yapısını ve işlevini korumak için temel olan hücreler polarize. Akson ve sinapsların yük taşıyan hayati bir rol oynar. Hücre soma sentezlenen proteinler ve organelleri nöronal fonksiyonu desteklemek için presinaptik terminale ulaşmak için aksonlar aracılığıyla taşınması gerekir. Buna karşılık, sinyalleri uzak aksonlar transdüse gerekir alınan ve soma aktarıldı. Bu işlemler, nöronal canlı kalmasını, farklılaşmasını ve bakım için çok önemlidir. Bazı nöronlarda aksonal taşınmasının bu mesafeler üzerinden 1.000 &#39;den fazla kez hücre gövdesi çapının yürütülmesi gereken olarak, olasılık bile hali hazırda küçük eksikliklerin belirgin nöronal devre fonksiyonunu etkileyebilir düşünülmüştür. , Beyin türevli nörotropik faktör (BDNF), büyüme faktörlerinin nörotrofin ailesinin bir üyesi, ma mevcutturhipokampus, serebral korteks ve bazal ön dahil ny beyin bölgeleri,. BDNF, bilişsel devrelerinde katılma nöronların hayatta kalmasını, farklılaşmasını ve fonksiyon destekleyerek idrak ve hafıza oluşumunda önemli bir rol oynar. BDNF, bu mitojen tarafından aktive edilen protein kinaz / hücre dışı sinyal ile düzenlenen protein kinaz (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-kinaz dahil olmak üzere, TrkB aracılı sinyalleme yolunu aktive akson terminal, kendi reseptörü, tirosin kinaz TrkB bağlanan (PI3K) ve fosfolipaz C-gama (PLCγ). Bu sinyal yolları katılan proteinler daha sonra retrograd nöronal soma taşınır endosome 1-6 sinyalizasyon BDNF / TrkB oluşturmak için endositik veziküler yapıların üzerine paketlenir. Mikroakışkan kültür oda normal şartlar altında yanı sıra yaralanma ve hastalık 7,8 ayarı aksonal biyoloji eğitimi için çok yararlı bir platform. Izole aksonlarlahücre gövdeleri, cihaz aksonlar 8-10, özellikle taşıma anlaşılmasına bir sağladı. Bu çalışmada kullanılan ve 450 um microgroove bariyerli PDMS göre mikro-akışkan platformlar ticari (Malzemeler tabloya bakınız) satın alınmıştır. BDNF, taşıma incelemek için monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) üretimi için yeni bir teknoloji geliştirilmiştir. (Da AviTag olarak da bilinir), biyotin alıcı peptidin, AP yararlandı. Bu, özellikle Escherichia coli enziminin biyotin ligazı, Bira ile biyotine bağlanabilir bir lisin kalıntısı ihtiva eden bir 15 amino asit dizisidir. Bu PCR (Şekil 1 A), fare pre-proBDNF cDNA&#39;nın C terminaline AviTag kaynaşık. Bu yapı, memeli ekspresyon vektörü pcDNA3.1 myc-his vektörü içine klonlandı. Ayrıca, pcDNA3.1 myc-his vektörü içine bakteri, BirA DNA klonlanmıştır. Iki plasmid geçici olarak her iki proteini ifade etmek için HEK293FT hücrelerine eş-transfekte edilmiştir. BirA biotun ligasyonu katalizeözel olarak bir lizin 1 de BDNF C-terminalindeki AviTag içinde ikamet: 1 oranında, BDNF monomer monobiotinylated üretmek. Biyotinile edilmiş, ~ 18 kDa bir moleküler kütleye sahip BDNF olgun geri kazanılmış ve Ni-reçinesi (Şekil 1C) kullanılarak ortamdan saflaştırılmıştır. (Şekil 1D) imüno-benekleme ile değiştirilmemiş BDNF saptamak mümkün ile karar kılındığı üzere BDNF biyotinilasyon, tamamlandı. Streptavidin konjüge kuantum noktaları, QD 655, QD-BDNF yapmak mBtBDNF etiketlemek için kullanıldı. MBtBDNF fosforile TrkB (Şekil 1E) ve rekombinant insan aktive BDNF (rhBDNF) ölçüsünde nörit gelişimini (Şekil 1F) teşvik etmek için mümkün olduğu gibi AviTag varlığı BDNF aktivitesine müdahale etmedi. QD-BDNF QD-BDNF biyoaktif (Şekil 1G) olduğunu belirten, hipokampal aksonlardaki trkB ile birlikte yerleştiğini göstermiştir immünolekeleme. BDNF taşıma incelemek için, QD-BDNF distal akson bölmesine eklenmiştirsıçan E18 hipokampal nöronlar (Şekil 2A) içeren mikrosıvı kültürler. Akson içindeki QD-BDNF retrograd taşıma kırmızı floresan etiketi (Desteklenmesi videolar S1, S2) gerçek-zamanlı canlı görüntüleme tarafından yakalandı. Oluşturulan kymograph analiz ederek, QD-BDNF yaklaşık 1.06 mm / sn (Şekil 3A) bir hızda hareket eden bir retrograd taşınacak gözlenmiştir. GFP veya MCherry etiketli BDNF BDNF aksonal hareketini izlemek için kullanılır olmuştur. Büyük dezavantajı, tek bir molekülün çalışmaları için yeterince parlak değil olmasıdır. Ayrıca, her iki anterograd ve retrograd BDNF hareketlerinin bulunması zor retrograd olarak taşınan, BDNF bir nörotrofinin / reseptör kompleksi olup olmadığını değerlendirmek için yapar. Bu videoda, biz birincil nöronları kullanarak mikroakışkan odaları QD-BDNF canlı ticaretini incelemek için kullanılan teknikleri göstermek. Ultrabrightness ve kuantum noktaları mak mükemmel fotostabilitees mümkün BDNF ulaşım uzun vadeli izleme gerçekleştirmek için. Bu teknikler, MS, HD ve diğer nörodejeneratif hastalıklar aksonal çalışmalar fonksiyonunun arttırılması için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Platin pfx DNA polimeraz&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT hücreleri</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-yüksek glikoz ortamı</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin ve nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA reçineleri</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörleri kokteyli</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; S8820</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş boyama seti&nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>İnsan rekombinant BDNF</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroakışkan odaları</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm No. 1 cam lameller&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lizin&nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ve nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>İnvitrojen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;</td><td>Canlandırıcı</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&nbsp; &nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-streptavidin konjugatları</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; </td><td></td>Q10121MP</tr><tr><td>anti-Avi etiket antikoru</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-agaroz boncukları&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojisi</td><td>&nbsp; SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-streptavidin ve nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>anti-pTrkB antikoru</td>, NYU <td></td><td></td>anti-TrkB antikoru BD <td>Science'tan Dr M. Chao'dan cömert bir hediye</td></tr><tr><td></td><td></td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

quantum akson ulaştırma gerçek zamanlı görüntüleme İlköğretim nöronlar bdnf dot-etiketli

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF nöronal hayatta kalmasını, farklılaşmasını ve fonksiyon bir çok alanda önemli bir rol oynar. Akson yapısal ve fonksiyonel açıkları giderek Alzheimer hastalığı (AH) ve Huntington hastalığı (HD) olmak üzere nörodejeneratif hastalıklar, erken bir özelliği olarak görülmektedir. Henüz tam olarak açıklanamamıştır aksonal yaralanma kaynaklı olduğu mekanizma (ler) idir. Bu biyolojik olarak aktif bir üretmek için yeni bir teknik gelişme rapor BDNF aksonal taşınması takip etmek için kullanılabilir BDNF (mBtBDNF) monobiotinylated. Kuantum nokta-etiketli BDNF (QD-BDNF) mBtBDNF kuantum nokta 655 konjuge tarafından üretildi. Mikroakışkan cihaz nöron hücre gövdeleri aksonlar izole etmek için kullanılmıştır. Aksonal bölmesine QD-BDNF eklenmesi akson BDNF ulaşım canlı görüntüleme izin verdi. Biz, QD-BDNF yaklaşık 1.06 mm / sn bir hızda hareket azından çok az duraklar, retro-esas olarak sadece hareket ettiğini gösterdi. Bu sistem beni araştırmak için kullanılabilirAH veya bozulmuş HD aksonal fonksiyonu gibi başka dejeneratif bozukluklar chanisms.

Üretim ve biyolojik olarak aktif mono-biyotinlenmiş BDNF saflaştırılması Bir AviTag dizisi (GGGLNDIFEAQKIEWHE) ile birleştirilir BDNF sentezleme vektörü, daha önce yayınlanan bir protokolün 10 ile tespit edildi. Tam uzunluklu füzyon proteininin moleküler kütlesi yaklaşık 32 kDa (olduğu kestirilmiştir <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) 18 kDa (Şekil 1A) tahmin edilen moleküler kütleye sahi...

BDNF, bir nörotrofik faktör, bir aksonal taşınması birçok nöron popülasyonlarının hayatta kalma ve fonksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bazı dejeneratif bozukluklar aksonal yapı ve fonksiyon bozulması ile işaretlenmiştir. Biz birincil nöronları kullanarak mikroakışkan odaları QD-BDNF canlı ticaretini incelemek için kullanılan teknikler gösterdi.

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Bu prosedürün genel amacı, beyin kaynaklı nörotrofik faktörün veya BDNF'nin retrograd aksonal taşınmasını canlı görüntüleme ile izlemektir. Bu, ilk olarak polilisin kaplı örtü kızakları üzerine mikroakışkan odaların monte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci aşamada, ayrışmış sıçan E 18 hipokampal nöronları diseke edilir ve mikroakışkan odanın hücre gövdesi bölmesinde kaplanır.Daha sonra, nöronlar, aksonların mikro oluklar boyunca odanın aksonal bölmesine uzatılmasına izin vermek için kültürlenir. Son adımda, akson bölmesine BDNF etiketli kuantum noktası eklenir. Sonuç olarak, hipokampal nöronun aksonları içindeki BDNF hareketini değerlendirmek için floresan mikroskobu kullanılabilir.Bu tekniğin B-D-F-E-G-I-P veya BDFM kiraz etiketleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, BDF'nin kuantum nokta ile etiketlenmesinin, prosedürün olacağını gösteren aksonlar içindeki tek bir BDF dimerinin ışıkla görüntülenmesine izin vermesidir. Sol üçümden bir direk noktası çizin, Mikroakışkan odaları% 1 aox'ta elde yıkayarak başlayın, ardından mili Q suyunda 30 dakikalık üç durulama yapın. Daha sonra hazneleri %70 etanolde elde yıkadıktan sonra, laminer akışlı bir davlumbazda param üzerinde

real-time-imaging-axonal-transport-quantum-dot-labeled-bdnf-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Organel ticareti dinamiklerini inceleyerek canlı hücre görüntüleme özellikle yardımcı programı. Burada geniş alan floresan mikroskobu kullanarak kültürlü nöronların yoğun çekirdekli veziküller canlı görüntüleme için bir protokol. Bu protokol, esnek ve diğer organeller gibi mitokondri gibi görüntü adapte edilebilir, endosomes ve peroksizomlara.

İlköğretim Kültür Hipokampal Nöronlar Yoğun çekirdekli veziküller Canlı Görüntüleme

Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Kaynak: Winkle, C. C., et al. Akson dallanması ve nöronal morfogenez sırasında plazma zarı iletiminin rolünü tanımlamak için birleşik metodolojilerin kullanılması. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, kortikal nöronlarda gerçek zamanlı aksonal dallanmayı gözlemlemek için diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu kullanan bir canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Hızlandırılmış videolar, aksonlarda lokalize ekzositoz ve hücre iskeleti yeniden düzenlemelerine neden olan bir sinyal molekülü...

Fare Kortikal Nöronlarında Aksonal Dallanmanın Gerçek Zamanlı İn Vitro Görüntülenmesi

Burada, Drosophila larva beyninin canlı bir hazırlığında son derece hareketli dendritik filopodia'yı görüntülemek için uyguladığımız yöntemi ve dendritin kantitatif değerlendirmeleri için hızlandırılmış 3D görüntüleme veri kümelerini ölçmek için geliştirdiğimiz protokolü anlatıyoruz. nöronlar gelişmekte dinamikleri.

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Avi dizisi (BDNFAvi) içeren rekombinant BDNF, HEK293 hücrelerinde uygun maliyetli bir şekilde üretilir ve afinite kromatografisi ile saflaştırılır. BDNFavi daha sonra doğrudan mono-biyotinylated enzim BirA ile bir tüp içinde. BDNFavi ve mono-biyotinylated BDNFavi ticari olarak kullanılabilir BDNF ile karşılaştırıldığında kendi biyolojik aktivitelerini korumak.

Nöronlarda Hücresel İnsan Ticareti Çalışmaları Için Bir Tüpte Doğrudan Mono-Biyotinylate Rekombinant BDNF'yi Arındırmak ve Doğrudan Bir Protokol

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Burada, postnatal fare retinal eksplantlarında nörit morfogenezini hızlandırılmış konfokal mikroskopi ile araştırmak için bir yöntem sunuyoruz. Membran hedefli floresan proteinlerini Cre'e bağımlı bir şekilde eksprese eden rekombinant adeno ilişkili virüs vektörlerini kullanarak retina hücre tiplerinin ve ince süreçlerinin seyrek etiketlenmesi ve edinilmesi için bir yaklaşım tanımladık.

Genetik Olarak Hedeflenmiş Retinal Hücre Popülasyonlarının Seyrek Adeno İlişkili Virüs Etiketlemesi Kullanılarak Nöronal Arborizasyonun Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Burada, aksonal taşıma üzerindeki patolojik protein kaynaklı etkileri analiz etmek ve bu etkilere aracılık eden mekanik yolları belirlemek için primer hipokampal kemirgen nöronlarının transfeksiyonunun canlı hücre konfokal görüntüleme ile nasıl birleştirileceğini gösteriyoruz.

Primer hipokampal nöronlarda patolojik proteinlerin aksonal taşıma üzerindeki etkilerini ölçmek için canlı hücre görüntülemenin kullanılması

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Öğrenin BDNF'nin retrograd aksonal taşımacılığını mikroakışkan odacıklar ve kuantum nokta etiketleme kullanarak canlı görüntüleme ile izlemeyi. Bu yöntem nöron sağlığı ve nörodejeneratif hastalıkların anlaşılmasına katkı sağlar.

Quantum Akson Ulaştırma Gerçek zamanlı Görüntüleme İlköğretim Nöronlar BDNF Dot-etiketli

Daha fazla video keşfet